Role of Plastid Protein Phosphatase TAP38 in LHCII Dephosphorylation and Thylakoid Electron Flow

Mathias Pribil; Paolo Pesaresi; Alexander Hertle; Roberto Barbato; Dario Leister

doi:10.1371/journal.pbio.1000288

《公共科学图书馆·生物》。2010年1月；8（1）：e1000288。

2010年1月26日在线发布。数字对象标识：10.1371/期刊.pbio.1000288

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PMID：20126264

质体蛋白磷酸酶TAP38在LHCII去磷酸化和类胸腺电子流中的作用

马蒂亚斯·普里比尔，^1，² 保罗·佩萨雷斯，^三亚历山大·赫特尔，¹ 罗伯托·巴巴托，⁴和达里奥·雷斯特^1，^*

乔安娜·乔里，学术编辑

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关联数据

补充资料: 图S1： 插入等位基因 在4g27800 及其对剪接变异体表达的影响。（A） T-DNA插入在4g27800轨迹。三种拼接变体的不同编码序列用灰色方框表示。相应的5′和3′UTR以白色显示。内含子用细线表示。拼接变体见4g27800.1(TAP38型)和见4g27800.3由于在第9外显子中插入了四个额外的核苷酸见4g27800.3导致终止密码子。箭头（未按比例绘制）表示PCR分析中使用的引物对的位置。标记为1、2、3和4的引物序列为：地址：4g27800.1/TAP38-At4g27000.2-专用底漆（1号）：5′-ACATGGAAATGCAGCTTG;地址：4g27800.1/TAP38-At4g27700.2-At4g 27800.3（2号）：5′-GTGAAGACATCCATATGCCA公司;在4g27800.2-专用底漆（3号）：5′-AATACCCTCCTCAGCCTTC;见4g27800.3-专用底漆（4号）：5′-ACATGGAAATGCAGGCAA（B）半定量逆转录酶（RT）-PCR分析，以验证拟南芥WT离开。RT-PCR反应中使用的引物组合编号如（A）所示。泛素(UBI公司)扩增作为等负荷对照（泛素正向引物：5′-GGAAAAGGTCTGACCGACA; 泛素反面：5′-CTGTTCACGGAACCCAATTC). 在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳代表性半定量RT-PCR反应（30个循环）的等分样品（10µl），以区分见4g27800.1(水龙头38)和见4g27800.2。请注意，对于见4g27800.3剪接变异体，无法获得信号。
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表S1： PSI和PSII之间的能量分布以730 nm和685 nm（F₇₃₀/F类₆₈₅).
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光合作用效率的调节涉及通过新鉴定的磷酸酶TAP38的活性可逆地磷酸化捕光复合体。

摘要

光照的短期变化引起类囊体蛋白磷酸化的改变和光合机制的重组。LHCII是光系统II的捕光复合物，其磷酸化促进其重新定位到光系统I，并允许激发能量在光系统之间重新分配（状态转换）。蛋白激酶STN7是开花植物LHCII磷酸化和状态转换所必需的拟南芥LHCII磷酸化是可逆的，但大量鉴定LHCII去磷酸化的蛋白磷酸酶的工作尚未成功。在这里，我们表明类囊体相关磷酸酶TAP38是LHCII脱磷酸化和从状态2到状态1转变所必需的拟南芥.英寸抽头38突变体，类囊体电子流增强，导致在恒定弱光条件下更快生长。水龙头38基因过度表达显著降低LHCII磷酸化并抑制状态1→2转换，从而模拟序列号7表型。此外，在体外试验中，重组TAP38蛋白能够直接去磷酸化LHCII。LHCII去磷酸化对TAP38剂量的依赖性，以及体外TAP38介导的LHCII的去磷酸化，表明TAP38直接作用于LHCII。虽然LHCII的可逆磷酸化和状态转换对植物在自然光照条件下的适应性至关重要，但LHCII过度磷酸化与TAP38失活导致的状态2光合作用停滞相关，可提高光合作用性能和植物在状态2有利光照条件中的生长。

作者摘要

植物能够通过调节其两个光能系统（负责光能捕获的结构）的活动，使光合作用适应光照水平的变化。在调用的过程中状态转换，负责采光的光合复合体（光合触角）的一部分被可逆磷酸化，并在光系统之间迁移以重新分配光能。最近发现了负责磷酸化光合触须蛋白的蛋白激酶。然而，尽管进行了大量的生物化学研究来分离催化相应的去磷酸化反应的酶，但这种蛋白磷酸酶的特性仍然未知。在本研究中，我们鉴定并表征了类囊体相关磷酸酶TAP38。我们首先通过光谱测量证明，在没有功能性TAP38蛋白的植物中，具有状态转换特征的光系统之间的激发能量重新分配不会发生。然后我们发现，在没有TAP38的植物中，光合触角蛋白的磷酸化显著增加，但在比野生型植物表达更多TAP38蛋白的植物中降低。这一点，再加上在体外测定中添加重组TAP38降低了天线蛋白磷酸化水平的观察结果，表明TAP38在关键的磷酸酶调节状态转变时直接作用于光合天线蛋白。此外，在没有TAP38的植物中，光合电子流增强，导致在恒定的低光条件下更快地生长，从而提供了第一个具有改进光合作用的突变植物实例。

介绍

由于植物的固着生活方式，它们必须应对栖息地的环境变化，例如入射光的波动。光量或质量（即光谱组成）的变化会导致两个光系统的不平衡激发，并降低光合反应的效率。植物可以通过一种称为状态转换这取决于主要捕光（LHCII）蛋白质的移动池与光系统II（状态1）或光系统I（PSI）（状态2）的可逆关联（在[1]——[5]). 具体而言，磷酸化LHCII（pLHCII）的积累，在低白光或特定激发PSII（红光）波长的光的刺激下，导致pLHCII与PSI（状态2）的关联，从而将额外的激发能量导向PSI。诸如黑暗或特定波长的光激发PSI（远红光）以及高强度白光等条件，刺激pLHCII去磷酸化及其迁移到PSII（状态1），从而将激发能量重定向到PSII。

绿藻中LHCII磷酸化和状态转换已被广泛研究莱茵衣藻和开花植物拟南芥 [2]，[4]——[6].英寸C.莱因哈迪状态跃迁对光电系统能量平衡和促进循环电子流的影响[2]，[5]然而，在有花植物中，状态转变的生理意义不太明确，因为它们的流动LHCII池明显小于绿藻中的LHCII库[7]，[8]因此，拟南芥在状态转换中受损的突变植物在其发育和适应性方面只受到轻微影响[9]——[11]即使在波动的光线或野外条件下[12]，[13]然而，当拟南芥状态转换突变体在线性电子流中受到扰动，对植物性能和生长速度的影响变得明显[14]这表明，在开花植物中，状态转换在生理上也是相关的。

负责磷酸化LHCII的蛋白激酶是膜结合的，在细胞色素还原后被激活b条 ₆/如果（周期b条 ₆/如果)在状态2促进光照条件下（低白光或红光），通过塑料醌（PQ）池形成复合物[15]，[16]状态1促进光条件（暗或远红光）诱导的PQ氧化条件使LHCII激酶失活，并导致pLHCII与PSII的关联（状态1，在[4]，[5]). 然而，当基质还原状态非常高时，LHCII激酶活性也在高白光条件下失活。体外和最近的体内研究表明，LHCII激酶活性的抑制可能由还原硫氧还蛋白介导[17]，[18].英寸C.莱因哈迪和拟南芥，同源类囊体蛋白激酶Stt7和STN7分别是LHCII磷酸化和状态转换所必需的[12]，[19]共免疫沉淀分析显示Stt7激酶与Cyt相互作用b条 ₆/如果、PSI和LHCII[17]，表明Stt7（和STN7拟南芥)直接磷酸化LHCII，而不是Stt7/STN7依赖性磷酸化级联反应的一部分。

在PQ氧化条件下，当LHCII激酶失活时，pLHCII通过as-yet未知蛋白磷酸酶的作用去磷酸化，从而允许LHCII的流动部分与PSII（状态1）结合[5]，[7]多年来，人们试图阐明LHCII蛋白磷酸酶的特性并鉴定其。通过生物化学方法[20]——[22]研究表明，不同家族的蛋白磷酸酶必然参与类囊体磷酸蛋白的可逆磷酸化。假设PP2A样磷酸酶负责PSII核心蛋白的去磷酸化[23]而LHCII磷酸酶活性则取决于二价阳离子的存在，且不受微囊藻毒素和冈田酸的抑制[21]，[22]这些发现强烈提示PP2C型磷酸酶参与pLHCII去磷酸化[24].

在这里，我们表明类囊体蛋白磷酸酶TAP38是pLHCII去磷酸化和状态转换所必需的。在TAP38水平显著降低的植物中，LHCII的过度磷酸化与类囊体电子流增强有关，导致在恒定的低光照条件下生长更快。结合体外去磷酸化试验的结果，我们的数据表明TAP38直接去磷酸化pLHCII。

结果

候选LHCII磷酸酶的筛选

为了鉴定LHCII磷酸酶，我们系统地分离了已知叶绿体蛋白磷酸酶的功能丧失突变体，并评估了它们去磷酸化pLHCII的能力（详见下文）。然而，9种蛋白磷酸酶At3g52180（DSP4/SEX4）、At4g21210（AtRP1）、At1g07160、At3g30020、At4g33500、At1g67820、At2g30170、At3g10940或At4g03415中没有一种被证明存在于叶绿体中[25]——[29]，被鉴定为LHCII磷酸酶（未发表的数据）。接下来，我们将研究扩展到通过蛋白质组学分析初步鉴定为叶绿体蛋白的蛋白磷酸酶拟南芥 [30]，[31]其中，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶At4g27800被证明是最有希望的候选者。

At4g27800.1（TAP38）是一种类囊体相关蛋白磷酸酶

与At4g27800高度同源的蛋白质存在于苔藓和高等植物中，但不存在于藻类或原核生物中。此外，At4g27800及其同源物共享一个预测的N末端叶绿体转运肽（cTP）、一个位于其C末端的推测跨膜结构域和一个蛋白磷酸酶2C标记(图1). 对于拟南芥，三个在4g27800预测mRNA(图S1A). 为了验证它们的存在并区分不同的剪接形式，进行了反转录酶PCR分析。仅限见4g27800.1，更少见4g27800.2，在树叶中可检测到，而见4g27800.3剪接变体，无法获得信号(图S1B).

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图1

TAP38序列与高等植物和苔藓相关蛋白序列的比较。

的氨基酸序列拟南芥TAP38蛋白（At4g27800）与来自毛果杨（POPTRDRAFT_250893），水稻（Os01g0552300），西钦云杉（GenBank:EF676359.1型)、和专利立管菌（PHYPADRAFT_113608）。黑盒子强调严格保守的氨基酸，而灰盒子则强调密切相关的氨基酸。构成蛋白磷酸酶2C特征的氨基酸用星号表示。推测的叶绿体转运肽（cTPs）用斜体表示，潜在的跨膜结构域（TM）突出显示。

在原生质体中转染见4g27800.1与红色荧光蛋白（RFP）的编码序列融合[32]，定位于叶绿体的融合蛋白(图2A). 用放射性标记的At4g27800.1蛋白进行的叶绿体导入分析证实了叶绿体的吸收及其cTP的去除。成熟At4g27800.1的分子量为～38 kDa(图2B). 使用针对成熟At4g27800.1蛋白的特异性抗体进行免疫印迹分析(图2C)在类囊体制剂中检测到蛋白质，但在基质组分中没有检测到。值得注意的是，假定的翻译产品At4g27800.2和At4g28800.3（～32 kDa）无法检测到(图2C). 因此，At4g27800.1是叶片中的主要亚型，并被重命名为TAP38（38 kDa的类囊体相关磷酸酶）。

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图2

TAP38的亚细胞定位。

（A）全长TAP38-RFP在拟南芥原生质体，荧光显微镜观察。自动、叶绿素自动荧光；DIC，微分干涉对比图像；合并，两个信号叠加；RFP，融合蛋白。比例尺指示50µm。（B）³⁵在SDS-PAGE和放射自显影之前，将体外翻译的S标记TAP38蛋白（通道1，10%翻译产物）与分离的叶绿体（通道2）孵育，随后用嗜热菌素处理这些叶绿体以去除粘附的前体蛋白（通道3）。m、成熟蛋白；p、前体。（C） WT和WT蛋白的免疫印迹分析抽头38-1叶子。装载等量的蛋白质。过滤器用TAP38特异性抗体进行免疫标记。叶绿素，总叶绿体；Str，基质蛋白；类囊体蛋白；总蛋白质。

TAP38在野生型中的表达，抽头38突变体和TAP38过表达植物

两个抽头38插入突变体，抽头38-1（SAIL_514_C03）[33]和抽头38-2（SALK_025713）[34]，来自T-DNA插入收集(图S1A). 在抽头38-1和抽头38-2植物，数量TAP38型转录本严重减少，分别为WT水平的10%和13%(图3A). 相反，在携带TAP38型花椰菜花叶病毒35S启动子控制的编码序列TAP38型)，级别为TAP38型mRNA水平明显高于野生型（WT）(图3A). TAP38蛋白浓度反映了TAP38型抄本：抽头38-1和抽头38-2类囊体的WT水平分别为<5%和～10%，而TAP38型植物在蛋白质水平上表现出20倍以上的过度表达(图3B). TAP38蛋白水平也在与状态转换相关的光照条件下测定（参见材料和方法). 在WT植株中，在所有光照条件下，TAP38的组成表达水平相似(图3C).

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图3

TAP38在中的表达抽头38突变体、TAP38过表达和WT植物。

（A）量化TAP38型通过实时PCR检测WT中的mRNA，抽头38-1，抽头38-2和oeTAP38型使用底漆组合1和2（如图S1A和S1B). （B）来自WT和抽头38突变体被装载到相应的车道上。oe减少额TAP38型标记为0.25×oe的车道上装载了相当于25%WT量的类囊体TAP38型此外，在指示为0.5×WT和0.25×WT的通道中装载了降低水平的WT类囊体。过滤器用针对成熟TAP38蛋白的TAP38特异性抗体进行免疫标记。（C）暴露于不同光照条件下的野生型植物的类囊体膜（见图5)经SDS-PAGE分离。使用针对成熟蛋白的TAP38特异性抗体对相应的Western blot进行免疫修饰。与LHCII迁移区域相对应的复制凝胶的细节用考马斯蓝染色，显示为负载控制。

状态转换需要TAP38

为了确定TAP38是否参与状态转换，在WT中测量了叶绿素荧光，抽头38和oeTAP38型叶子(图4A). 植物暴露在刺激状态2（红光）或状态1（远红光）的光照条件下[35]，[36]，以及状态2对应的最大荧光（F_M（M）2）并且处于状态1（F_M（M）1）值已确定。因为选择用于诱导状态转换的光强不会引发光抑制（通过测量最大量子产率[F_V（V）/F类_M（M）])，F中的更改_M（M）最大荧光，可能仅归因于状态转换。这使我们能够计算由于状态转换（qT）导致的叶绿素荧光猝灭程度[36]。在水龙头38突变体qT显著降低(抽头38-1, 0.01±0.003;抽头38-2, 0.03±0.001; 重量，0.10±0.001）。在抽头38-1植物与TAP38型基因组序列（包括其天然启动子）、qT值正常，证实状态转换需要TAP38。有趣的是，oeTAP38型植物的qT值约为0.01±0.001，表明TAP38的缺乏和过量都会干扰植物进行可逆状态转变的能力。

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图4

状态转换需要TAP38。

（A）红光（R）和补充了远红光（FR）的红光分别用于诱导向状态2和状态1的转变。F类_M（M）1和F_M（M）2分别代表状态1和状态2的最大叶绿素荧光水平。水平条指示照明的长度。箭头表示特定灯光打开/关闭的时刻。轨迹是10次重复的平均值。ML，测量光。（B）植物暴露于诱导状态1（虚线，740 nm的远红光）或状态2（实线，弱光；80µmol m⁻²秒⁻¹)（另请参见材料和方法). 激发波长为475 nm，光谱根据685 nm处的峰高进行归一化。痕迹是10次重复的平均值。

为了确定PSII和PSI的天线尺寸，在描述的状态1（暴露于远红光）和状态2（弱光）条件下测量了77K荧光发射光谱[11]，[12]，[37](图4B). 将光谱归一化为685nm，即PSII荧光峰。在WT中，从状态1到状态2的转变伴随着730nm处相对PSI荧光的显著增加，反映了激发能量从PSII到PSI的重新分配。相反，在抽头38叶片中，即使在状态1促进条件下，PSI荧光峰也相对较高，这意味着突变体在状态2下被阻断，即pLHCII应主要附着在PSI上。此外，在状态2提升光照条件下，PSI天线尺寸（表示为F₇₃₀/F类₆₈₅)在中较大抽头38与WT相比的突变(抽头38-1，1.47；抽头38-2, 1.45; 重量，1.38；另请参见表S1)支持抽头38植物，LHCII移动池的较大部分可以连接到PSI。相反，在oe中TAP38型在植物中，PSI的相对荧光在预期诱导状态1→状态2转变的条件下几乎没有增加(图4B;表S1). 这种行为类似于序列号7突变体，在状态1中被阻断，即LHCII永久连接到PSII[12].

LHCII磷酸化水平与TAP38浓度成反比

人们普遍认为，状态转换需要LHCII的可逆磷酸化[2]，[4]，[5]因此，在有利于状态1（暗或远红光处理）或状态2（弱光）的光条件下监测LHCII的磷酸化状态。TAP38水平异常的植物和野生型植物暗适应16小时（状态1），然后暴露于弱光（80µmol m⁻²秒⁻¹，8小时）（状态2），然后到远红光（4.5µmol m⁻²秒⁻¹，740 nm）持续120分钟，以诱导返回状态1。每次处理后分离类胸腺蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE进行分离，并用磷酸苏氨酸特异性抗体进行分析(图5，左侧面板）。WT植物在从状态1（暗[D]）到状态2（弱光[LL]）的过渡过程中显示出pLHCII的预期增加，随后在暴露于远红光（FR）时pLHCII逐渐减少。在抽头38突变体，pLHCII水平在所有时间点都异常高，而oeTAP38型植物再次模仿序列号7表型[9]，[12]显示pLHCII的构成性降低水平。

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图5

LHCII磷酸化水平与TAP38浓度呈负相关。

左面板，从WT（A）中提取的类囊体蛋白，抽头38-1（B）和oeTAP38型（C）植物保持在黑暗中（D；状态1），随后暴露在低光下（LL；状态2），然后暴露在远红光下30、60和120分钟（FR₃₀，法国₆₀，法国₁₂₀; 状态1）通过SDS-PAGE进行分级。用磷酸苏氨酸特异性抗体进行免疫印迹分析，检测LHCII和PSII核心蛋白的磷酸化。每个基因型的三分之一免疫印迹显示出来。pCAS，磷酸化CAS[44]; pCP43，磷酸化CP43；pD1/D2，磷酸化PSII-D1/D2；pLHCII，磷酸化LHCII；考马斯菌是考马斯染色的PA凝胶的一部分，与印迹的凝胶相同，对应于LHCII迁移区域，用作负载控制。右面板，WT（A）类囊体蛋白，抽头38-1（B）和oeTAP38型（C）按照左图处理的植物进行BN-PAGE分析。状态2相关670-kDa蛋白复合物的积累[14]与LHCII的磷酸化水平相关。请注意抽头38-2表现得与抽头38-1（未显示数据）。显示了每个基因型三分之一的BN-PAGE。

不同TAP38浓度下PSI-LHCII复合物形成的定量

为了直接观察缺乏或过度表达TAP38的株系中LHCII磷酸化的改变如何影响两个光系统之间流动LHCII部分的分布，我们对适应状态1（暗和远红光处理）或状态2（弱光处理）的植物类囊体蛋白复合物进行了研究至非变性蓝色天然（BN）PAGE[38](图5，右侧面板）。在本试验中，约670 kDa的色素-蛋白质复合物代表与PSI-LHCI复合物相关的pLHCII[14]，[38]，[39]，可以可视化。而在WT类囊体中，670-kDa复合物只有在状态2条件下才能观察到(图5A，右侧面板），如前所述[14]，[39]; LHCII在抽头38突变体与670-kDa复合物在所有光照条件下的显著带相关联(图5B，右侧面板）。670-kDa复合体的形成在oe中被完全阻止TAP38型处于状态1且pLHCII水平高度降低的植物(图5C，右侧面板）。二维（2D）PA凝胶分馏证实，在WT植物中，色素-蛋白质复合物由PSI和LHCI亚基组成，还有一部分pLHCII在状态1→状态2转变时与PSI相关(图6;[14]). 此外，2D PA凝胶上不同PSI络合物的定量显示，与LHCII相关的PSI络合物的数量在抽头38突变体(图6B和6C)支持从77K荧光分析中获得的结果。

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图6

状态2条件下PSI-LHCI和PSI-LHCII复合物的定量。

（A） WT中等量类囊体蛋白的BN-PAGE，抽头38-1和oeTAP38型适应状态2的植物（弱光；80µmol m⁻²秒⁻¹). 显示了代表PSI-LHCII（1）和PSI-LHCI（2）配合物的带。BN-gel与图5是由于电泳运行时间较长造成的。（B） WT，抽头38-1和oeTAP38型通过变性2D-PAGE进一步分离（A）中BN-PAGE的车道。凝胶用考马斯蓝染色。LHCII，PSII的光捕获复合物（指示PSI-LHCI-LHCII（1）和PSI-LHCI（2）复合物的带被包围）；P700，光系统I反应中心。（C）（B）中代表PSI-LHCII（点1）和PSI-LHCI（点2）的点的密度定量。值是每个基因型三个独立2D凝胶的平均值。条形图表示标准偏差。请注意水龙头38-2行为与抽头38-1（未显示数据）。

重组TAP38能直接脱磷酸化pLHCII

建立了体外去磷酸化试验，以评估TAP38直接去磷酸化pLHCII的能力。为此，TAP38磷酸酶的N末端His-tag融合表达于大肠杆菌并纯化（参见材料和方法). 可溶性类囊体抽头38-1然后通过蔗糖梯度超速离心分离突变体植株，并分离富含pLHCII的蛋白质部分。随后，将pLHCII色素-蛋白质复合物在30°C下在有或无重组TAP38磷酸酶的情况下培养2小时。在孵育期结束时，通过SDS-PAGE对反应混合物进行分级，并使用磷酸苏氨酸特异性抗体进行免疫印迹(图7). 显然，添加重组TAP38后，LHCII磷酸化水平降低了约50%（相对于未处理的pLHCII样品）。在存在磷酸酶抑制剂NaF的情况下，TAP38的添加并没有显著改变LHCII的磷酸化水平。综上所述，这些发现表明TAP38能够直接去磷酸化pLHCII。

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图7

重组TAP38在体外直接对pLHCII脱磷。

（A）从中分离出等量的pLHCII抽头38-1用SDS-PAGE分离经重组TAP38处理或不经重组TAP38处理的突变植株，并用磷酸苏氨酸特异性抗体进行免疫修饰。添加NaF（10 mM）以特异性抑制磷酸酶活性。（B）用考马斯蓝对（A）中样品的复制凝胶进行染色，作为负荷对照。显示了重组TAP38蛋白和LHCII带。（C）（A）中带的密度定量，表示不同条件下LHCII的磷酸化水平。

不含TAP38的植物在弱光下表现出更好的光合作用和生长

当保持在低光强度下（80µmol m⁻²秒⁻¹)支持州2，抽头38突变体比WT植株长得大(图8A)，而oeTAP38型这些植物表现得像WT（未公布的数据）。详细的增长测量显示抽头38从子叶期开始，突变体表现出比野生型植株持续的生长优势(图8B). 由于这种差异可能归因于光合性能的改变，因此测量了类囊体电子流参数。Q的分数_A类还原态（1-qP）中的PSII初级电子受体在抽头38-1（0.06±0.01）和抽头38-2当两种基因型都生长为图8A用22µmol m激发叶绿素荧光⁻²秒⁻¹光化红光。初级电子受体氧化还原状态的可比差异持续高达95µmol m⁻²秒⁻¹光化红光(图8C)，表示抽头38根据在状态2光照条件下天线尺寸的增加，突变体可以将更大比例的能量重新分配给PSI（参见图4B;表S1和图6). 这个想法得到了最大值（F）的测量值的支持_V（V）/F类_M（M）)和有效（Φ_二)PSII的量子产率。F类_V（V）/F类_M（M）在突变植物中保持不变（参见图8D，暗适应植物，光合作用活性辐射[PAR]=0），表明突变PSII复合物的类WT效率。然而，Φ_二年增加了抽头38-1（0.75±0.01）和抽头38-2（0.73±0.02）相对于WT（0.72±0.01），表明电子流通过类囊体在抽头38突变体(图8D). 光合性能的改善抽头38突变体在低光照和中等光照下最为明显(图8C和8D)正如他们的生长表型所预期的那样。

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图8

水稻的生长特性和光合性能抽头38突变植物。

（A） 4周龄的表型抽头38-1，抽头38-2和在弱光条件下生长的野生型植物（80µmol m⁻²秒⁻¹)在12h/12h光/暗条件下。（B）增长曲线。每个基因型20株植物的叶面积（WT，灰条；抽头83-1，白色条；抽头38-2，浅灰色条）在发芽后4周内进行测量。显示了平均值±标准偏差（SDs；bar）。（C和D），如（A）所示生长的植物的光合参数1-qP（C）和PSII（ΦII；[D]）的有效量子产量的光依赖性测量。WT，填充灰色圆圈；抽头38-1，开放圆；抽头38-2，填充浅灰色圆圈；油当量（oe）TAP38型，填充的黑色圆圈；PAR，光合作用有效辐射，单位：µmol m⁻²秒⁻¹平均值由五个独立测量值确定（SD<5%）。

讨论

TAP38的可能操作模式

TAP38如何控制LHCII去磷酸化？三种可能性似乎是合理的：TAP38（1）负调节STN7的活性（例如，通过去磷酸化[40])，（2）直接去磷酸化LHCII，或（3）形成控制LHCII激酶或磷酸酶活性的磷酸化/去磷酸化级联的一部分。观察结果表明TAP38型尽管植物的TAP38水平增加了20倍以上，但仍表现出残留的LHCII磷酸化（参见图5C)，反对TAP38通过去磷酸化抑制STN7的观点。TAP38水平的差异导致pLHCII水平发生明显变化：尽管抽头38突变体TAP38的强烈减少导致pLHCII持续升高，PSI-LHCII复合物的数量增加，TAP38（oeTAP38型)导致附于PSI的pLHCII完全消失，尽管pLHCII仍然存在。

综合这些观察结果，TAP38磷酸酶似乎特异性作用于与PSI-LHCI复合物相关的pLHCII。事实上，在状态2诱导光条件下，pLHCII仍然附着在PSII上的去磷酸化似乎对能源效率不利。

有趣的是，在WT中，pLHCII水平可以根据光照条件发生显著变化[9]，[12]（另请参见图5A)，TAP38似乎是在不同的光照条件下构成表达的（参见图3C). 对此的合理解释是，TAP38具有组成活性，并直接负责pLHCII的去磷酸化。为此，TAP38需要在一定的浓度范围内存在（就像WT的情况一样），以不断地使pLHCII去磷酸化。与此一致，类囊体蛋白磷酸酶反应被描述为氧化还原无关，从而得出结论，LHCII磷酸化的氧化还原依赖性是激酶反应的一个特性[41]这与观察到的Stt7水平在延长状态2条件下升高（有利于LHCII磷酸化），在状态1条件下降低（有利于去磷酸化LHCII）[17]，支持LHCII激酶是控制LHCII磷酸化状态的决定性因素的假设。尽管pLHCII去磷酸化具有明显的TAP38剂量依赖性（参见图5和和6），6)TAP38活性可以在其他水平上调节，而不仅仅是其丰度。然而，TAP38水平的大幅下降或上升抽头38突变体和oeTAP38型植物可能会干扰这些基因型中的其他类型的调控。

TAP38是长效LHCII磷酸酶吗？

如上所述，比较LHCII去磷酸化对TAP38剂量的依赖性抽头38突变体、WT和TAP38过表达强烈表明，TAP38直接去磷酸化pLHCII，尤其是当它与PSI-LHCI复合物相关时。或者，TAP38可以在控制LHCII磷酸酶活性的磷酸化/去磷酸化级联反应中发挥作用。尽管后一种假说不能完全排除，但一组证据表明TAP38在LHCII磷酸化中的直接作用。事实上，我们的体外去磷酸化试验清楚地表明，TAP38可以直接去磷酸化pLHCII（参见图7). 此外，与STN激酶的情况一样，为鉴定其他LHCII磷酸酶候选物而进行的大量努力都失败了：所有蛋白磷酸酶的敲除线都被证明位于叶绿体中[25]——[29]LHCII磷酸化没有任何变化。此外，广泛的生物化学研究并没有揭示LHCII去磷酸化过程中存在复杂的磷酸酶网络，但假设只有来自不同家族的两种不同的叶绿体蛋白磷酸酶参与类囊体磷酸化过程[20]——[23]，[42]我们的数据支持这一观点，如CP43、D1和D2亚基的磷酸化模式在抽头38突变植物（参见图5). 此外，pLHCII脱磷酸化仅由两种独立的蛋白磷酸酶催化，一种是膜结合蛋白磷酸酶，另一种是基质蛋白磷酸酶[42]与此相反，我们的结果清楚地表明，TAP38，一种类囊体相关磷酸酶，单独负责LHCII去磷酸化。因此，尽管略有泄漏抽头38-1在所有研究条件下，突变体显示大部分LHCII处于磷酸化状态（参见图5). 如果第二个具有多余功能的LHCII磷酸酶在叶绿体中运行，人们会认为pLHCII会有一些残留的去磷酸化作用。对先前显示的基质pLHCII去磷酸化活性的合理解释[22]可能是在基质提取物的制备过程中，TAP38的很大一部分从类囊体膜释放到基质中。有趣的是，TAP38似乎也会影响其他类囊体蛋白的磷酸化水平，如CAS蛋白在抽头38-1类囊体（参见图5). 综合这些观察结果，似乎与STN激酶一样，需要两种不同的磷酸酶来对LHCII和PSII核心蛋白进行去磷酸化。TAP38类似于STN7激酶，似乎对与PSI-LHCI复合物相关的pLHCII具有高度特异性。STN8的对应产品[9]，[43]PSII核心特异性磷酸酶尚待鉴定。然而，与STN7和STN8激酶的情况一样，磷脂酶之间似乎也存在一定程度的底物重叠，如PSII-D1/D2亚基在TAP38型暴露在远红光条件下的过表达线（参见图5C). 此外，值得注意的是，TAP38的活性似乎并不局限于STN7底物，如它对CAS蛋白磷酸化的影响所示，之前曾报道过它是STN8激酶的底物[44].

从PQ氧化还原态解偶联LHCII磷酸化

众所周知，塑性喹啉酮池（PQH）还原分数的相对大小增加₂)增强LHCII的磷酸化[1]，[5]，[39]，[45].TAP38耗尽抽头38然而，突变体增加了LHCII磷酸化（参见图5B)和PQ氧化（参见中的1-qP值图8C). 通过假设PQ的氧化增强是由PSI天线尺寸的增加（和LHCII磷酸化）引起的抽头38植物不足以下调LHCII激酶，以弥补LHCII去磷酸化的下降。

缺乏TAP38如何改善光合作用和生长？

Φ增加表明光合性能增强_二和1-qP的减少（参见图8C和8D)以及抽头38在恒定慢光强度下刺激LHCII磷酸化和状态2的突变体可归因于较大比例的能量重新分配到PSI。这与PSI天线尺寸在抽头38与野生植物相比，突变体（参见图4B，表S1、和图6). 因此，可以直接推测，增强的PSI天线尺寸提供了抽头38在优先激发PSII并诱导状态2的条件下，具有更强劲光合电子流的突变体。由于更加平衡的光反应，光合效率得到提高，从而提高了生长速度。然而，在诱导状态1的条件下，或在光线波动的更自然条件下，健身优势将恢复；在这里，可以预期水龙头38突变体在光合作用和生长方面的效率将低于WT，这与已经观察到的序列号7突变体[12]，[13].

见解

综上所述，未来的分析应阐明哪些蛋白磷酸酶参与PSII核心蛋白的去磷酸化，哪些是高等植物磷酸酶的对应物，包括TAP38衣原体（显然缺少TAP38型正交曲线）。此外，进一步的生化证据表明，TAP38（和STN7）使用pLHCII作为底物，这对于完整的状态转换的分子切割非常重要。

材料和方法

植物材料和生长测量

其他地方描述了植物繁殖和生长测量的程序[46]. The抽头38-2插入线（SALK_025713）在SALK集合中被标识[34](http://signal.salk.edu/)，而插入行抽头38-1（SAIL_514_C03）源自SAIL系列[33]。通过搜索插入侧数据库SIGNAL来识别这两条线(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress网站). 生成oeTAP38型行，的编码序列TAP38型克隆到植物表达载体pH2GW7（Invitrogen）中。用于补充抽头38-1突变体TAP38型基因组DNA及其天然启动子的1kb被连接到植物表达载体pP001-VS中抽头38-1采用上述浸花技术的突变体植物[47].抗潮霉素（oe）的转基因植物TAP38型)或巴斯塔除草剂（补充抽头38-1)，在控制条件下（PAR:80µmol m⁻²秒⁻¹，12/12小时暗/光循环）。oe的T2代水龙头38植物被用于所报道的实验。成功补充抽头38-1在促进状态转换的光照条件下，通过叶绿素荧光和LHCII磷酸化水平的测量证实了突变体。

TAP38 dsRED融合蛋白在细胞内的亚细胞定位拟南芥原生质体

的全长编码区域TAP38型该基因被克隆到载体pGJ1425中，位于编码dsRED序列的框架内和上游[32].分离、转染和荧光显微镜拟南芥原生质体按说明进行[48].

TAP38体外导入豌豆叶绿体

的编码区域TAP38型克隆到其SP6启动子区下游的pGEM-Teasy载体（Promega）中，并使用SP6 RNA聚合酶（MBI发酵剂）在体外生成mRNA。TAP38前体蛋白在网织红细胞提取系统（Flexi；Promega）中在[³⁵S] 蛋氨酸。将翻译反应的等分样品与完整的叶绿体孵育，如前所述，用嗜热菌素（钙生物化学）处理分离叶绿体后分析蛋白质摄取[49]对标记的蛋白质进行SDS-PAGE并通过磷光成像（台风；Amersham Biosciences）进行检测。

cDNA合成、半定量逆转录酶PCR和实时PCR

根据制造商的说明，使用RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）提取总RNA。根据制造商的说明，使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从1µg总RNA制备cDNA。对于半定量反转录酶PCR，将cDNA稀释10倍，并在20µl反应中使用3µl稀释液。热循环包括在95°C下初始步骤3分钟，然后在95°C下30次循环，每次10秒，在55°C下30次，在72°C下10秒。对于实时PCR分析，将3µl稀释cDNA与iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）混合。热循环包括一个初始步骤，在95°C下持续3分钟，然后是40个循环，在95℃下持续10秒，在55℃下持续30秒，在72℃下持续10s，然后进行熔化曲线。使用iQ5多色实时PCR检测系统（Bio-Rad）监测实时PCR。所有反应均一式三份，至少进行两次生物复制。

蛋白质分离和免疫印迹分析

如前所述，在10 mM NaF存在下，从4周龄叶片中制备总蛋白提取物和总叶绿体、类囊体和基质部分的蛋白质[48]，[50]如前所述，使用针对成熟TAP38蛋白的磷酸苏氨酸特异性抗体（细胞信号）或多克隆抗体进行免疫印迹分析[45].

蓝色-Native（BN）-PAGE和2D聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）

对于BN-PAGE，如上所述制备类囊体膜。将相当于100µg叶绿素的等分样品在4°C的增溶缓冲液（750 mM 6-氨基己酸；5 mM EDTA[pH7]；50 mM NaCl；1.5%洋地黄素）中溶解1 h。21000下离心1小时后克，如前所述，在4°C下通过非变性BN-PAGE对溶解材料进行分馏[38].

对于2D-PAGE，样品按上述方法用BN-PAGE在第一维度进行分级，然后按上述方法通过变性SDS-PAGE进行分级[51]使用Lumi Analyst 3.0（Boehringer）进行染色凝胶的密度分析。

态跃迁和77K荧光的测量

用脉冲幅度调制荧光法（PAM）测量状态转变[35]，[36]和77K荧光发射分析[12]，[37]通过在黑暗或远红光下培养获得适应状态1条件的植物，而状态2是通过红光或弱光诱导的。状态1和状态2的光诱导条件都以不同的组合使用，因为它们对状态转换产生相同的影响。此外，除了PAM荧光计配备了红色和远红光之外，没有什么主要的理由更喜欢一种灯光设置而不是另一种。对于状态转换测量，分析了每个基因型的五株植物，并计算了平均值和标准偏差。体内叶绿素一使用双PAM 100（Walz）测量单叶的荧光。红光脉冲（0.5 s）（5000µmol m⁻²秒⁻¹)用于确定最大荧光和比率（F_M（M）−F₀)/F类_M（M）=================================================================================F类_V（V）/F类_M（M）通过用红光（35µmol m）照射暗适应的叶片，测定叶绿素荧光因状态转换（qT）而熄灭的情况⁻²秒⁻¹，15分钟），然后测量状态2（F）下的最大荧光_M（M）2). 接下来，通过添加远红光（最大光强对应于Dual-PAM设置中的20级，15分钟）并记录F来诱导状态1_M（M）1.qT计算为（F_M（M）1−F_M（M）2） /前_M（M）1[36].

对于77K荧光发射光谱，用有利于激发PSII（80µmol m）的光照射植物后，记录类囊体的荧光光谱⁻²秒⁻¹，8小时）或PSI（740 nm波长的LED灯，4.6µmol m⁻²秒⁻¹，2小时）。如前所述，在存在10 mM NaF的情况下分离类囊体[11]使用Spex Fluorolog mod.1荧光计（Spex Industries）在475 nm激发，获得77K荧光光谱。记录了600到800 nm之间的发射，并将光谱归一化为相对于685 nm处的峰高。数据频率为0.5 nm，积分时间为0.1 s。

体外脱磷试验

pLHCII是从抽头38-1如前所述，通过蔗糖梯度超速离心获得类囊体[45]将成熟TAP38的cDNA序列克隆到pET151（Invitrogen）中，重组TAP38（recTAP38）在大肠杆菌带有N-末端-6x His-tag的菌株BL21。根据制造商的说明（Qiagen），按照Ni-NTA批量纯化程序，在变性条件下纯化recTAP38。如前所述，在10%三氯乙酸（TCA）中沉淀蛋白质，然后用无水乙醇进行三个洗涤步骤后，约500µg TAP38蛋白质再次悬浮在500µl的1%（w/v）十二烷基硫酸锂（LDS）、12.5%（w/v）蔗糖、5 mMε-氨基己酸、1 mM苯甲脒和50 mM HEPES KOH（pH 7.8）中[52]随后，将TAP38蛋白在100°C下煮沸2 min，然后在25°C下转移15 min。然后，添加二硫苏糖醇（DTT；75 mM最终浓度），并对溶液进行三次冷冻-解冻循环（在−20°C下20分钟，在−80°C下二十分钟，在-20°C下二十分钟，在冰水浴中解冻，在25°C下五分钟）。在完成三个冷冻-解冻循环后，添加辛基-吡喃葡萄糖苷（OGP；最终浓度1%[w/v]），并将溶液在冰上保持15分钟。然后，添加KCl（最终浓度75 mM）以沉淀LDS洗涤剂。在16000离心后克在4°C下持续10分钟，收集含有1%（w/v）OGP存在下折叠TAP38的上清液。随后，将1µl磷酸酶与对应于2µg总叶绿素的pLHCII一起培养。如前所述，在含有0.06%（w/v）十二烷基-D-麦芽糖苷、5 mM醋酸镁、5 mM-DTT、100 mM HEPES（pH 7.8）的50µl溶液中，在37°C下进行脱磷反应2小时[22]将反应混合物加载到SDS-PAGE上，并用磷酸苏氨酸特异性抗体进行免疫修饰，如上所述。

支持信息

图S1

插入等位基因 在4g27800 及其对剪接变异体表达的影响。（A） T-DNA插入在4g27800轨迹。三种拼接变体的不同编码序列用灰色方框表示。相应的5′和3′UTR以白色显示。内含子用细线表示。拼接变体见4g27800.1(TAP38型)和见4g27800.3由于在第9外显子中插入了四个额外的核苷酸见4g27800.3导致终止密码子。箭头（未按比例绘制）表示PCR分析中使用的引物对的位置。标记为1、2、3和4的引物序列为：At4g27800.1/TAP38-At4g27800.2-专用底漆（1号）：5′-ACATGGAAATGCAGCTTG;地址：4g27800.1/TAP38-At4g27700.2-At4g 27800.3（2号）：5′-GTGAAGACATCCATATGCCA公司;见4g27800.2-专用底漆（3号）：5′-AATACCCTCCTCAGCCTTC;见4g27800.3-专用底漆（4号）：5′-ACATGGAAATGCAGGCAA（B）半定量逆转录酶（RT）-PCR分析，以验证拟南芥WT离开。RT-PCR反应中使用的引物组合编号如（A）所示。泛素(UBI公司)作为相等负载的对照进行扩增（泛素正向引物：5′-GGAAAAGGTCTGACCGACA; 泛素反面：5′-CTGTTCACGGAACCCAATTC). 在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳代表性半定量RT-PCR反应（30个循环）的等分样品（10µl），以区分在4g27800.1(TAP38型)和见4g27800.2。请注意，对于见4g27800.3剪接变异体，无法获得信号。

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表S1

PSI和PSII之间的能量分布以730 nm和685 nm（F₇₃₀/F类₆₈₅).

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致谢

我们感谢保罗·哈代对手稿的批判性评论；以及索尔克研究所公开T-DNA插入线。

缩写

F类_M（M）1	状态1下的最大荧光
F类_M（M）2	状态2下的最大荧光
F类_V（V）/F类_M（M）	光系统II的最大量子产额
Φ_二	光系统Ⅱ的有效量子产率
标准	光合作用有效辐射
磅/平方英寸	光系统I
PSII（磅/平方英寸）	光系统II
qT（质量温度）	状态转换引起的叶绿素荧光猝灭程度
重量	野生型

脚注

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

这项工作得到了欧洲共同体（合同HPRN-CT-2002-00248[PSICO]项下的人类潜能计划）和德国Forschungsgemeinschaft（授予DL 1265/8和/9；SFB-TR1 B8）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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