严重血脑屏障破坏和周围组织损伤

摘要

简介

微血管对缺血的病理反应在梗死的演变中起着重要作用；缺血后的一个关键事件是血脑屏障（BBB）的破坏¹脑梗死和出血性转化的前因事件²对血管、胶质细胞和神经元之间相互作用的认识提高了对梗死机制的理解^三并且已经开始部分解释以前神经保护疗法的失败。与对神经血管和神经胶质血管单位的新认识平行，初步数据表明血清成分（如凝血酶和纤溶酶原）具有直接细胞毒性⁴此外，由于膨胀压力的变化，进水也会产生有毒影响。然而，事件的顺序是复杂的，因为这些相同的化合物也可能出现从头开始损伤的实质或内皮。传统的血脑屏障渗漏研究依赖于水流量（水肿）的简单测量、小分子量标记物（IgG或标记有Evan’s Blue的白蛋白）的渗漏，或内皮细胞非常复杂且昂贵的超微结构成像，因此，很难完全描述严重血管破裂后损伤的病理-解剖学机制，也很难将水肿（水移位）的影响与其他假定的有毒分子分开。这些研究的进一步进展受到以下限制：1）缺乏关于BBB向不同大小标记物泄漏的时间过程的数据；2） 缺乏一种简单、可靠的严重血管破裂标志物；和3）定量测量严重血管破裂后随时间的渗漏。我们试图用高分子量右旋糖酐-FITC通过荧光、免疫组织化学和超微结构确认来表征严重的血管破裂，然后将这种血管破裂与组织损伤的证据进行比较。

方法

所有方案均由圣地亚哥退伍军人事务医疗中心动物研究委员会和加州大学圣地亚哥分校IACUC根据所有国家实验动物护理指南批准。（n=71）名受试者为成年雄性Sprague-Dawley大鼠（加利福尼亚州圣地亚哥哈兰市），平均体重300克。所有动物均接受尾静脉注射异硫氰酸荧光素（FITC）与高分子量右旋糖酐（2 MDa；Sigma）偶联；手术开始时，例如大脑中动脉闭塞前约20分钟，在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入0.3 ml 5%（w/v）溶液。在闭塞和再灌注期间，受试者被允许从麻醉中苏醒，以便使用已公布的啮齿动物神经分级系统的二分版本进行神经检查^5,6为了确保MCAo充分缺血，只使用3种行为体征异常的动物，否则将受试者排除在进一步分析之外。动物也被排除在死后解剖发现的蛛网膜下腔出血之外。

我们使用了大脑中动脉丝状阻塞的标准模型^{5 7}简单地说，用异氟醚麻醉诱导动物，并用4%异氟醚在氧气中的混合物：氧化亚氮30:70通过面罩维持。在充分麻醉和无菌准备后，在颈部切开，露出左颈总动脉。用4-0丝线结扎颈外动脉和翼腭动脉。在颈总动脉壁上做一个切口，然后用4-0尼龙缝合线（Ethicon，Piscataway，NJ）缝合，缝合线在微型模具中变钝（Narishige MF83，NY）；使用显微镜和图像分析测量灯丝直径，仅选择290至310µm之间的灯丝供进一步使用。缝合线从颈外动脉和颈内动脉的分叉点向前推进17.5mm，从而阻塞了MCA的开口。在再灌注期结束时，用过量的戊巴比妥对大鼠实施安乐死，然后用200至300ml生理盐水心内灌注，然后用300ml 4%（w/v）多聚甲醛在PBS中灌注。

在快速从颅骨中取出后，将每个大脑固定在PBS中4%（w/v）多聚甲醛中，然后在30%蔗糖中冷冻，用冷冻滑动切片机获得50µm厚的切片。为了表征高分子量右旋糖酐-FITC的分布，从约-0.3个角作为锚定水平，通过包含约4.5 mm大脑的MCA区域前后轴的连续切片进行取样，并安装在玻璃载玻片上。切片用Pro-long Gold Antifade贴装剂覆盖（俄勒冈州尤金的Molecular Probes）。另一系列切片被滑动安装，以确定荧光素残留在缺血性纹状体中的区域共定位，并通过荧光翡翠C染色标记神经元变性（Chemicon，Temecula CA）。处理用于免疫细胞化学的切片，用于光镜检查，在抗体溶液中自由漂浮培养，内源性过氧化物酶在PBS中3%（v/v）过氧化氢中培养10分钟后熄灭。一级抗体（抗通用IgG、载体、Burlingame、Ca）在封闭稀释剂（磷酸盐缓冲盐（PBS）中稀释用10%（v/v）封闭血清和0.2%（v/v）Triton X-100）涂抹2天，然后在封闭稀释剂中稀释的生物素化抗兔二级抗体中孵育4小时。通过在Cy5结合链霉亲和素中隔夜培养切片，可以观察到生物素化二级抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch）。荧光免疫染色切片安装在载玻片上，并用Pro-Long防褪色贴装剂（分子探针，尤金，俄勒冈州）盖住。对未经初级抗体处理的切片进行背景染色评估。

为了对中风后高分子量右旋糖酐-FITC进行超微结构定位，准备动物进行经心灌注，并用林格液灌注，然后在PBS溶液中灌注4%多聚甲醛和0.1%戊二醛。大脑从颅骨中取出，在4%的缓冲多聚甲醛中固定过夜，然后在徕卡VT1000S切片机上切成100微米厚的薄片。通过用生物素化抗荧光素抗体（BA-0601，Vector，Burlingame Ca；1:1000稀释）培养切片1天，然后用二氨基联苯报告物（ABC试剂盒PK6100 Vector和DAB试剂盒SK4100 Vectors）进行过氧化物酶催化，观察结合荧光素。免疫染色的脑片在2.5%戊二醛中冰上固定15分钟，然后在1%四氧化锇中固定1小时，脱水，嵌入Durcupan中，在Reichert-Jung Ultracut E系统上以50nM的速度切片，并安装在镀铜网格上。

通过半自动图像分析对半球内残留高分子量右旋糖酐-FITC的荧光进行定量。用配备CCD摄像机的蔡司显微镜（KAF32MB；加利福尼亚州奥本市远地点）拍摄缺血半脑的数字图像。在MCA区域前后轴上以500µm的间隔获取图像。荧光定量使用Image Pro Plus（Cybermedia，Bethesda，MD）。在首次设置放大倍数并使用比例尺进行线性校准后，操作员在不知道受试者的组别或遮挡持续时间的情况下检查每个部分。操作员随后检查了每个部分，并设置亮度和对比度水平，以优化荧光的外观。使用半自动阈值、分割和大小过滤，操作员测量荧光的总面积。总荧光通常由每个截面上的多个离散“岛”组成，每个岛内有苍白的渗出标记区域与明亮的血管标记区域混合。使用岛的图像作为叠加，然后操作者重新阈值以强调包含在总荧光岛内的明亮物体，即标记的血管，并且再次使用分割和尺寸过滤，测量所有明亮血管的面积。通过从总面积荧光中减去血管中明亮荧光的面积来获得渗出面积。

为了量化单个切片上多个荧光标记的存在，我们采用了激光扫描技术。在经过CompuCyte™激光扫描细胞术（LSC）采集系统改装的奥林巴斯BX50显微镜上进行图像采集（马萨诸塞州剑桥）。用聚焦氩激光（488nm）照射组织，并通过530±30nm的发射过滤器收集荧光素荧光。用聚焦氦氖激光器（633nm）照射Cy5荧光，并通过675±50nm的发射滤波器收集荧光。在覆盖整个组织切片的20µm直径箱（扫描区域）上平均荧光。构建直方图以绘制ROI或“计数”，作为这些区域内综合荧光强度的函数。通过扫描截面非闭塞侧的子区域来确定背景，以获得背景信号分布的直方图。我们根据组织背景的最大水平保守地确定了“信号”阈值。数据表示为背景荧光强度以上检测到的扫描区域数除以扫描区域/截面的总数。在荧光免疫染色的情况下，采用类似的程序来量化与荧光素-葡聚糖保留位点配准的感兴趣的免疫染色区域。使用Wincyte™软件，从分为四个象限的散点图中确定具有双荧光信号（荧光素和Cy5）的计数百分比。

使用双光子激光扫描显微镜扫描和重建标记血管和溢出的荧光标记物。使用定制设计的双光子激光扫描显微镜获取光学切片图像的堆叠⁸使用MPScope软件⁹。我们使用了40×0.8 NA的浸水物镜（IR Achroplan，Carl Zeiss Inc，Oberkochen，Germany），0.4µm每像素横向采样，0.5µm每个平面轴向采样。在800nm处激发荧光素-异硫氰酸盐-dextran，并通过700nm以下发射光的低通滤波检测荧光。使用ImageJ软件程序执行图像旋转和投影操作。（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）。

根据上述高分子量右旋糖酐-FITC的免疫检测结果，选择塑料包埋块，并将其分为高或低渗漏区域。也从对侧半球的同源区域中选择阻滞物。经过上述处理后，在JEOL 1200EX显微镜上以5000倍的速度拍摄图像。检查人员对每张图像的原点区域盲视，然后在以血管为中心的图像上放置6×6网格（网格之间的间隔为2µm）。使用标准体视学技术¹⁰撞击膨胀的星形细胞食物过程或无结构空间的网格交叉点被视为“膨胀细胞”点。对于网格边界上对齐的点，只计算右侧和底部的点。为了使结果正常化，还计算了与内皮细胞面积（包括管腔空间）相对应的点。在每个视野中分别计数放大的异常线粒体。对点计数进行汇总，并将其标准化为包含空间，标准化为校准网格。

结果

短暂性MCA闭塞后血管破裂

短暂性MCAo导致循环高分子量右旋糖酐-FITC进入血管并渗出到实质，如图所示图1.其余组织切片没有荧光，因为生理盐水灌注在牺牲时去除了血管内右旋糖酐-FITC¹¹在较长的闭塞时间内，荧光的亚区域分布扩大，包括纹状体的更侧面(图1B). MCAo 8小时后皮质出现渗漏岛(图1C). 图像分析确定了显示血管壁标记和实质外渗的区域(图1D). 随着闭塞持续时间的增加，大脑中动脉供应区域的血管损伤增加，如积累的右旋糖酐FITC显著增加所示(图1E).

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图1

缺血性损伤后严重血管破裂

使用尼龙丝进行2小时（n=9）、4小时（n=9）或8小时（n=0.6）的瞬态MCAo，然后在去除尼龙丝后进行30分钟的再循环。通过对中顶叶皮层获得的50µm冠状切片进行阈值化和半自动定量，测量高分子量右旋糖酐-FITC荧光。（A）2小时短暂MCAo和30分钟再灌注导致MCA闭塞同侧内侧纹状体内高分子量右旋糖酐积聚。（B）封闭4小时导致标签保留更大，包括外侧纹状体，以及（C）8小时的闭塞导致整个纹状体和皮层的孤立区域受累。中所示的部分面板C在中再次显示面板D经过半自动化处理，包括阈值化、分割和可以量化的荧光区域中的对象描绘。中已处理视图的旁边面板D放大后，红色方框标记的区域显示荧光在血管中滞留，并渗入实质。（E）从前面到后面选择间隔500µm的连续冠状水平并进行量化。随着缺血持续时间的增加，MCA供应的纹状体和皮层中的高分子量右旋糖酐-FITC逐渐累积（时间的总体单向方差分析，p<0.0001）。注意皮质相对于纹状体的堆积延迟。

严重血管破裂区域的血管病理定位

为了证明图1是真正的血管外病变，我们使用双光子成像技术进行光学切片并重建标记血管和邻近的渗漏(图2). 表观荧光显微镜显示大量强荧光血管段(图2A)在脑缺血侧。在标记血管的子集中，模糊的荧光似乎也延伸到邻近的薄壁组织中(图2B). 在双光子最大投影中(图2C和D)强烈的血管荧光与血管壁有关。血管管腔清晰(图2D)与经心灌注固定标记血浆的有效冲洗相一致）。这表明大分子右旋糖酐-FITC可以高浓度滞留在缺血内皮细胞中，也可以从这些血管逃逸到周围的实质。将6只动物（n=6）静脉注射高分子量右旋糖酐-FITC，然后进行2或8小时的短暂MCA闭塞，然后再灌注30分钟。如方法所示，对中顶叶皮质切片进行处理以获得最佳超微结构可视化，并根据高分子量右旋糖酐-FITC标记模式选择三块组织，包括高右旋糖聚糖分布区、低右旋糖苷分布区和对侧部位(图3). 为了对结合的荧光素-dextran的超微结构沉积进行成像，组织与抗荧光素抗体反应，并转化为二氨基联苯胺（DAB），一种电子密度反应产物。用DAB标记的缺血血管通过组成内皮细胞中的电子密度细胞质标记进行区分。这些标记的内皮细胞通常肿胀(图3C). 低渗缺血区或对侧血管内皮细胞未见明显增大。(图3D和E). 我们使用体视学分析量化用高分子量右旋糖酐-FITC标记的血管破裂周围组织的超微结构变化(图4). 与对照侧相比，闭塞侧的内皮细胞总面积（包括管腔）略有减少，这与水肿压迫一致（数据未显示），但在高渗漏区域，内皮细胞面积与管腔的比例显著增加，与低渗漏或对侧区域相比(图4C，p<0.001，单因素方差分析，Tukey事后检验。）我们发现肿胀的线粒体和星形胶质细胞密度显著增加，空洞表明严重水肿(图4C). 在高渗漏区域，星形细胞终末足和无结构间隙的平均面积显著增大，与细胞毒性水肿的肿胀相一致，而高分子量右旋糖酐-FITC信号量较低的区域，或对侧相应的亚区（p<0.001，单向方差分析，Tukey事后检验）。用高分子量右旋糖酐-FITC标记血管时发现大量线粒体肿胀(图4C，p<0.001，单因素方差分析，Tukey事后检验）。

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图2

高分子量右旋糖酐-FITC定位于血管壁和外渗

在严重缺血的脑区测量高分子量右旋糖酐-FITC的外渗。（A）大鼠大脑中动脉闭塞4小时切片的表观荧光图像显示血管标记和外渗，如图图1.（B）用FITC-葡聚糖鉴定的血管和周围组织外渗的显微照片。（C）使用双光子激光扫描显微镜（TPLSM）获得的（B）中所述区域的图像。在整个组织切片上拍摄图像堆栈，并将其作为所有帧的平均值进行轴向投影。在图像右下角的大血管和小分支中都可以明显地摄取高分子量右旋糖酐-FITC。在图像的左下象限可以看到右旋-FITC漏入实质。（D）TPLSM图像堆栈高亮区域的侧面投影，如（C）所示。血管横截面显示一个中空的血管腔。投影是4µm的平均值，跨越组织切片的整个轴向范围，确保血管左侧的荧光是由泄漏引起的，可能是来自成像血管。

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图3

高分子量右旋糖酐-FITC的超微结构定位

荧光定位（A）通过反FITC和DAB拍摄的二级记者确认（B）利用FITC荧光对振动切片进行分析，我们从右旋糖酐高积累区、低积累区和对侧同源切片中选择区块。5000倍放大镜下的超微结构检查显示，高葡聚糖荧光区域的内皮细胞有明显的血管标记（C）在低葡聚糖荧光区域标记更少（D）或对侧（E）所选感兴趣区域的高倍视图如所示C类*,D类*和E类*分别是。图C*显示了内皮细胞中的标签和细胞膜的一些粗大穿孔。

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图4

血管破裂和细胞毒性水肿导致高分子量右旋糖酐泄漏区域

使用右旋糖酐高或低积累区域的组织块和选择的对侧同源切片（n=6），如图2，我们检测了50纳米厚的连续切片。使用无偏体视学计数网格，我们估计了内皮细胞和星形胶质细胞的面积，以及可能代表水积聚的“无特征空隙”的面积。我们还通过肉眼观察发现线粒体肿胀，线粒体的大小是对侧区域线粒体的两倍或更大。注意，在荧光高分子量右旋糖酐显著积累的区域（A）有极度肿胀的星形胶质细胞（Astr）和线粒体（mit）。此外，与对侧相比，内皮细胞（EC）的细胞质大大膨胀（B）或低右旋糖酐区域（未图示）。138个截面的平均结果汇总为（C）。由于水肿引起的细胞质肿胀和管腔压迫的相反影响，内皮细胞总面积（包括管腔）在高和低右旋糖酐积聚区域之间大致相当，两者都略小于对侧（数据未显示）。内皮细胞面积与管腔面积之比(C左面板)与低漏区和对侧漏区相比，高漏区明显存在细胞毒性水肿和管腔压迫（ANOVA p<0.001，Tukey检验用于事后比较）。增加的高分子量右旋糖酐-FITC的积累与星形胶质细胞肿胀显著相关(C中间面板，方差分析p<0.0001；使用Tukey检验进行事后比较，所有成对比较都是显著的，p<0.01）。类似地，每个领域肿胀的线粒体数量随着右旋糖酐积累的增加而增加(C右侧面板，方差分析p<0.0001；使用Tukey检验进行事后比较，所有成对比较均显著，p<0.01）

严重血管破裂区域的组织损伤定位

我们使用多种方法证明了与严重血管破裂区域相关的组织损伤。在11只封堵时间可变、再灌注至封堵开始24小时的动物中，高分子量右旋糖酐-FITC渗漏面积与2,3,5-三苯基四氮唑（TTC）染色标记的组织损伤体积密切相关(图5，相关系数r=0.75，r²=0.56，p<0.05）。在10只动物的高分子量右旋糖酐-FITC渗漏区域也观察到用Fluoro Jade标记的神经元变性(图6，r=0.86，r²=0.75，p<0.05）。这些发现共同确立了高分子量右旋糖酐-FITC渗漏有助于识别严重血管破裂和缺血性组织损伤的区域。

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图5

大分子右旋糖酐-FITC在严重组织损伤区域的蓄积

将血管破裂与不同缺血持续时间（2小时，n=4；3小时，n=5；4小时，n=1；每个时间点用不同的符号标记）后的组织损伤进行比较。高分子右旋糖酐-FITC在MCAo前给药，并在牺牲前再次给药。在24小时再灌注和牺牲后，大脑立即在TTC中进行处理，以可视化细胞损伤区域并拍照。然后固定切片，成像，并在荧光光学下拍照。使用加扰标识符标记TTC和荧光图像。一名考官使用校准的平面测量法追踪TTC苍白的区域，然后以掩盖的方式追踪荧光区域。在揭盲后，将测量结果联系起来并进行比较。散点图显示了10个数据对。TTC苍白与高分子量右旋糖酐-FTIC的积累有显著相关性（Pearson r=0.75，p=0.05，r²=0.56).

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图6

高分子量右旋糖酐-FITC积聚区域的显著细胞病理学结果

在同侧半球（A）和对侧（B）对于MCAo，我们比较了细胞毒性损伤的程度（使用细胞损伤标记物Fluoro-Jade）和同侧大分子右旋糖酐-FITC的蓄积面积（C）和对侧（D）半球。经高倍镜检查（插图A），Fluoro-Jade明确定位于类似神经元的细胞体，但没有使用细胞特异性标记来区分神经元和星形胶质细胞。如中所示图5，一名检查人员追踪了氟玉吸收的区域，并以遮蔽的方式独立追踪了右旋糖酐积累的区域（n=10只动物，每只动物2至3个切片，缺血持续时间1小时，n=3；2小时，n:3；8小时，n=4；每个时间点用不同的符号标记）。在揭开盲和连接测量值后，渗漏标记物与细胞病理学之间存在高度显著的关系（Pearson r=0.86，p<0.05，r²=0.75)

血脑屏障泄漏区域超过严重血管破裂区域

为了确定用高分子量右旋糖酐-FITC标记的血管破坏是否仅用于识别血脑屏障渗漏区域（这可能是可逆的），我们比较了20只动物的IgG渗漏与血管破坏的分布(图7). 我们发现，在MCA闭塞的多个持续时间内，与严重血管破裂的区域相比，IgG标记的血脑屏障渗漏之间存在显著的分离(图7，单向方差分析p<0.001，Tukey的事后检验）。在所有闭塞时间内，血脑屏障渗漏面积大大超过血管破裂面积。在闭塞4小时时，血脑屏障渗漏达到最大程度，但相比之下，严重血管破裂的时间进程较慢，在我们研究的最长持续时间8小时时出现最大渗漏。

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图7

血管破裂发生在BBB泄漏的较大区域

在1小时（n=4）、2小时（n=2）、4小时（n/5）或8小时（n/6）MCAo后再灌注30分钟，我们使用双标记荧光显微镜测量图像中IgG和高分子量右旋糖酐的数量。荧光用激光扫描显微镜定量，每个通道中的计数归一化为截面中的总计数。（A）在一个典型的例子中，IgG泄漏（Cy5通道）似乎更均匀，且不局限于血管。（B）使用FITC通道对同一节段进行成像，显示出更加异质的血管外观和定位。星号放在脑室中以演示图像配准。IgG泄漏的高倍视图（C）和高分子量右旋糖酐泄漏（D）确定右旋糖酐的血管定位；箭头指向IgG显著滞留的血管，以及更为异质的右旋糖酐-FITC。显示了每个遮挡持续时间的具有标准误差的平均比例（E）在所有时间点，显示IgG泄漏（Cy5）的计数比例超过了显示右旋糖酐泄漏（FITC）的比例（独立样本t检验，Bonferroni校正后p<0.05）。IgG的泄漏似乎在4小时MCAo时达到最大值，但右旋糖酐的泄漏在8小时内的每个时间点似乎都在增加（时间的单向方差分析，右旋糖苷的p<0.001）。

讨论

我们的数据表明，严重的血管破裂允许高分子量右旋糖酐-FITC在MCA闭塞后发生缺血的脑区通过，这与时间相关且最大(图1,图2、和图3)¹²随着缺血持续时间的延长，高分子量右旋糖酐-FITC标签在基底膜破裂、内皮细胞和星形细胞肿胀的区域积聚更高浓度，最终导致血管完全穿孔(图3和图4). 此外，随着血管破裂程度的增加，相关组织损伤的程度也相应增加(图4,图5、和图6). 该标签可用于识别脑缺血发作后一小时内发生严重血管破裂的区域(图7). 这表明，血管闭塞后遭受最严重缺血性损伤的大脑区域可以通过简单的静脉注射廉价的荧光标记物轻松标记。如所示图3，该标记的存在可用于选择正在经历显著血管破裂和组织损伤的组织，以进行进一步的详细研究。据我们所知，这是第一个简单的严重组织损伤标记物，可在缺血发作后1小时内轻松重复使用。我们使用高分子量右旋糖酐FITC渗漏来证明水通道蛋白4受体在严重血管破坏区域的显著下调，进一步支持严重血管破坏和组织损伤之间的关系¹³.

缺血性血管系统中BBB功能的丧失已被广泛研究，并已用多种可量化的示踪剂（包括同位素标记的蛋白质和氨基酸）证实^14–18，同位素标记的蔗糖¹⁹，荧光示踪剂^20–22和MRI对比剂²³通常，根据平均容器泄漏量进行量化。本研究中观察到的泄漏增加的时间过程与以前的分光光度法观察到的一致²¹此外，我们结果的总体区域特异性与MRI观察到的BBB低分辨率空间模式一致，这表明成年大鼠腹侧纹状体的早期对比增强（闭塞2.5小时）²³.

尽管对超微结构进行了检查，但我们的数据并未明确确定高分子量右旋糖酐泄漏的机制(图3和图4)提示细胞转染增加和细胞粗大穿孔都参与其中。使用类似的方法，发现小分子量白蛋白的泄漏先于大分子量右旋糖酐的泄漏，并且表现出更广泛的染色¹²大量文献论述了通过内皮细胞之间紧密连接的松动而导致较小分子量分子的泄漏，但对跨细胞作用和跨膜蒸发的作用存在争议^24–26我们的数据没有涉及紧密连接松动在高分子量右旋糖酐渗漏机制中的作用，而是涉及血管缺血的时间进程和空间分布，如高分子量右旋糖酐FITC摄取所证明的，与实验性大血管闭塞后BBB破裂的分子事件相一致²⁷BBB结构分子的蛋白质分解¹⁹是缺血性损伤后1至2小时内发生的早期事件^19,27–31对其他神经室分子变化的免疫细胞化学成像研究表明，它们也以空间异质性的方式发生^32,33，形成蛋白质表达改变的“岛”，这被认为是缺血性纹状体和皮层的小梗死。严重血管破裂的时间和空间发展(图1)似乎与这些有充分记录的分子事件相吻合，虽然我们的数据不允许我们确认一个机械联系，但我们在这里介绍的技术将大大促进未来的这种机械研究。

我们的研究有一些局限性。直接检测高分子量右旋糖酐-FITC，无需扩增；其他标记物，包括低分子量标记物IgG，在抗体标记后检测，可以放大信号。IgG渗漏与高分子量右旋糖酐渗漏的差异程度(图7)可能超过了可能的放大步骤，但我们的数据不能排除这种影响。组织损伤标记物，如TTC排除和Fluoro-Jade摄取，虽然在该领域是标准的，但并不等同于细胞死亡，也不能区分坏死和凋亡细胞死亡机制。事实上，我们不能断言，高分子量右旋糖酐-FITC确定的严重血管破裂标志着大脑中遭受不可逆缺血损伤的区域，而这些区域必然会成为梗死，尽管很难相信这些区域会表现出如此严重的损伤(图3和图4)可以恢复。需要进一步研究，以1）表明这些标记区域不具备恢复能力；2） 确定严重血管破裂的机制；3）确定抑制严重血管破裂的保护剂是否也能阻止相关组织损伤。另一个限制是我们用于选择超微结构切片的相对偏倚的取样策略。一方面，纯粹的随机抽样策略将是无偏见的，并可能使人们能够确定是否仅在高分子量右旋糖酐泄漏量最大的区域发现严重血管破裂的证据。另一方面，由于成本和时间原因，这种抽样策略很难实现。为了克服这种选择偏差，以半盲的方式审查了所有章节。换句话说，在双标签实验中，使用一个标签从所有部分采集图像，然后进行置乱，然后使用第二个标签对所有部分进行重新成像。同样，在平面和点数评估中，研究人员检查了一个标签的所有部分，然后在对未识别的部分进行置乱后，使用另一个标签审查了所有部分。考虑到这些局限性，我们使用了多种互补的成像技术，这一事实支持了高分子量右旋糖酐泄漏发生在血管破裂和组织损伤区域的论点，所有这些技术都清楚地显示出相同的高度统计显著的关系。我们特别假设右旋糖酐渗漏较多的区域会发生血管破裂和组织损伤，我们的数据直接支持这一假设(图5和图6).

我们已经证明，在发生明显梗死之前，一种简单、廉价、静脉注射标记物-高分子量右旋糖酐-FITC可对经历严重血管破裂和相关组织损伤的脑区进行再生产性标记。MCAo后，已知脑缺血程度最高的区域标记量最大，缺血持续时间延长导致标记量增加。通过提供一种简单的方法，在缺血开始后一小时内识别严重受损的组织，该标记将有助于进一步研究血管损伤的机制以及血管、神经胶质和神经细胞损伤机制之间的关系。

致谢

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