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Biochim生物物理学报。作者手稿；PMC 2011年2月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Biochim生物物理学报。2010年2月；1800(2): 181.
2009年7月16日在线发布。 数字对象标识：10.1016/j.bbagen.2009.07.005
预防性维修识别码：项目经理2815258
NIHMSID公司：NIHMS133007标准
PMID：19616076

半乳糖凝集素-3在细胞核和细胞质中的动力学

凯文·豪德克,1 金伯利·斯普龙克,2 帕特里夏·G·沃斯,1 罗纳德·帕特森,三 约翰·L·王,1,*和埃里克·阿诺伊斯2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

这篇综述总结了半乳糖凝集素-3（Gal3）的部分研究，作为细胞细胞质和细胞核中碳水化合物结合蛋白动态行为的一个例子。在15个成员的半乳糖凝集素蛋白家族中，Gal3（M第页~30000）是嵌合体亚类的唯一代表，其中富含脯氨酸和甘氨酸的NH2-末端结构域融合到负责结合含半乳糖糖复合物的COOH末端碳水化合物识别结构域上。蛋白质在细胞质和细胞核之间穿梭，基于导入蛋白识别的靶向信号进行核定位，导出蛋白1（CRM1）识别的靶信号进行核输出。根据电池类型、特定实验条件在体外或组织定位，Gal3已被报道为纯细胞质，主要为核，或分布在两个隔室之间。因此，蛋白质的核质分布必须反映出核质输入和输出之间的平衡，以及细胞质锚定或与核成分结合的机制。事实上，在细胞质和细胞核中已经报道了Gal3的一些配体。然而，大多数配体似乎通过蛋白质相互作用而不是通过蛋白质-碳水化合物识别来结合Gal3。例如，在细胞质中，Gal3与凋亡抑制因子Bcl-2相互作用，这种相互作用可能参与Gal3的抗凋亡活性。在细胞核中，Gal3是必需的前mRNA剪接因子；该蛋白通过与U1小核核糖核蛋白（snRNP）复合物结合而并入剪接体。尽管大多数这些相互作用是通过Gal3的碳水化合物识别域发生的，而糖配体（如乳糖）可以干扰其中一些相互作用，但蛋白质的碳水化合物结合活性的重要性，就其本身而言，仍然是未来调查的挑战。

关键词：碳水化合物结合蛋白、凝集素、核质转运

1.简介

半乳糖凝集素-3（Gal3）属于一个广泛分布的蛋白质家族，它：（a）与含有β-半乳糖苷的糖复合物结合；和（b）在多肽的碳水化合物识别域（CRD）中包含特征氨基酸序列[1]. 该蛋白质由单一多肽（M第页约30000），其氨基酸序列表明它是两个不同结构域的嵌合体：NH2-含有富含脯氨酸和甘氨酸基序重复的末端结构域和显示与半乳糖凝集素家族其他成员相应CRD序列相似的COOH末端CRD[1,2]. X射线晶体学显示，每个CRD约130个氨基酸含有与碳水化合物相互作用的高度保守的氨基酸残基[三].

纯化Gal3的碳水化合物结合特异性已被广泛研究[2]. 该蛋白结合1型或2型Galβ1→3（4）GlcNAc链，并且对直链聚氨基乳糖结构或复杂型支链聚糖的亲和力比简单的二糖增加。岩藻糖基化（H-type 1或H-type 2）或唾液酸化，或在乳糖胺单元的末端半乳糖残基上被（α1→3）连接的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺进一步取代，并不影响结合，而倒数第二个N-乙酰氨基葡萄糖残基的取代大大降低了结合。利用等温微量热法，对Gal3与一系列糖配体的结合进行热力学分析，得出K的顺序如下d日值：（a）乳糖（Lac）~900μM；（b） 硫代二半乳糖苷（TDG）~550μM；（c） N-乙酰乳糖胺（LacNAc）~150μM；和（d）血型A四糖，~60μM[4]. 其他物理化学测量，例如使用放射性Lac作为糖配体的平衡透析或使用相同系列碳水化合物的荧光偏振分析，通常会得到Kd日值低5-10倍，尽管相对亲和力基本相同[5-8].

自Gal3最初根据碳水化合物结合活性进行分离以来，已有大量的现象学观察报告[9,10]. 大量研究的部分原因至少与Gal3表现出不同范围的亚细胞定位和分子相互作用有关。首先，Gal3（以及galectin家族的其他几个成员）表现出显著的双重定位现象[11]，存在于细胞内和细胞外的隔室中[12,13]. 外化机制似乎并不常见，因为Gal3的氨基酸序列没有显示明显的信号序列，可以将多肽引导到经典的内膜途径中进行分泌[13]. 在没有任何还原剂的情况下，可以分别从人WiL-2细胞、大鼠嗜碱性白血病细胞和小鼠3T3成纤维细胞中分离出人、大鼠和小鼠Gal3[14]. 从大鼠和小鼠cDNA构建物中表达的纯化重组蛋白不需要硫醇等还原剂来维持碳水化合物结合活性[14,15]. 因此，Gal3似乎不像细胞外室那样对氧化失活敏感。然而，NH2-从细胞提取物中分离出的多肽的末端被乙酰化阻断[16]在大多数研究的细胞类型中，Gal3主要作为细胞内蛋白。

其次，细胞内Gal3定位于细胞核和细胞质。据报道，根据细胞类型和特定实验条件，该蛋白质仅为/主要为细胞质[17,18]，主要是核能[17,19]或分布在两个亚细胞隔室之间。最后，即使在细胞核内，Gal3也可以在核质中扩散发现，并与许多离散的点状结构相关[20,21]. 后者可能对应于具有不同超微结构特征或光学显微镜下特定标记蛋白的亚核结构域：染色质颗粒簇、斑点、Cajal小体等[22,23].

根据这些观察结果，Gal3的定位、转运以及与不同亚细胞成分的结合似乎受到了精细的调控机制。在这期关于核质糖基化的特刊中，似乎应该回顾一下对核和细胞质中碳水化合物结合蛋白的动力学行为有新见解的研究。以Gal3为范例，将讨论控制其核质分布的条件、核进出口的信号、与大分子复合物的联系和分离以及亚核结构域。

2.核质分布与细胞质分布

2.1不同实验条件下的细胞内分布

已报道了大量关于Gal3核质分布的观察结果，将细胞特定隔室中蛋白质的存在或缺失与各种参数相关，如研究中的细胞来源、特定细胞类型、培养条件、细胞/培养物的增殖状态、，或肿瘤转化。例如，据报道，小鼠腹腔巨噬细胞适应在体外培养降低Gal3的核含量[24]. 也有研究表明，与正常宿主相比，来自肿瘤宿主的巨噬细胞中的核Gal3升高[25]. 小鼠静止T淋巴细胞表达少量/无Gal3，但在有丝分裂原激活的CD4中诱导高水平表达+和CD8+T细胞。该蛋白主要存在于细胞内的隔室：细胞核、胞浆和含膜部分[26].

在仓鼠幼肾（BHK）和Madin-Darby犬肾（MDCK）中，间接免疫荧光显微镜检测到Gal3为细胞质[17,27,28]. Gal3在MDCK细胞中的唯一细胞质定位可能很难解释，因为皂苷是用来渗透细胞进行抗体染色的[28]. 皂苷和洋地黄素属于同一类药物，它们可以选择性地渗透富含胆固醇的质膜，而不允许抗体接触细胞核中的抗原，包括半乳糖凝集素[29]. 另一方面，BHK细胞研究中使用的渗透剂（-20°C下的甲醇或triton X-100）确实能有效地渗透核膜，因此，如果抗体试剂存在于细胞核中，则可以完全接触到Gal3[17,27]. 此外，对于内源性Gal3以及在用编码仓鼠多肽的cDNA构建体转染的相同细胞中过表达的蛋白质，都观察到了独特的细胞质定位。

另一方面，同一cDNA在Cos-7细胞或兔平滑肌Rb-1细胞中的过度表达导致了主要的核定位[17]. Gal3核与细胞质分布的这种细胞类型差异可能反映出存在或不存在相互作用的伙伴，该伙伴要么具有强大的核输出信号（NES），要么将其与细胞室特异性锚栓相连。事实上，有报道称，当两种蛋白共同转染到HeLa细胞中时，转录调控因子Sufu（融合抑制因子）与Gal3相互作用，并可以改变后者的核质分布[30].

在成纤维细胞中，蛋白质的核质分布似乎取决于所分析细胞的增殖状态。在静态培养（血清缺乏或密度抑制）中，Gal3主要是细胞质；相同细胞的增殖培养物显示出强烈的核染色[19]. 并行核径流转录分析和Northern印迹法检测mRNA积累水平表明，Gal3是一个即刻早期基因，其激活依赖于静止成纤维细胞的血清刺激，而不依赖于从头开始蛋白质合成[31]. 人类二倍体成纤维细胞在受到在体外文化。虽然在年轻增殖细胞的细胞核和细胞质中都可以发现Gal3，但在失去复制能力的衰老人类成纤维细胞中，该蛋白主要是细胞质[18,32].

2.2肿瘤标本与细胞系的相关性观察

关于Gal3在癌症中的表达，在肿瘤样本和癌细胞株上都有大量已发表的数据。然而，现象学观察发现，不同恶性肿瘤的结果有很大差异：Gal3在甲状腺癌、肝癌、胃癌和中枢神经系统癌中表达上调，而在乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和前列腺癌中表达下调（见[33-35]). 在当前讨论的背景下，关注的是那些报告某些类型癌症细胞内分布改变的研究。

Gal3的表达及其在细胞内的分布沿人类结肠上皮的隐-面轴变化。蛋白质集中在分化的结肠上皮细胞的细胞核中。从正常粘膜到腺瘤再到癌的进展特点是腺瘤和癌细胞的细胞核中显著缺乏Gal3[36]. 随后的一项研究证实了Gal3在正常结肠粘膜中的核定位，但后者的研究者发现腺瘤中细胞质池下调，癌中上调[37].

在肿瘤进展过程中，Gal3的核定位向细胞质室转移的一般趋势也被报道用于舌和前列腺癌。采用免疫组织化学方法，对77例舌标本（54例鳞状细胞癌和23例正常粘膜标本）进行了调查，结果表明，在从正常状态向癌变状态发展的过程中，细胞核Gal3水平下降。同时，细胞质表达增加。在此基础上，有人认为在肿瘤进展过程中观察到的Gal3的核-细胞质易位可能是舌癌患者的预后因素[38]. 对145例前列腺癌样本的类似调查显示，Gal3通常不表达或与正常腺体相比减少。当在癌细胞中检测到Gal3时，它一直被排除在细胞核之外，只存在于细胞质中[39]. LNCaP是一种Gal3阴性的人前列腺癌细胞系，通过构建物转染，在细胞核或主要在胞浆中表达Gal3。以Gal3细胞质定位为主的细胞表现出Matrigel侵袭增加、凤尾鱼非依赖性生长和体内肿瘤生长和血管生成，而具有Gal3核定位的细胞以相反的方式影响这些参数[40].

与这些结果相反，正常大鼠甲状腺细胞系与Ki-ras癌基因的转化导致Gal3在细胞核内定位[41]. 同样，在一项对不同人类癌症细胞系的调查中，发现Gal3在乳头状癌细胞核中的表达最大。Gal3直接与甲状腺特异性转录因子TTF-1相互作用，上调其转录活性，从而促进甲状腺细胞的增殖。核Gal3和TTF-1的同时表达与较差的临床结局相关[42].

3.核质转运

3.1 Gal3在细胞核和细胞质之间穿梭

核质穿梭通常被定义为蛋白质在核孔复合体中的重复双向运动。根据这个标准，Gal3在细胞核和细胞质之间穿梭[43]. 将人成纤维细胞与小鼠成纤维细胞融合，并使用单克隆抗体NCL-Gal3监测人Gal3在异源双核体中的定位，该单克隆抗体可识别人类Gal3，但不能识别小鼠同源物[44]. 人Gal3蛋白在很大比例的异双核体中定位于两个细胞核。添加抗生素钩端霉素B（LMB）可以抑制Gal3的核输出（见下文），降低了两个核中显示人类Gal3的异二卡龙的百分比。这些结果表明，Gal3可以离开一个核，穿过细胞质，进入第二个核，符合穿梭的定义。

使用流体动力学方法，如凝胶过滤[45]以及平衡沉降等热力学方法[46]，大多数纯化Gal3溶液分子量的测量值为~30000，表明多肽主要以单体形式存在于溶液中。虽然这一尺寸可由核孔复合体的水通道调节（排除极限为40-60 kDa），但上述关于Gal3分隔的研究表明，被动扩散不太可能是隔间间的移位方式。因此，观察到Gal3在一组条件下以核定位为主，而在不同的条件下以细胞质定位为主，这意味着存在一种特定的、受调控的转运方式。

此外，通过光漂白后的荧光恢复（FRAP）进行测量，Gal3的核导入和导出速度同样快，半衰期取决于细胞类型（EJA，未发表的观察结果）。这些发现与Gal3的细胞核与细胞质分布一致，这表明核穿梭处于稳定状态，需要快速的核进口来抵消其快速的核出口（见下文）。

3.2核进口信号

早期的研究就核定位所必需的氨基酸残基提供了相互矛盾的信息。龚等. [47]据报道，人类Gal3的前11个残基控制其核输入。这一结论是基于Gal3氨基末端11个残基的缺失导致蛋白质完全从细胞核中排除的观察得出的。此外，将该氨基酸序列连接到绿色荧光蛋白（GFP）报告子上导致融合蛋白的核积累。与这些结果直接矛盾的是，高丁等. [17]据报道，仓鼠同源物残基1-103的缺失对截短蛋白的核定位没有影响。

最近的实验表明，Gal3多肽的COOH末端（最后28个氨基酸）对核定位很重要（参见图1，面板A）。首先，小鼠Gal3的GFP融合确定了一个包含254-257残基的区域，该区域是Gal3在小鼠3T3成纤维细胞中的核导入所必需的[48]. 对每一个残基I254、L256和T257进行丙氨酸扫描诱变会损害核输入，而对T255进行诱变则没有影响。一个三重突变体，I254A；L256A；T257A仅显示细胞质定位；这种效应不能通过添加LMB来逆转。该序列与在核定位活动中确定的IXLT基序一致果蝇属蛋白质Dsh[49]. 在整个蛋白质的上下文中，该序列位于Gal3多肽CRD中β片断的单链的开头(图1，面板B）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-133007-f0001.jpg

（A）Gal3多肽几种同源物的羧基末端28个氨基酸残基的氨基酸序列。蛋白质数据库的登录号如下：人（NP 002297）、小鼠（NP 034835）、长尾仓鼠（CAA55479）、挪威大鼠（NP 114020）、兔子（NP 001075807）、狗（P38486）、牛（NP 001095811）、鲑鱼（NP 001134305）、鸡（NP 999756）。序列通过Vector NTI（Invitrogen）检索和对齐。左图显示了与每个物种多肽上的位置相对应的残数。与核导入相关的保守残基，对应于人类序列中的R224和小鼠序列中的I-LT，以黑体字突出显示，富含疏水性的保守NES以黑色背景上的白色字母显示。柱面和序列下方的箭头将其与面板B所示CRD晶体结构中相应的单个α螺旋线以及S2和F1β链对齐。（B）显示Gal3人CRD多肽骨架三维结构的带状图（蛋白质数据库#2NN8[92])由PyMOL（W.L.DeLano，The PyMOL Molecular Graphics System，DeLano Scientific LLC，Palo Alto，CA，USA）生成。http://www.pymol.org). 构成β夹芯的两个β板的绞线标记为F1-F5（五股板）和S1-S6（六股板）。确定对核进口至关重要的残留物用填空表示法显示，并根据人类序列进行编号。

IXLT基序在其他哺乳动物的Gal3序列中保守(图1，面板A）。在最初命名galectins的提案中[1]，一致同意将半乳糖凝集素编号系统限制在哺乳动物物种，因为尽管由于氨基酸序列的巨大保守性，在不同的哺乳动物中很容易识别相同的半乳糖凝集素，要推断特定哺乳动物的半乳糖凝集素与低等脊椎动物和无脊椎动物中的半乳糖苷凝集素之间的关系要困难得多。然而，我们在图1A：显示的鲑鱼和鸡肉序列都含有富含脯氨酸和甘氨酸的NH2-Gal3的末端结构域特征，并且这两个序列在蛋白质数据库中被鉴定为“半乳糖凝集素-3”。因此，尽管氨基酸序列的其他部分存在差异，但鲑鱼和鸡肉的序列在我们感兴趣的区域中排列得很好(图1，面板A），可能具有类似的三维结构。这种共性使得这些氨基酸残基确实很重要的情况更加明显。类似的考虑也适用于在多肽相同区域发现的富含亮氨酸的NES（见下文第3.3节）。

其次，利用GFP报告子融合到人类Gal3序列上进行后续研究。与用小鼠多肽获得的结果一致，据报道，人类序列的240-250残基（IXLT基序从240残基开始；参见图1，小组A）导致完全废除核本地化[50]. 因此，Gal3多肽的COOH末端对于靶向细胞核显然是至关重要的。

第三，Nakahara等. [51]在人Gal3的223-228（HRVKKL）残基中鉴定出一个序列(图1与许多核蛋白中发现的赖氨酸/精氨酸富集核定位信号（NLS）类似。删除HRVKKL序列导致完全失去核进口。Gal3-GFP融合蛋白序列的定点突变表明，只有R224位于CRD与IXLT基序相反的一侧（参见图1（B组），在Gal3核进口中起过任何作用。有趣的是，虽然Gal3主动转运到细胞核需要importin-α和importin-β，但Gal3仅与importin-a直接结合[51]. GST下拉分析表明，Gal3与importin-α1、importin/α3和importin-α5直接相互作用（按亲和力降低的顺序）；R224A突变消除了所有重要蛋白-α相互作用。通过RNAi敲除实验证实了对importin-β的需求，因为importin/β的缺失抑制了Gal3-GFP融合蛋白的核定位。

尽管普遍认为Gal3多肽的COOH末端部分对核定位至关重要，但尚不清楚的是：（a）NH的前11个残基缺失2-末端导致核定位丢失，11个残基序列与GFP融合使报告者定位于核[47]; 和（b）含有残基1-115的GFP融合蛋白定位于核室[50]. 涉及NH的结果2-末端NLS是混淆的，因为：（a）NH截短的多肽2-Gal3蛋白的末端（例如小鼠同源物的残基1-73或残基1-127的缺失）与内源性多肽一样保留了核定位[17,48]; 和（b）COOH末端10氨基酸的截短导致核定位丢失[48,50].

3.3核出口信号（NES）的识别

Gal3在细胞核和细胞质间穿梭的观察[43]这意味着一定有一种从细胞核输出蛋白质的机制。使用洋地黄素渗透细胞试验来探索这一过程[52]. 未固定的小鼠3T3成纤维细胞用洋地黄素进行渗透，洋地黄蛋白选择性地渗透富含胆固醇的质膜，同时保持核膜的完整性。通过免疫荧光和免疫印迹法监测细胞核和转运组分中Gal3的水平随时间的变化。该分析表明，Gal3以与温度相关的方式迅速从核中输出，在37°C和25°C下半衰期均不到5分钟，在4°C下几乎没有输出。

添加LMB导致Gal3在细胞核内滞留；低至3.8nM的LMB浓度抑制了Gal3的输出[52]. 因为LMB结合并抑制了exportin-1（CRM1）与富含亮氨酸的NES的相互作用，这一结果暗示了这种NES存在于Gal3多肽中。事实上，在小鼠Gal3的残基241-256中，在蛋白质的COOH末端可以发现富含亮氨酸的序列(图1，面板A）。这个推定的NES符合典型核输出序列Lx中疏水残基的间距2-3Lx（磅）2-3la Cour描述的LxL等。[53]在其他哺乳动物的Gal3中以及鲑鱼和鸡的“galectin-3”中保存(图1，面板A）。当假定的NES被插入pRev（1.4）-GFP载体时，NES缺陷变体可用于评估潜在的NES[54]，该蛋白表现出LMB敏感的核输出活性[55]. 此外，定点突变证实L248和I250是NES的两个关键残基。

在整个蛋白质的背景下，在CRD的疏水β-三明治基序中发现NES（残基241-256）(图1，面板B）。关键疏水残基L242和I245位于连接β-片两条链的α-螺旋中，残基L248和I250位于相邻的β-链中。NES残留物的侧链位于结构的同一面[55]. 这些特性符合富含亮氨酸的NES的计算研究所概述的参数[53].

在小鼠3T3成纤维细胞中，Gal3以两种等电变体存在：（a）pI8.7种，对应于非磷酸化多肽；和（b）pI8.2磷酸化衍生物[56]. 非磷酸化形式仅存在于细胞核中，而磷酸化Gal3则存在于细胞核和细胞质中。在使用洋地黄素渗透细胞系统进行的核输出分析中，发现只有磷酸化的Gal3被转运出细胞核[52]. 狗Gal3同源物的质谱分析确定残基6处的丝氨酸是磷酸化的主要位点体内，次要站点位于丝氨酸-12[57]. 作为对凋亡损伤的反应，磷酸化的Gal3从细胞核输出到细胞质，保护细胞免受药物诱导的凋亡[58]. 相反，S6A突变体不能被磷酸化，不能从细胞核输出，也不能保护细胞免受凋亡。因此，Gal3的磷酸化及其从细胞核向细胞质的输出对于蛋白质的关键生物活性似乎很重要。

4.细胞质和细胞核中的活性和配体

4.1关于Gal3配体的一般评论

除了运输受体importin-α和exportin-1外，还报道了许多与Gal3相互作用的其他蛋白质(表1). 在本篇关于细胞内Gal3动力学的文章中，对这些配体的一些一般性评论可能会有所启发。首先，尽管一些配体已被证明是特定于腔室的（例如富含半胱氨酸、组氨酸的蛋白质Chrp仅为细胞质[62])，其他配体似乎与Gal3在两个亚细胞区共存。此外，某些配体（例如Sufu转录调节器[30])可能会随着穿梭的Gal3分子在隔间之间移动。

表1

结合半乳糖凝集素-3的细胞内蛋白质

配体亚细胞的
隔间		Gal3域1碳水化合物
敏感2		直接或
间接		参考
Bcl-2型细胞质客户需求日对国家银行三59
β-连环蛋白细胞质和
核		CRD公司对直接的60
CBP70型核客户需求日对国家银行61
中国注册会计师协会细胞质CRD公司不直接的62,63
细胞角蛋白细胞质客户需求日对直接的64
杰明4细胞质和
核		客户需求日第4直接的65
hnRNP Q号核第第国家银行66
去核细胞质第第国家银行67
OCA-B公司细胞质CRD公司不直接的68
K-Ras公司细胞质和
质膜		第第国家银行69
苏福细胞质和
核		第第直接的30
连接蛋白细胞质和
线粒体		第第直接的70
TFII-I型核客户需求日对国家银行71
TTF-1型核第第直接的41
1结合配体所需的Gal3多肽部分。
2Gal3-配体相互作用对糖抑制的敏感性。
三因为检测相互作用的分析是使用细胞裂解物或亚细胞混合物而不是纯化蛋白进行的，因此不能排除桥接分子介导相互作用的可能性。
4nd，未确定。

其次，大多数配体列在表1通过蛋白质相互作用而非凝集素-碳水化合物识别结合Gal3。唯一的例外可能是细胞角蛋白，显示Gal3结合的末端α1,3N-乙酰氨基半乳糖残基[64]. 然而，尽管如此，应注意的是，负责与大多数所列配体相互作用的Gal3结构域是CRD，在许多情况下，Lac等糖配体可以干扰相互作用（例如凋亡抑制因子Bcl-2[59]). 有两种机制可以解释Lac如何破坏这些相互作用。一种可能性是Lac和蛋白质配体的结合位点重叠，糖的存在竞争性地抑制后者的结合。或者，糖配体与碳水化合物结合位点的结合导致构象变化，从而中断Gal3多肽与其他蛋白质的相互作用。根据核磁共振分析报告了Gal3的CRD中的构象变化[72]和差示扫描量热研究[15].

最后，许多配体与Gal3的相互作用已通过使用纯化蛋白质（例如Chrp[62]). 另一方面，也有其他配体（例如通用转录因子TFII-I[71])其与Gal3的关联可能是间接的，因为分析（例如联合免疫沉淀或谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉）是用细胞裂解物或亚细胞组分进行的。不能严格排除通过中间分子进行的中介作用。因此，在表1可能只是反映了用于记录相互作用的实验条件，而不是桥接分子的实际证据。

4.2. 细胞质中Gal3的选择性配体

Gal3具有抗细胞凋亡活性。体外表达Gal3的人T淋巴瘤Jurkat细胞在多种凋亡诱导剂作用下存活时间长于对照细胞[59]. 也有研究表明，Gal3抑制由细胞锚定丢失（anoikis）引起的凋亡[73]. Gal3与凋亡抑制因子Bcl-2相互作用，模拟Bcl-2家族成员形成异二聚体的能力。在顺铂诱导的BT549人乳腺癌细胞凋亡中，Gal3移位到线粒体膜，在那里它可以防止线粒体损伤、细胞色素c释放和凋亡小体活性[70]. 这种易位依赖于连接蛋白，一种钙和磷脂结合蛋白。通过酵母双杂交试验和GST下拉试验证明了Gal3和synexin之间的直接相互作用。Gal3还可能通过与细胞核相互作用负调控细胞凋亡，细胞核是细胞质中发现的一种新的促凋亡蛋白[67]. 因此，Bcl-2、nulling和synexin是Gal3的三个配体，与后者的细胞凋亡抑制活性有关。

四村等. [60]据报道，在人类乳腺癌细胞系BT-549中，β-catenin刺激细胞周期蛋白D1myc表达依赖于Gal3。Gal3结合β-catenin/Tcf并与复合物共定位于细胞核，诱导Wnt信号通路中的转录活性。使用纯化蛋白和GST下拉分析，记录了Gal3和β-连环蛋白之间的直接结合；Gal3和NH的CRD2-这种相互作用需要β-catenin的末端部分[60]. 最近的研究支持Gal3在稳定人结直肠癌细胞中β-catenin及其核聚积Wnt信号中的作用[74,75]. 然而，Gal3和β-catenin之间的直接相互作用受到质疑[75]. 据推测，Gal3介导糖原合成酶激酶-3β的AKT磷酸化，降低后者对β-catenin的活性。这反过来又稳定了细胞质中的β-连环蛋白，允许核积累和转录活性。

通过与Gli家族转录因子的相互作用，Sufu成为刺猬信号转导途径的负调控因子。以腐乳为诱饵的酵母双杂交筛选鉴定了Gal3作为一种潜在的相互作用蛋白[30]. GST-Sufu融合蛋白和放射性Gal3的GST下拉分析证实了这种直接相互作用。像Gal3一样，苏福穿梭于细胞质和细胞核之间。因此，Gal3可能在Sufu的核质分布中发挥作用，从而影响转录活性。

4.3细胞核中Gal3的选定配体

Gal3还可以更直接地调节转录活性。核甲状腺特异性转录因子TTF-1通过其同源结构域与Gal3相互作用[41]. 凝胶阻滞试验表明，这种相互作用刺激了TTF-1的DNA结合活性。据推测，Gal3可以通过这一机制上调TTF-1的转录活性，从而促进甲状腺细胞的增殖。

当HeLa细胞的核提取物（NE）被GST-Gal3吸附时，一种特异结合的蛋白被鉴定为通用转录因子TFII-I[71]. 这种相互作用需要CRD，而Lac和其他糖配体抑制了TFII-I的GST-Gal3下拉，而非结合性碳水化合物未能产生相同的效果。虽然TFII-I最初被确定为一种通用转录因子，但实际上已经在多种背景下进行了研究，因此同一多肽获得了许多不同的名称（参见参考文献[76]查看）。在前mRNA剪接中Gal3的活性方面（见下文），在大规模剪接复合体蛋白质组学筛选中，TFII-I被鉴定为剪接体相关蛋白，这一点特别有趣[77].

Gal3（和另一个家族成员galectin-1（Gal1））直接与Gemin4的羧基末端50个氨基酸相互作用[65]. Gemin4是运动神经元存活复合体（SMN）的成员，在细胞质中这些核糖核蛋白复合体（RNP）的正常生物发生中，将Sm蛋白组装到snRNAs上[78,79]. 然后，SMN复合体与snRNP一起进入核心，将其作为拼接机器的组件。Gemin4之所以如此命名，是因为它是定位于Cajal Bodies双子的SMN复合体的一个组成部分（根据细胞的不同，与Cajal Bodies重合或紧邻）[22,23,79]. Gal3与这种复合物的结合表明，它也可能定位于类似的亚核结构域。

事实上，早期的免疫荧光研究已经注意到，除了在核质中的弥散分布外，Gal3似乎被定位于一些被指定为斑点的离散点状结构[20]. 事实上，Gal3与作为剪接机制组成部分的其他两种蛋白质共同定位在这些斑点中：snRNP的Sm核心多肽和剪接因子的富含丝氨酸和精氨酸（SR）家族[29,80]. 在超微结构水平上，斑点结构与染色质间颗粒簇和染色质周原纤维相对应[81]. 染色质周原纤维很容易被短脉冲标记为[三H] 尿苷[82]这表明它们代表了mRNA合成位点的新生转录物和前mRNA处理的早期事件。超微结构水平的免疫金标记确实揭示了染色质周围纤维中的Gal3[21].

5.半乳糖凝集素-3与核糖核蛋白复合物的结合

5.1 Gal3与剪接体结合的动力学

现在已经积累了几行证据来证明Gal3和Gal1是在无细胞系统中检测到的参与前mRNA剪接的许多蛋白质中的两种[80,83]：（a）来源于HeLa细胞的NE，能够剪接前mRNA，含有Gal1和Gal3；（b） 通过Lac亲和层析或抗体吸附从NE中去除两种半乳糖凝集素，导致剪接活性的伴随损失；（c） 重组Gal1或重组Gal3都能在缺乏半乳糖凝集素的提取物中重建剪接；和（d）与Gal1和Gal3结合的高亲和力糖，如Lac和TDG，在添加到完整NE时抑制剪接反应，而非结合糖，如纤维二糖则没有任何作用。

这一发现表明，针对Gal3的抗体共同沉淀了所有mRNA物种（前mRNA、中间产物、产物mRNA和切除的落叶松）在体外剪接反应进一步支持Gal3是前mRNA剪接因子的结论[84]. 在时间进程免疫沉淀实验中，发现Gal3与剪接反应中出现的mRNA中间产物和产物相关，表明Gal3是整个剪接过程中剪接机制的组成部分。此外，关于Gal3和Gal1蛋白在剪接中的明显冗余功能，有一个有趣的观察。序列免疫沉淀方案的结果表明，Gal3和Gal1在剪接体中的存在是相互排斥的[84]. 因此，剪接体可以包含Gal3或Gal1多肽，但不能同时包含两者。这解释了为什么在体外不含Gal3的剪接反应几乎没有抑制作用，这也是为什么galectin可以在缺失galectin-的NE中重建剪接的原因[80].

确定Gal3在剪接体上的实际结合伙伴仍然是一个尚未解决的问题。如前所述，剪接体上Gal3蛋白伴侣的一个有希望的候选蛋白是通用转录因子TFII-I[71]. 虽然Gal3-TFII-I相互作用最初是在缺乏外源前体mRNA的NE中发现的，但同样的相互作用可能发生在剪接体的较大支架上(图2，左侧）。

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Gal3与snRNP和前mRNA剪接底物的关联图。前体mRNA在左侧显示为两个由单线内含子连接的矩形外显子。右侧显示了新发现的Gal3与剪接体外snRNP的关联。Gal3可以通过与U1 snRNP的结合在早期组装阶段进入剪接途径。此外，Gal3还与剪接体外部较大复合体中的多个snRNP结合。实心箭头表示累积实验数据支持的步骤；虚线箭头表示需要实验验证的假设Gal3参与。

5.2 Gal3与剪接体外RNP的关联

除了Gal3在前mRNA剪接中的作用外，也有迹象表明，在缺乏前mRNA的情况下，该蛋白与许多含有剪接因子的复合物相关。通过质谱分析，Gal3被鉴定为一个称为PCC（PSF-containing complex）的大复合物（~60S）的成员[85]. 除了含有PSF（嘧啶轨道结合蛋白（PTB）相关剪接因子）外，该PCC还含有与Gal3复合物中鉴定的许多其他蛋白质，如Gemin4、SMN和TFII-I[65,71]. 该PCC还与所有五个snRNAs在甘油梯度上共沉淀，并含有许多其他剪接体蛋白，如Sm核心蛋白、snRNP-特异蛋白和各种SR剪接因子[85]. 有趣的是，这种PCC可以在NE缺失的polyA RNA中形成，并且不包含几个必需的第二步剪接因子，这表明这种复合物不同于催化活性剪接体。综上所述，这些结果可能表明PCC在剪接体组装中的某些作用，并提示Gal3在剪接体外的前mRNA剪接途径中的作用(图2，右侧）。

当用抗Gal3抗体对HeLa NE进行免疫沉淀时，所有五个剪接snRNA（U1、U2、U4、U5和U6），而不是5S rRNA，都被共沉淀(图2，右侧）[86]. 当NE在甘油梯度上分离时，混合梯度组分与抗Gal3的免疫沉淀显示Gal3与不同大小的多个snRNP复合物以及snRNA和蛋白质组成相关。一个这样分离的复合物显示Gal3与U1单体snRNP[86] (图2). 进一步测试了该复合物结合前mRNA的能力，这是根据U1 snRNP对5’-剪接位点的识别而赋予它的一个属性[87]. 事实上，当分离的Gal3-U1复合物与外源性前体mRNA结合时，针对Gal3的抗体免疫沉淀U1 snRNA、snRNP蛋白（U1-70K、Sm B/B'）和前体mRNA以及同源抗原[86]. 使用相同的Gal3-U1复合物，如果Gal3缺乏共有剪接位点，或者如果U1-snRNP首先用核酸酶处理以破坏复合物的U1-snRNA，则Gal3与外源性前mRNA不相关。

值得注意的是，上述观察结果的一个可能解释是Gal3直接与RNA相互作用。然而，试图证明重组Gal3与RNA的直接结合在体外转录前mRNA底物[84]或U1 snRNA（KCH和RJP，未发表的观察结果）通过凝胶迁移率变化分析失败。因此，RNA本身似乎不是Gal3的核配体。

5.3 Gal3与RNP关联的动力学

需要考虑的一个关键问题是，是什么调节Gal3与核RNP的关联。早期的Gal3核定位实验表明，用核糖核酸酶A而不是脱氧核糖核酶I处理渗透性成纤维细胞，可以消除Gal3的核染色，这种模式与Sm核心多肽的模式相似[20]. 此外，当U1 snRNA首次通过核酸酶处理降解时，抗Gal3抗体的免疫沉淀实验未能共同沉淀U1-70K蛋白和外源性添加的前mRNA底物[86]. 这表明Gal3与U1 snRNP的结合是Gal3进入剪接体的机制(图2). 因此，U1-snRNP中RNA的完整性似乎对Gal3参与前mRNA剪接至关重要。

Gal3-RNP结合的另一个关键考虑因素是离子强度。事实上，迄今为止，在任何剪接体的蛋白质组研究中都没有发现Gal3。然而，Gal3与剪接复合物的结合似乎对高盐浓度的破坏很敏感。在盐浓度下进行的免疫沉淀在体外发生剪接反应（60 mM KCl）表明Gal3与剪接体中的mRNA物种相关。然而，当该实验在含有250 mM KCl的条件下进行时，90%以上的相关剪接体mRNA已从Gal3中分离出来[84]. 同样，在缺乏前mRNA的情况下，Gal3与snRNP的关联(图2（右侧）对离子强度的敏感性相同。

最后，Gal3与核RNP的结合可能也对碳水化合物配体敏感。在甘油梯度沉淀之前，用乳糖对HeLa NE进行预处理，使Gal3的分布向梯度顶部移动（即向游离蛋白质移动）[86]. 如果用纤维二糖预处理核提取物，则不会观察到这种情况。这些结果表明，碳水化合物配体可能从核snRNP复合物中释放Gal3。从snRNP复合物中释放Gal3可能解释了碳水化合物对前mRNA剪接的影响，其中Gal3的糖配体Lac和TDG在添加到完整NE时抑制剪接，而非结合糖如纤维二糖未能产生相同的作用[83]. 然而，应注意Gal1蛋白的碳水化合物结合活性，就其本身而言，是不前mRNA剪接所需[71]. Gal1的一个无糖结合活性的定点突变体（N46D）仍然可以在缺乏半乳糖凝集素的NE中重建剪接活性。由于Gal3和Gal1在前mRNA剪接中的冗余性以及这两种蛋白质的相似性，上述发现可能也适用于Gal3。

6.结束语

本文回顾的研究表明，Gal3作为细胞内碳水化合物结合蛋白的一个例子，在细胞核和细胞质中表现出动态行为。大量证据表明Gal3与RNP复合物相关，并参与前mRNA的剪接。引人注目的是，最近有报道称，另一个核剪接因子家族中至少有三个成员，其特征是精氨酸和丝氨酸丰富的结构域（SR剪接因子），与半乳糖凝集素在两个方面相似：它们表现出碳水化合物结合活性，并且可以在细胞表面发现[88]. 使用聚糖阵列，确定这些SR剪接因子结合了一系列岩藻糖基低聚糖，包括H型1、H型2和LeX结构。如本文简介所述，Gal3与聚乳糖胺以及H型1和H型2结构结合[2].

基于纯化蛋白Goletz的成分分析等. [64]据报道，细胞角蛋白被寡糖修饰，寡糖含有末端N-乙酰氨基半乳糖，可能是Gal3的配体。主要的警告是，需要严格排除细胞角蛋白制剂中存在污染糖蛋白的可能性。用O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖修饰许多核蛋白和细胞质蛋白已经有很好的记录（有关综述，请参阅[89]以及本卷中的文章）。然而，Gal3和SR剪接因子均未对单糖表现出明显的亲和力。类似地，剪接因子不与糖原上的α1→4键葡萄糖部分结合，糖原是作为糖原合成引物的细胞质糖蛋白[90]. 在黏菌中粘液菌，细胞质/核蛋白Skp1是E3泛素连接酶复合物的一种成分，在羟脯氨酸上糖基化，生成低聚糖Galα1→6Galαl→Fucα1→2Galβ1→3GlcNAc（有关综述，请参阅[91]以及本卷中的文章）。这种结构可以作为两个剪接因子家族的碳水化合物配体。在Skp1上发现的低聚糖结构和负责其糖基化的细胞溶质（而非内膜途径）酶的特征已经在粘液菌系统。同样的严格工作仍需扩展到高等真核生物。

因此，从许多方面来看，目前似乎没有证据表明半乳糖凝集素和剪接因子SR家族的细胞内存在内源性碳水化合物配体。这些蛋白质的核活性可能依赖于蛋白质之间的相互作用，蛋白质与碳水化合物的结合是为定位于细胞外室的一部分蛋白质保留的。因此，Gal3或SR剪接因子的糖结合活性的重要性仍然是未来研究的挑战。

致谢

作者实验室的工作得到了加尔文学院（EJA）的加尔文研究奖学金、研究公司（EJA，和国家科学基金会（RJP）的MCB-0092919。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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