上皮性卵巢癌化疗增敏的表观治疗

摘要

介绍

卵巢上皮癌是妇科最致命的恶性肿瘤[1]2008年造成15520人死亡[2]. 大多数患者被诊断为晚期疾病，III-IV期上皮性卵巢癌患者的五年生存率低于25%[1,三]. 大多数晚期患者对细胞减少手术和以铂为基础的化疗有反应，然而超过70%的女性复发，而对铂耐药的卵巢上皮癌同样是致命的[4,5].

表观遗传状态的改变是所有癌症的标志[6,7]，包括卵巢[8,9]. 表观遗传学被定义为基因表达的可遗传变化，而不改变DNA序列本身，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体重新定位，以及最近通过微小RNA（miRNA）进行的转录后基因调节[7,10-12]. 甲基转移到胞嘧啶的碳-5位置，几乎总是在胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的范围内，是研究得最好的表观遗传标记，也是哺乳动物细胞中唯一已知的DNA共价修饰。DNA-相关组蛋白受到广泛修饰，介导转录容许或抑制（即开放或封闭）染色质的组装，现在公认DNA甲基化和组蛋白修饰密切相关[7]. 与特定细胞表型相对应的总体表观遗传学状态（如DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达）现在被称为表观基因组[13].

卵巢癌的表观遗传状态改变

首次描述的卵巢上皮癌的表观遗传学变化是DNA甲基化的缺失(14). 癌症中的全球DNA低甲基化主要是由于重复DNA（非基因序列）甲基化降低，包括着丝粒卫星αDNA和相邻卫星DNA（经典卫星2）、Alu重复序列和LINE-1重复序列15]. 在卵巢癌发生过程中，全球和卫星DNA低甲基化程度与恶性程度显著相关[16-18]. 卫星DNA低甲基化在晚期卵巢肿瘤中增加，是预后不良的独立标志[20]. 低甲基化可能通过多种可能的方式促进肿瘤的形成或进展，从而有助于卵巢癌的发生，包括影响转座因子的激活、DNA/染色体重排、抑癌基因或癌基因拷贝数和/或染色体构象的改变21]. 除了重复元件和DNA卫星外，卵巢癌中还报道了启动子CpG岛低甲基化和基因过度表达。CpG岛是DNA序列，包含一个不典型的高频CpG位点[22]. CpG岛通常缺乏DNA甲基化，通常但不完全与基因启动子相关[6,13,22]. 在正常卵巢表面上皮细胞中，一些CpG岛被甲基化，不表达相关的内含基因。卵巢癌中许多蛋白质编码基因的低甲基化和再表达与化疗耐药有关，包括MCJ[23]、SNCG[24]和BORIS[25]. 印迹基因IGF2的低甲基化[26]以及克劳丁-4，其过度表达导致上皮性卵巢癌细胞之间紧密连接中断[27]卵巢癌也有报道。

CpG岛甲基化增加在上皮性卵巢癌中常见[8,9]CpG岛超甲基化与癌症过程所有阶段的表观遗传沉默相关，包括肿瘤的发生、发展和耐药性[6,7]. 卵巢肿瘤中异常甲基化的CpG岛与控制细胞周期、凋亡和药物敏感性的基因以及抑癌基因的沉默有关[8]. 许多基因在卵巢癌中甲基化和下调，包括经典的肿瘤抑制因子BRCA1（乳腺癌易感基因-1）[28,29]，第16页[30]和MLH1[29,31]，假定/候选肿瘤抑制因子（RASSF1A、OPCML、SPARC、ANGPTL2、CTGF）[32-36]印迹基因（ARH1和PEG3）[37]和促凋亡基因（LOT1、DAPK、TMS1/ASC和PAR-4）[38-40]以及与细胞粘附相关的基因（ICAM-1、CDH1[41,42]，细胞信号（HSulf-1）[43,44]，基因组稳定性（PALB2）[45]和紫杉烷抗性（TUBB3）[46]和胚胎发育（HOXA10、HOXA11[47].

甲基化微阵列已被用于全面检测卵巢癌细胞系和患者样本中的DNA甲基化[48-53]. 这些研究表明，卵巢肿瘤包含大量的高甲基化位点，并且异常甲基化的程度(即甲基化基因总数）与卵巢肿瘤的进展和复发直接相关。甲基化分析结合生物信息学方法也发现了与卵巢癌无进展生存率低相关的特定甲基化位点。因此，“甲基化特征”可能有助于卵巢肿瘤的进一步分类和识别个体化治疗策略的改变的生物途径。目的是使用甲基化位点作为生物标记物来监测表观遗传治疗[54]，我们最近开发了一个模型系统来检测与卵巢癌耐药发生相关的DNA甲基化变化[53]. 通过整合DNA甲基化和基因表达谱并应用生物信息学方法，我们的通路分析表明，高甲基化显著破坏了肿瘤抑制功能，低甲基化上调了肿瘤促进级联[53]. 这种实验和计算方法对于确定化疗耐药的关键介质作为潜在的生物标记物或治疗靶点可能具有很高的价值。

甲基化谱的改变可能与DNA甲基转移酶（DNMT）活性的增加或改变有关，DNMT是一个催化甲基转移到DNA的酶家族，使用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体[7]. 尽管卵巢癌细胞中基因甲基化和DNMT RNA水平改变之间的关系并不明确[18,55]卵巢癌获得性顺铂耐药期间，DNMT显著上调[53]表明异常甲基化模式可能与DNMT活性增加或改变有关。此外，使用小干扰RNA（siRNAs）靶向下调DNMT导致CpG超甲基化和生长抑制的丧失[56]，为卵巢癌中启动子DNA超甲基化提供功能验证。

BRCA1是一个在遗传性和散发性卵巢癌中研究得很好的基因[57]. 关于肿瘤，10-15%的散发性疾病发生BRCA1超甲基化和随后的基因沉默[58]与不良临床结果相关[57,58]. 然而，BRCA1和BRCA2的甲基化在遗传性卵巢癌中很少发生[59]进一步表明，在BRCA1或BRCA2携带者的肿瘤中，启动子甲基化并不常见[59]. 最近在卵巢癌患者的血清中检测到BRCA1的高甲基化[32]和特定基因（例如BRCA1、MLH1和其他）表观遗传甲基化的血清检测[32,60,61]可作为患者对标准治疗、表观遗传治疗反应的预测标记[62]或卵巢癌的靶向治疗[63,64].

DNA甲基化和组蛋白修饰调节许多正常卵巢功能[65]最近有报道称，卵巢癌细胞中染色质修饰蛋白的表达发生了改变[66]. 据报道，GATA4和GATA6在没有DNA甲基化的情况下通过组蛋白修饰实现基因沉默[67]，细胞周期B1[68]和p21WAF1/CIP1[69]. 类似地，抑制性组蛋白修饰（三甲基-H3K27和二甲基-H3K9）与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同作用，在TGF-β1难治性卵巢癌细胞中下调ADAM19，而不使CpG岛甲基化[70]，证明异常的TGF-β1信号转导可导致抑制染色质环境的形成，而不会导致DNA甲基化。此外，抑制性三甲基-H3K27me3标记的全基因组丢失与全球DNA甲基化降低相关，从而使耐药卵巢癌细胞对铂重新敏感，并可鉴定H3K27甲基化介导沉默的直接靶基因[71]. 复杂的DNA甲基化和组蛋白修饰模式几乎肯定会导致卵巢癌的进展和患者的耐药性，因为H3K27三甲基化的缺失最近与卵巢和其他恶性肿瘤的不良预后相关[72]基因启动子DNA甲基化可以在没有这种抑制标记的情况下保持[71].

卵巢癌临床前表观遗传药物研究

与癌症相关的基因突变、扩增和缺失不同，DNA甲基化和其他表观遗传修饰可能是可逆的。基于恶性肿瘤中异常DNA甲基化的广泛发现，DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTIs）被检测为诱导肿瘤抑制基因重新表达和恶性表型逆转的一种手段[73]. 这些药物是脱氧胞苷的类似物，在其5-碳上具有各种取代，并有效地阻止甲基转移。因此，当磷酸化并并入DNA时，DNMTI不可逆地将甲基转移酶“捕获”在过渡态复合物中，随后从细胞中清除[73]. 许多与DNMT活性位点共价且不可逆结合的胞嘧啶类似物正被研究其临床逆转癌症中CpG岛甲基化和释放表观遗传沉默基因的能力[54].

最近的临床前研究表明，低甲基化药物通过促进耐药肿瘤细胞的再敏化，与常规化疗相结合更有效。据推测，这种效应是由于启动子去甲基化导致抑癌基因的重新表达；这些基因的激活然后可以恢复药物反应的凋亡途径。几个临床前模型支持这一假设[74-78]. 例如，在卵巢癌模型中，德西他滨和一种相关的表观遗传调节剂斑蝥素介导顺铂耐药上皮性卵巢癌细胞对铂的再敏感性[78]. 这是肿瘤抑制基因上调的结果(RASSF1A，hMLH1) [78]. 在另一项研究中，地西他滨治疗可以使DNA修复基因重新表达hMLH1型在铂耐药的A2780/CP70卵巢癌细胞中，由这些细胞衍生的异种移植瘤可被去甲他滨对顺铂、卡铂、替莫唑胺和表柔比星敏化[74].

组蛋白脱乙酰化是卵巢癌中的另一种转录沉默机制，HDAC抑制剂（HDACIs）的抗癌作用是由于抑制非组蛋白的脱乙酰化，并随后从表观遗传基因抑制中释放出来[79]. 卵巢癌的临床前研究包括HDACIs（belinostat；CuraGen Corp.，Branford，CT）在小鼠体内对卵巢癌细胞和耐铂异种移植物进行再敏化[80]; AR-42（新泽西州帕西帕尼Arno Therapeutics）[81])支持在卵巢癌临床试验中使用这些HDACI。此外，HDACI和DNMTI组合对沉默基因再表达的加性或协同效应已经被证明[82]这表明，将这两类表观遗传药物与传统疗法相结合可能是临床上使用的最有效方法[62]. 针对这种可能性，一项临床前研究表明，与单独使用地西他滨相比，地西他丁与贝尼司他联合使用可诱导耐药卵巢癌异种移植物对铂的再敏感[83].

摘要

由于卵巢癌的高复发率，对铂类耐药疾病需要新的治疗方案。目前正在研究的治疗药物包括抗血管生成靶向治疗、抗体导向治疗、DNA拓扑异构酶抑制剂和腹腔化疗[三]. 如上所述，卵巢癌细胞具有显著改变的表观基因组。启动子CpG岛的超甲基化、组蛋白甲基化的改变以及DNA甲基化和组蛋白修饰之间的相互作用导致卵巢癌中抑癌基因的异常沉默。此外，这些抑制性表观遗传改变与耐药疾病有关。据报道，使用DNMT和HDAC抑制剂在卵巢癌细胞系和动物模型中进行化疗再敏化的临床前结果很有希望，这为有效的表观遗传药物与铂类药物联合使用以克服复发性卵巢癌妇女的耐药性奠定了基础。

低甲基化药物治疗卵巢癌的临床经验

基于这些抑制剂在L1210小鼠白血病模型中的成功应用[84]，早期研究集中于血液恶性肿瘤，特别是白血病和骨髓增生异常综合征（MDS）[85]. 首次研究的DNMTI为5-氮杂胞苷（5-aza-C，Vidaza）及其脱氧核糖类似物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-氮杂-dC，decitabine）；这两种药物随后都被FDA批准用于MDS的治疗[86-91]. 它们的作用被归因于细胞分化的诱导，与表观遗传改变的逆转直接相关[92-95]. 早期对这些药物的研究遵循传统的药物模型，即研究达到或接近最大耐受剂量（MTD）的药物，并使用大剂量的阿扎西丁和地西他滨。因此，这些试验受限于毒性，尤其是骨髓抑制[96,97]. 然而，临床前模型显示，低剂量地西他滨或阿扎西丁可诱导DNA去甲基化，这推动了使用靶向“生物有效的“剂量的低甲基化剂，而不是MTD。模拟这些的后续试验在体外研究结果表明，低至1/10的MTD剂量保持了临床疗效，同时提高了耐受性[98-100].

低甲基化药物已在实体瘤中作为单一药物或联合用药进行了研究[101-102]. 在一项针对胸部恶性肿瘤患者的I期研究中，持续输注地西他滨，并在典型的I期方案中剂量递增[103]. MTD为60-75mg/m²给药72小时以上，骨髓抑制是最相关的毒性。在输注完成前和输注完成后24小时获得的肿瘤活检显示，大约三分之一的治疗患者中NY-ESO-1、MAGE-3和p16的表达被诱导。该试验提供了一个证据，证明了地西他滨通过诱导DNA去甲基化来调节实体肿瘤中的基因表达。在另一项I期研究中，持续注射地西他滨可诱导一组19个基因的DNA低甲基化，尽管患者中没有单个基因表现出一致的去甲基化[101]. 有趣的是，在那项研究中，地西他滨输注完成七天后，DNA甲基化程度降低[101]这与表观遗传调控是时间依赖的概念相一致，需要通过几个细胞周期进行。一项单独的研究评估了卵巢癌患者中去甲基化剂的活性和耐受性。法扎拉宾（Ara-AC）是一种核苷类似物，由1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶的阿拉伯糖苷环和5-氮杂胞苷的嘧啶碱组成，以30 mg/m2/天的剂量连续给药5天，给药周期为28天。在这个剂量下，主要的毒性是血液学，有四名患者表现出4级中性粒细胞减少。在本研究评估的19名患者中未观察到完全或部分反应，但44%的患者病情稳定[104].

迄今为止，三项临床试验对卵巢癌患者的低甲基化药物联合化疗进行了研究(表1). 在这些研究之前，进行了一项I期试验，证明了在实体瘤患者中联合应用地西他滨和卡铂的耐受性[105]. 在该试验中，在第1天给予地西他滨6小时静脉滴注，在第8天给予卡铂静脉推注。DLT表现为骨髓抑制，而地西他滨的最大耐受剂量为90mg/m².在该剂量下，一个常见的高甲基化基因的DNA去甲基化(杂志1)记录在PBMC和治疗前后6例肿瘤活检中的2例[105]. 该试验还表明，在使用地西他滨治疗后的第8天和第12天，DNA去甲基化程度最高，支持在稍后的时间点使用细胞毒性药物。随后，英国癌症研究小组的一项随机II期试验比较了在含铂方案的一线治疗后6-12个月内复发的卵巢癌患者中，联合应用地西他滨和卡铂与单药卡铂的疗效[106]. 以90mg/m的剂量给予德西塔滨6小时输液²在第1天和第8天以6的AUC给药卡铂。然而，由于接受联合方案的患者因中性粒细胞减少而导致剂量延迟，德西他滨的剂量被减至45mg/m²联合用药组的不良事件发生率增加，与单药卡铂患者相比，卡铂超敏反应更多（64%vs 21%），中性粒细胞减少症的治疗延迟更多（36%vs 10%）。与接受卡铂的患者（14名接受治疗的患者中有7名客观反应者）相比，接受联合方案的患者（根据RECIST标准治疗的11名患者中有0名客观反应）的临床活动较少。DNA甲基化的生物效应尚未报道。

同时，印第安纳大学西蒙癌症中心（IUSCC）的一项I-II期试验研究了在耐铂或难治性卵巢癌患者中联合应用地西他滨和卡铂的情况[107]. 为了将毒性降至最低，并增强德西他滨的去甲基化特性，本试验研究的方案在卡铂前五天每天使用低剂量的德西他宾。低剂量地西他滨作为单一药物用于老年白血病患者的类似方案，在54%的接受治疗的患者中表现出良好的耐受性和诱导反应[85]. 在那项白血病研究中，有一个缓慢的时间反应，这与DNA低甲基化是时间依赖的概念一致，需要2-3个细胞周期才能有效，DNA去甲基化在第7天到第14天之间达到最大值。10名患者被纳入IUSCC试验的I期部分[107]，9名患者完成了至少一个疗程，测试了两种剂量水平：剂量水平1（10 mg/m²)和2（20 mg/m²). DLT由3名接受2剂量水平治疗的患者中的2名记录到的4级中性粒细胞减少症组成，因此建议将1剂量水平用于试验的II期部分。最常见的毒性反应为恶心（80%）、过敏反应（60%）、中性粒细胞减少（70%）、疲劳（50%）、厌食（50%），呕吐（40%）和腹痛（40%），大多数为1-2级。影响多个患者的3-4级毒性包括中性粒细胞减少症（n=4）和卡铂过敏反应（n=3）。在这部分研究中，疗效分析只是一种探索性的目的。参与本方案的患者均接受了大量的预治疗，先前治疗方案的中位数为5（范围2-9），患有可测量的疾病，并由RECIST进行评估。观察到1例完全缓解（10%），6例患者（60%）病情稳定，为最佳缓解。六个月时，有四（40%）名患者没有疾病进展。本研究中的探索性生物标记物分析利用了在基线和治疗期间（第5天、第8天和第15天）连续收集的血浆或外周血单个核细胞（PBMC）。通过LINE-1（长散布）重复元件的MethyLight分析评估全球DNA甲基化水平[108]与第1天相比，在第8天和第15天，所有患者的PBMC均减少。有趣的是，没有观察到剂量效应，这表明低剂量的十西他滨（例如每天10mg/m2）足以诱导DNA去甲基化，同时避免过度毒性。此外，五种卵巢癌特异基因的去甲基化(BRCA1、RASSF1A、WWOX、HOX A10和HOX A11）通过使用本方案治疗的患者血浆中的甲基光素进行检查。脱甲基巴西航空公司1和，共HOXA11型与基线相比，在第8天和第15天收集的血浆中记录。对这种联合方案的二期试验正在进行中。

在M.D.Anderson癌症中心进行的另一项II期试验测试了一种联合方案，该方案包括静脉注射75 mg/M剂量的阿扎胞苷²/在28天的周期中，连续5天服用卡铂，第2天的AUC为5[109]. 本研究治疗了30例耐铂或难治性OC患者。最显著的副作用是骨髓抑制、疲劳和恶心。在这个队列中，有4个客观反应（RR为14%），其中一个是完全反应。中位缓解时间为7.5个月，两名患者持续治疗一年以上。本研究中观察到的反应持续时间较长，以及IUSCC I期试验中记录到的无进展患者的比例表明，去甲基化地西他滨可能在铂耐药卵巢肿瘤对铂的再敏感中发挥作用。未来测试这一概念的试验应将测量无进展生存率作为主要终点。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗卵巢癌的临床经验

组蛋白乙酰化和去乙酰化之间的动态平衡受到组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的严格调控。HDAC对核小体组蛋白的影响导致染色质的紧密卷曲和与细胞生存和分化调控相关的基因的沉默[110]. 由于异常的HDAC活性与癌症有关，HDACIs正在作为抗癌药物进行研究[111]. 已经研究了几种HDACI，包括曲古抑菌素和丁酸，它们在临床前模型中很活跃[112]，但临床活动有限[113]. Depsipeptide是首个临床疗效显著的HDACI[114,115]然而，这种药物没有在卵巢癌中进行测试。伏立诺达（亚甲酰苯胺羟肟酸，SAHA）是一种小分子，在锌的存在下直接与HDAC的活性部位结合。伏立诺司他可以口服，具有良好的生物利用度，在第一阶段试验中主要的限量毒性为厌食、脱水、腹泻和疲劳[116,117]. 在接受200至600 mg口服伏立诺司他治疗的患者中，PBMC显示出乙酰化组蛋白在治疗后的积聚[116,117]. 妇科肿瘤组（GOG）对铂类药物治疗后12个月内复发的卵巢癌患者进行了伏立诺作为单一药物的II期试验[118]. 最显著的毒性包括2种4级毒性（白细胞减少和中性粒细胞减少）、3种体质3级毒性和3种3级胃肠事件。在本试验中接受治疗的27名女性中，有两名患者存活6个月以上，无进展，有一名患者出现部分缓解。对于复发性OC患者来说，这种活动水平被认为是不够的，并且随着单一药物的停用，其进一步的研究也被停止了。另一种最近进入临床领域的HDACI是belinostatt（PDX101），它是一种新型异羟肟酸HDACI，具有强大的抗增殖和HDAC抑制活性在体外以及异种移植卵巢癌和结直肠癌模型[119]. 在一项I期试验中，对晚期实体瘤患者在21天周期的第1天至第5天每天静脉滴注贝尼司他30分钟，起始剂量为150 mg/m²[120]. 1200 mg/m的剂量限制性毒性为3级疲劳、腹泻和心律失常²得出最大耐受剂量为1000 mg/m的结论²每天5天。在外周血单个核细胞中观察到组蛋白H4乙酰化的剂量依赖性增加，在900 mg/m2剂量下观察到最大效应，表明白诺司他具有生物活性体内在不同恶性肿瘤（包括肉瘤、肾癌、胸腺瘤和黑色素瘤）的患者中观察到疾病稳定，将贝利诺司他定位为癌症进一步发展的有趣因素。许多临床前模型表明，HDACIs与去甲基化药物联合使用可增强抗癌活性[121]，化疗[122]或其他生物制剂[123,124]，我们认为HDACI的进一步发展应该包括合理设计的组合。

致谢

脚注

参考文献