《公共科学图书馆·生物》。2010年1月；8（1）：e1000296。
全球监管机构SATB1招募β-连环蛋白并调节TH（H）2以不同的方式区分
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1,2 ,1 ,1和1,*
酒窝Notani
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卡马尔维什努·戈蒂穆卡拉
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Ranveer S.Jayani公司
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阿米塔·利马耶
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Madhujit V.Damle公司
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萨米特·梅塔
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普拉巴特·库马尔·珀贝
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乔蒙·约瑟夫
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桑吉夫·加兰德
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罗埃尔·努斯，学术编辑
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美国斯坦福大学医学院，霍华德·休斯医学研究所
作者就其贡献发表了以下声明：构思和设计了实验：DN KPG SG。进行了实验：DNKPG RSJ AL SG。分析了数据：DN KPG-SM PKP SG。贡献的试剂/材料/分析工具：DNKPG-RSJ MVD SM JJ。撰写论文：DN SG。
2008年11月17日收到；2009年12月16日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
- 补充资料
GUID:98A75A45-3C71-49AA-BA04-BC46FEDD3EF2
图S2：
SATB1和β-连环蛋白在体内相互作用。（A） 通过将抗β-连环蛋白和抗SATB1抗体与等分Jurkat核提取物分别孵育，进行协同免疫沉淀反应，如材料和方法然后分别使用抗SATB1和抗β-catenin进行Western blot（WB）。IgH，免疫球蛋白重链。（B） 使用各自的抗体通过免疫印迹分析比较SATB1和β-catenin在HEK 293T、Jurkat和SW480细胞中的表达水平。在制备核提取物之前，用LiCl处理细胞24小时。免疫印迹分析显示，SATB1在HEK 293和Jurkat细胞（1、2道）中内源性表达，而在SW480细胞（3道）中不表达。β-catenin在所有三个细胞系（4-6道）中表达；然而，其表达水平在SW480细胞中最高。（1.58 MB畅通节能法）
GUID:38BB11D3-0E0F-4382-AF52-71F616DCFD0F
图S3：
用于体外下拉的蛋白质的定性分析。考马斯染色凝胶描绘了GST下拉实验中使用的各种GST-β-catenin（3–5、9、10道）和SATB1（13、14道）截短物的纯度。His-SATB1对应于6×组氨酸标记的全长SATB1，CD+HD是SATB1的C末端一半，包含DNA结合区域，而PDZ表示SATB1的N末端1–204氨基酸包含其PDZ样信号结构域。（0.24 MB畅通节能法）
指南：E56B15A4-364-4A67-817A-96067062b8a
图S4：
β-连环蛋白激活SATB1介导的转录。如以下所述，在MAR-连锁报告物分析中监测SATB1和组成活性突变体β-连环蛋白（T41A）过度表达的功能后果：材料和方法IgH-MAR-核糖核酸酶结构由IgH-MA的25 bp富含AT-的核心的七个拷贝组成[62]是SATB1的高亲和力结合位点[23],[24]在pGL3Basic载体（Promega）中克隆。IgH-MAR本身促进荧光素酶的转录[30]已知SATB1与该元素结合并抑制相关报告子的转录[17]每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。（0.10 MB畅通节能法）
GUID:E5D9F33B-3D8C-44F8-A39D-FBFC420055EB
图S5：
从新生儿胸腺中分离出人类胸腺细胞，如材料和方法并如所述与OP9或OP9-DL1细胞共同培养
[63]
.简而言之，胸腺细胞在补充有10%FCS的RPMI 1640培养基（Invitrogen）和Wnt3a（10µg/ml）（Wnt激动剂）或DKK1（100 ng/ml）（Wnt抑制剂）的OP9或OP9-DL1细胞单层上培养48小时。共同培养还补充了rIL-7（5 ng/ml）和FlT3配体（5 ng/ml）（研发系统）。（A） 48小时后采集细胞，使用标准方案通过MTT分析监测细胞活力。简单地说，将噻唑蓝四唑溴化物（USB）以1 mg/ml的浓度添加到胸腺细胞培养物中，并孵育1 h。通过离心收集细胞，将细胞颗粒重新悬浮在二甲基亚砜中，并在570 nm处进行测量。将吸光度读数转换为存活率百分比，并将对照未处理细胞的存活率标准化为100%。（B） 在共培养48小时后，用台盼蓝染料排除法评估细胞死亡。在相应时间点后采集胸腺细胞，并将其重新悬浮在PBS中。向细胞悬浮液中加入少量0.4%Tryan蓝，并在室温下培养5分钟。然后使用血细胞仪观察细胞，并对因活性染料排斥而未内化染料的细胞进行计数并换算成存活率。对照未经处理的细胞的存活率标准化为100%。如（A）和（B）所示，经Wnt3a或DKK1处理并与对照OP9或OP9-DL1细胞共同培养的胸腺细胞的活力没有显著差异。（C，D）Wnt信号对典型Wnt调节基因BCL-X转录状态的影响L（左）（C） 胸腺细胞中的PP2A（D）。如上所述，胸腺细胞与对照OP9或OP9-DL1细胞共同培养。使用从对照人类胸腺细胞和用Wnt3a或Dkk1处理48小时的胸腺细胞中提取的RNA进行定量RT-PCR分析，如材料和方法。与未经处理的对照组相比，处理细胞中的基因表达值被标准化，设置为1。右边的颜色键表示各种处理和共培养。（0.39 MB畅通节能法）
指南：FB74A408-9ED3-4227-8128-2f7de3754dd
图S6：
多基因调控区的SBS分析。EMSA分析使用32P标记的上游监管区域来自中国,PPM1A（PPM1A）,c-Myc公司基因，以及BCL2级纯化的GST用作GST:SATB1融合蛋白的对照。从1 kb上游区域测试的多个区域中国和PPM1A（PPM1A）示意性地描绘在EMSA面板的顶部。两个区域（一个位于近端中国启动子和远端一个PPM1A（PPM1A）启动子）以非常高的浓度结合SATB1，这表明亲和力非常低。恒星表示SBS，而圆圈表示非结合区域。左下角的面板描述了重组SATB1与32包含人类−1183至−1383 bp的P标记区域c-Myc公司发起人。（0.72 MB畅通节能法）
GUID:1AE61BA1-DB95-46F8-B823-742D2A8A2A5A
图S7：
SATB1和β-catenin占据
白介素-2
和
c-Myc公司
体内启动子。（A） Jurkat细胞的ChIP-PCR分析显示SATB1和β-catenin在白介素-2LiCl存在（+）和不存在（−）时的启动子。按照中所述进行ChIP分析材料和方法LiCl治疗导致在IL-2启动子SBS处SATB1的占有率增加，随后可能在该位点招募β-catenin。用于ChIP的抗体显示在车道顶部。（B） 对使用Wnt激动剂BIO处理的Jurkat细胞进行ChIP-PCR分析，如材料和方法SATB1和β-catenin均占据人体SBSc-Myc公司在这些条件下（顶面板，第2和第3车道）。上游区域（−10 kb）c-Myc公司用作ChIP（下面板）的阴性对照。（0.11 MB畅通节能法）
GUID:0304F738-7E08-4E96-9AA5-B54B75355585
图S8：
SATB1在体外不与TCF共识相结合。使用重组SATB1的TCF共有结合位点的体外结合分析通过EMSA进行，如材料和方法各面板使用32P标记的野生型（1-5道）和突变TCF（6-10道）共有序列。32P-标记的IgH-MAR被用作SATB1结合的阳性对照（11–15车道）。（0.18 MB畅通节能法）
GUID:29EB2AF7-FA67-4E88-A799-C91DE083AED8
图S9：
CD4极化的确认+T细胞到TH（H）1和TH（H）2个子集。T细胞培养上清中标志性细胞因子的定量H（H）使用复合珠阵列读取器同时进行72 h的细胞生长，如材料和方法正如预期的那样，TH1细胞产生IFN-γ和IL-12，而TH（H）2个细胞产生IL-4，证实这些细胞属于各自的谱系。（5.36 MB畅通节能法）
GUID:BF58C460-8225-4533-8300-518C9B8A2CE6
图S10：
c-Maf在T细胞分化中的表达分析H（H）细胞。天真的CD4+用双重siSATB1、siβ-catenin或SATB1过表达质粒DNA转染T细胞，并按材料和方法作为对照，转染双链干扰RNA（Scr）。极化72小时后，分离出总RNAGATA-3协议转录物通过定量RT-PCR进行分析，如材料和方法在这些细胞中，c-Maf的表达与β-actin的表达相一致。该图显示了对照组（Scr）中c-Maf转录物的相对变化（bars 1和5）、SATB1沉默（bars 2和6）、SATB1-过度表达（bars 3和7）和β-连环蛋白沉默（bars-4和8）TH（H）0（钢筋1-4）和TH（H）2个（5–8条）电池。根据干扰RNA转染的T细胞计算表达水平的变化H（H）c-Maf表达水平设置为1（bar 1）的0子集。每个误差条代表三倍计算的标准偏差。天真的CD4+用双重siSATB1、siβ-catenin或SATB1过表达质粒DNA转染T细胞，如材料和方法和所述的体外分化[26]作为对照，转染双链干扰RNA（Scr）。极化72小时后，分离出总RNAGATA-3协议转录物通过定量RT-PCR进行分析，如材料和方法.GATA-3协议β-actin在这些细胞中的表达正常化。该图显示了折叠变化GATA-3协议对照转录物（Scr）（bar 1）、SATB1沉默（bar 2）、SATB1-过度表达（bar 3）和β-连环蛋白沉默（bar 4）TH（H）2个单元格。计算干扰RNA转染T的折叠变化H（H）0子集，其中GATA-3协议将表达水平设置为基线（条1）。每个误差条表示从三个样本中计算出的标准偏差。（0.11 MB畅通节能法）
GUID:8D2108A9-D8FD-4E3E-B3B0-4F91072B44D8
图S11：
IL-4在siRNA介导的SATB1沉默诱导T细胞分化中下调H（H）2个单元格。人CD4+用Scrambled（Scr）和si-SATB1合成双链RNA转染T细胞，然后极化为T细胞H（H）如中所述材料和方法72小时后，收集细胞并用于监测IL-4的表达。（A） IL-4基因表达谱。总RNA被分离出来，IL-4转录物被RT-PCR分析，如材料和方法GAPDH的表达作为RT-PCR中RNA量的对照。（B） CD4+T细胞在TH（H）在2种条件下培养3天后收获细胞。在收获细胞前4小时，将布雷费尔丁A添加到培养基中。在室温下使用1%多聚甲醛将细胞固定20分钟。然后用0.5%皂苷使细胞渗透，并用抗IL-4-PE偶联物（BD Biosciences）染色30分钟。用流式细胞仪（BD FACS Calibur）采集染色细胞，并用CellQuest软件（BD bioscience）进行分析。（1.96 MB TIF）
GUID:B2ACB3EE-7C9D-4F2A-AD6E-532861414AE3
图S12：
上游监管区域分析
GATA-3协议
.体外结合分析GATA-3协议使用重组SATB1的启动子由EMSA执行，如材料和方法SATB1在2 kb（+1至−2000 bp）上游调控区的结合GATA-3协议通过使用监视32该区域的P标记片段。我们重点研究了在−900到−600 bp的区域中的高亲和力SBS和在上游区域中包含人类−1800到−1500 bp的非SBSGATA-3协议发起人。EMSA面板顶部的示意图描述了启动子内这些区域的相对位置。星号表示SBS的位置，而圆圈表示非结合位点。（0.25 MB TIF）
GUID:C01454D1-0C0B-4AE1-9F4A-AA1A10DDA35A
表S1：
基因和基因ID列表。本文中研究或提及的基因及其各自的基因ID被制成表格。（0.05 MB DOC）
GUID:A0490E49-BEE0-4317-9089-9969E6354EBF
视频S1：
SATB1和β-连环蛋白在小鼠胸腺细胞的细胞核中共定位。三重染色免疫荧光图像（Alexa 488、Alexa 546和DAPI）。胸腺细胞核用DAPI进行复染，以标记细胞核中DAPI强区和弱区。这部电影描绘了与。使用AxioImager Z1立式荧光显微镜（卡尔蔡司）的“Apotome”模块以0.2µm的间隔捕获图像的光学部分。使用反褶积软件（Carl Zeiss）中的逆定理对图像进行进一步处理。这两种蛋白质的“笼状”染色模式包围着异色斑点，至少在整个胸腺细胞核部分重叠。（0.05 MB WMV）
GUID:218EB3E8-36A7-4D8E-8A54-D3CA7D1DD7AC
视频S2：
β-catenin在小鼠胸腺细胞核内形成一种典型的“笼状”亚结构。单染色免疫荧光图像（Alexa 488）。这部电影描绘了与。如上所述，使用Apotome模块（卡尔蔡司）拍摄图像。β-catenin染色模式明显类似于SATB1的“笼状”分布特征。（0.04 MB WMV）
GUID:18A11935-760F-4359-BFA6-B4BC4AD219CA
染色质组织者SATB1和Wnt转导子β-catenin形成复合物并调节GATA3和T的表达H（H）2种细胞因子以Wnt依赖的方式并协调TH（H）2血统承诺。
摘要
在脊椎动物中，保守的Wnt信号级联促进β-catenin的稳定和核积累，然后与淋巴增强因子/T细胞因子蛋白（LEF/TCFs）结合以激活靶基因。Wnt/β-catenin信号对T细胞的发育和分化至关重要。在这里，我们显示了特异性的富含AT的结合蛋白1（SATB1），即T血统丰富的染色质组织者和全局调节器，与β-连环蛋白相互作用并将其招募到SATB1的基因组结合位点。基因表达谱分析显示，受SATB1抑制的基因在Wnt信号传导时上调。SATB1和TCF之间的竞争影响TCF调节基因对β-catenin信号的转录。GATA-3是T辅助类型2（TH（H）2） 调节T生成的特异转录因子H（H）2种细胞因子和作为T的功能H（H）2谱系决定簇。SATB1正调控GATA-3协议和siRNA介导的SATB1基因敲除下调GATA-3协议分化人CD4的表达+T细胞，表明SATB1影响TH（H）2通过重新编程基因表达的谱系承诺。在Wnt信号传导抑制剂Dickkopf 1（Dkk1）的存在下，GATA-3下调，信号T的表达下调H（H）IL-4、IL-10和IL-13等细胞因子减少，表明Wnt信号对TH（H）2分化。β-catenin的敲除也产生了类似的结果，证实了Wnt/β-catening信号在T细胞中的作用H（H）2分化。此外，染色质免疫沉淀分析显示，SATB1在GATA-3协议T分化启动子H（H）2个细胞，Wnt依赖。SATB1坐标TH（H）2通过重新编程基因表达的谱系承诺。SATB1:β-catenin复合体激活了许多SATB1调节基因，因此本研究有潜力发现新的Wnt应答基因。这些结果表明，SATB1协调了TH（H）2通过介导Wnt/β-catenin信号传导的谱系承诺。本报告确定了一种参与β-catenin信号传导的新的全球转录因子，该转录因子可能在发育、分化和肿瘤发生过程中对该信号传导途径的功能结果起主要作用。
作者摘要
在脊椎动物中，典型的Wnt信号在β-catenin进入细胞核并激活靶基因转录时达到顶峰。Wnt/β-catenin信号对胸腺成熟和幼稚T细胞分化至关重要。这里我们显示，SATB1，一种T细胞系丰富的染色质组织者和全局调节器，与β-catenin结合，并将其招募到SATB1的基因组结合位点，从而使先前受SATB1抑制的基因受到Wnt信号的上调。已知受SATB1调控的一些基因（如编码细胞因子和转录因子GATA3的基因）是Th2细胞分化所必需的，Th2细胞是辅助T细胞的一个重要亚群。具体来说，我们发现siRNA-介导的SATB1敲除下调GATA-3协议分化人CD4的表达+T细胞。抑制Wnt信号导致GATA-3和T信号的下调H（H）2种细胞因子，如IL-4、IL-10和IL-13。β-catenin的敲除也产生了类似的结果，因此这些数据共同证实了Wnt/β-catening信号在T细胞中的作用H（H）2分化。我们的数据表明，SATB1协调了TH（H）2通过调节Wnt/β-catenin信号传导的谱系承诺。
介绍
Wnt生长因子通过改变特定的基因表达模式来调节多种发育过程[1]Wnt蛋白是一种分泌分子，通过与Frizzled（Fz）跨膜受体家族的一个成员结合来协调许多不同细胞类型中的细胞间相互作用[2]Wnt与Fz的绑定(表S1)引发一系列复杂的分子事件，最终抑制负调控激酶GSK-3β[3]GSK-3β对β-catenin的磷酸化作用通过β-TrCP泛素连接酶-蛋白酶体途径使其降解[4]去磷酸化β-连环蛋白在细胞核内积聚[5]其中它与淋巴增强因子/T细胞因子（LEF/TCF）转录因子结合以诱导靶基因转录[6]在脊椎动物中，β-连环蛋白作为一种转录激活物，需要它来克服阻遏物复合体的转录抑制[7]β-catenin的C末端对转录激活功能是不可或缺的，可能是因为它含有转录辅激活物如p300/CBP和TBP的结合位点[7],[8]因此，在TCF的基因组靶点上招募染色质重塑因子来调节基因转录似乎是稳定的β-连环蛋白的主要功能[8].
在胸腺中，胸腺细胞成熟涉及一系列离散的表型阶段，这些阶段对应于发育检查点，随后被称为CD4−CD8（CD8）−（DN），CD4+CD8（CD8）+（DP）和CD4+CD3（CD3）+或CD8+CD3（CD3）+（SP）。除了研究充分的T细胞受体（TCR）介导的信号和Notch通路外，胸腺上皮细胞还通过产生Wnt促进胸腺细胞的发育和分化[2],[9]Wnt信号在T细胞发育中的作用突出表现为可溶性Fz受体在DN-DP过渡期的胎儿胸腺器官培养中阻止早期胸腺细胞发育[10]此外，T细胞β-连环蛋白的消融导致β-选择不良，T细胞发育的DN阶段受损[11]SP细胞进一步分化为各种功能性T细胞群，如T辅助细胞（TH（H）)单元格。在抗原刺激下，幼稚的CD4+吨H（H）细胞分化为不同的效应细胞谱系，称为TH（H）1和TH（H）2.这种分化由信号蛋白如STAT4和STAT6介导，并伴随着标记转录因子如GATA-3和c-Maf在T细胞中的上调H（H）2个细胞和T中的T-betH（H）1个单元格[12]转录因子GATA-3和T-bet决定CD4的分化+T细胞转化为TH（H）2和TH（H）分别为1种电池类型[13],[14]然而，尽管各种转录因子和信号通路对TH（H）细胞分化已经被广泛研究，没有报告显示Wnt信号在T细胞分化中的直接作用H（H）细胞分化。
T系丰富染色质组织特异性富AT-序列结合蛋白1（SATB1）被证明通过选择性地将基质连接区（MAR）连接到核基质上来调节远距离基因[15]此外，SATB1作为几个染色质修饰物的“对接位点”，包括ACF、ISWI和HDAC1[16],[17]这些染色质修饰物被认为通过组蛋白去乙酰化和核小体重塑抑制SATB1结合的MAR的基因表达[16]SATB1组织T助手2（TH（H）2） 通过将MAR固定距离连接到核基质，细胞因子和MHCⅠ类基因座进入不同的染色质环[18],[19]SATB1组织的密环和转录活性染色质结构对T的协调表达至关重要H（H）2个细胞因子基因[18]此外，SATB1似乎在转录平衡染色质的动态组织中发挥作用[20]SATB1还通过向启动子招募各种染色质修饰物来调节基因表达[21]SATB1和伴侣蛋白之间的相互作用通常由其N末端PDZ样结构域介导，这对SATB1同源二聚体化也很重要[22],[23]此外，SATB1在其C末端半部分具有一个MAR结合域，该域包含一个剪切域（CD）和一个同源域（HD），共同促进MAR的识别和高亲和力结合[23],[24]SATB1调节大量参与T细胞增殖、发育和分化的基因[21],[25]SATB1本身在T的不同亚群中有差异表达H（H）细胞[26]然而，SATB1在其分化中的作用尚未得到证实。有趣的是，SATB1的许多靶基因，如c-Myc公司
[15]和Bcl-2型
[27]也被Wnt/β-catenin靶向[28]表明Wnt/β-catenin途径和SATB1之间存在功能重叠。
在这项研究中，我们着手揭示导致SATB1和β-catenin途径之间功能重叠的分子机制，特别是在其靶基因调控方面。我们发现SATB1与β-连环蛋白发生物理相互作用，并将其招募到其基因组靶点。有趣的是，根据Wnt/β-catenin信号传导，SATB1的脱乙酰化导致其在基因组靶点上的占有率增加。β-catenin的招募改变了胸腺细胞中SATB1靶基因的转录。对多基因启动子中SATB1结合位点（SBS）的染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，与β-连环蛋白的相互作用通过增加其占有率和改变组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）乙酰化来调节SATB1在其靶基因上的功能。β-catenin-responsive基因也被SATB1靶向，表明两者在Wnt/β-catentin信号通路中具有功能联系。此外，β-catenin诱导的TCF应答基因在SATB1过度表达时失调，这表明TCF/LEF和SATB1与β-catening之间存在竞争性相互作用。此外，SATB1直接调节GATA-3的表达并指示TH（H）2通过Wnt/β-catenin信号传导的谱系承诺。作为消除SATB1或β-catenin或Wnt信号功能的功能结果，我们证明了信号T的产生H（H）IL-4、IL-10和IL-13等2种细胞因子减少，表明TH（H）2分化受到影响。因此，这些研究将SATB1确定为T的决定因素H（H）2 Wnt/β-catenin信号通路中的分化和下游效应器。
结果
SATB1通过其N端PDZ样结构域与β-连环蛋白的C端相互作用
表达SATB1磷酸化或乙酰化缺陷突变体的细胞的基因表达谱[21]指示与β-catenin信号通路共享的靶基因(图S1). SATB1在胸腺细胞中大量表达[15]因此，我们监测了Wnt诱导后胸腺细胞中β-catenin和SATB1的亚细胞定位。令人惊讶的是，β-catenin的核内免疫染色模式也类似于胸腺细胞中SATB1核结构域的“笼状”结构(,视频S1和S2系列)[15]光学切片显示，这些信号中至少有一部分在细胞核的深处共定位，表明它们在胸腺细胞核内占据相似的区域(). 为了测试SATB1和β-连环蛋白是否存在物理相互作用，我们使用固定的β-连环素进行体外下拉。当SATB1通过GST-β-catenin和固定在Sepharose珠上的GST时，SATB1从GST-α-catenin-亲和矩阵中特异洗脱，表明它们之间存在物理相互作用(). 利用Jurkat T淋巴细胞核提取物进行免疫共沉淀分析表明，β-catenin和SATB1可以通过抗体相互免疫沉淀(图S2). 然后，我们测试了Wnt信号传导对SATB1和β-连环蛋白的物理关联的影响。氯化锂和6-溴代二脲-3′-肟（BIO）是有效的GSK-3β抑制剂，通过稳定β-连环蛋白模拟Wnt信号[29]经BIO治疗后，在人类胸腺细胞中观察到相互作用增加(). 使用各种截短和标记蛋白质的体外下拉实验(图S3)表明SATB1的PDZ样结构域和β-catenin（577–781个氨基酸）的羧基（C）末端区域对于这种相互作用是必不可少的(). 此外，β-catenin与Flag:PDZ（1–204 aa）而非Flag:CD+HD（330–763 aa）的体内联合免疫沉淀表明，β-catanin与SATB1的PDZ样结构域相互作用(). 这种相互作用非常特殊，因为Flag-PDZ的表达比Flag:CD+HD的表达至少少5倍(，比较车道5和6）。最后，基于荧光素酶报告子的哺乳动物双杂交试验进一步独立证实SATB1的PDZ样结构域参与了其与体内β-连环蛋白的相互作用。尽管β-catenin C末端区域的过度表达本身导致了反式激活(，bar 5），随着PDZ样结构域的出现，报告人的活动进一步增强（bar 9），表明他们之间存在功能关联。为了进一步评估β-连环蛋白的C末端区域对其与SATB1相互作用的参与，我们产生了β-连环蛋白的缺失构建体，其中N末端包含截短的aa 1–137，C末端包含截短的aa 666–781。GST下拉分析显示，包含β-catenin的aa 577–781的C末端区域对其与SATB1的相互作用很重要，使用1–137 aa和666–780 aa区域的免疫沉淀数据也证实了极端C末端（666–78 1 aa）在这种相互作用中的重要性(). 总之，这些结果表明SATB1的N末端PDZ样结构域与β-catenin的C末端区域相互作用，并且这种相互作用发生在细胞核中。
SATB1和β-连环蛋白之间物理相互作用的描述。（A） SATB1和β-连环蛋白在胸腺细胞核内共定位。使用SATB1（红色）和β-连环蛋白（绿色）抗体对胸腺细胞进行间接免疫荧光染色，如材料和方法用DAPI（蓝色）进行DNA复染。剖视图面板描绘了三染色胸腺细胞的两个垂直横截面，如白线所示，在最亮的荧光信号点相交。（B） SATB1和β-catenin之间的直接相互作用通过体外下拉试验进行监测，如材料和方法.35S-标记的SATB1在与固定化GST-β-catenin（通道3）孵育后被特异性地拉下，而与对照固定化GST（通道2）孵养后没有被特异性拉下。（C） 通过进行共免疫沉淀分析评估SATB1和β-catenin的体内相互作用，如材料和方法使用抗β-catenin免疫沉淀来自BIO处理（+）和对照（-）人类胸腺细胞的核提取物，然后使用WB和抗SATB1免疫沉淀。（D） 通过体外下拉实验绘制SATB1和β-catenin的相互作用区域。通过传递GST-β-catenin固定结构域上的Jurkat核提取物（1-6道）和SATB1固定结构域（7-11道）上的SW480核提取物（包括全长蛋白质，然后是WB和抗SATB1和抗β-catentin），进行SATB1和β-catelin的GST下拉。所使用的SATB1和β-catenin截断如左图所示。实心黑色条表示各自的交互区域。（E） 使用抗Flag抗体对过度表达3XFlag-SATB1及其功能域的HEK 293T细胞提取物进行共免疫沉淀分析，然后使用WB和抗β-catenin（1–3区）。WB使用反标记法监测SATB1 3XFlag-fuse结构域的表达水平（4–6区）。（F） 采用哺乳动物双杂交试验对HEK 293T细胞中的蛋白质相互作用进行评分[23]使用CheckMate哺乳动物双杂交系统（Promega）的pACT和pBIND载体，将β-catenin的C末端和SATB1的PDZ样结构域表达为与VP-16和GAL4-DBD的融合。将pBIND和pACT融合构建物与含有4×GAL4反应元件的报告载体pG5-Luc一起转染，并将荧光素酶活性与对照组进行比较。误差条表示从三倍计算的标准偏差。（G） β-catenin的C末端而非N末端参与其与SATB1的相互作用。β-catenin的VP-16融合C端（aa 666–780，1区）和N端（aa1–137，2区）区域在HEK 293T细胞中过度表达。共免疫沉淀按材料和方法使用抗SATB1，然后使用抗β-catenin的WB。
β-儿茶素在Wnt信号传导中的募集改变SATB1和Wnt靶基因的转录
为了研究SATB1和β-连环蛋白是否在功能上协同作用，我们监测了SATB1和α-连环素相互作用对SATB1介导的基因表达的影响。在体内报告试验中，我们使用了一种结构，在该结构中，来自IgH位点的特征良好的SATB1结合MAR被克隆到无启动子载体中[30]β-catenin的过度表达增强了野生型IgH-MAR驱动的荧光素酶报告活性，但没有增强突变型IgH MAR的报告活性，这表明这种作用是由SATB1介导的(图S4). 报告研究中使用的β-catenin的T41A突变不能被GSK-3β磷酸化[31]因此构成稳定和激活。接下来，我们监测了SATB1：β-catenin相互作用对多个已知为SATB1靶基因转录的影响[21]以及未成熟T细胞中的Wnt信号[32]用可溶性Wnt3a配体处理人类胸腺细胞48 h，诱导其Wnt信号传导，并用定量RT-PCR监测SATB1靶点的转录活性。在长时间悬浮培养中，已知胸腺细胞会经历细胞死亡。然而，在培养48小时以上的治疗过程中，即使没有使用OP9-DL1共培养系统，胸腺细胞的活性也没有显著降低(图S5A). 在胸腺细胞培养中添加Wnt3a诱导Wnt信号传导后，多个Wnt和SATB1应答基因的转录状态被逆转(，巴2）。因此，SATB1下调的基因，如BCL-2型
[27],中国,PPM1A（PPM1A）,c-Myc公司、和白介素-2
[21]β-catenin过度表达或以类似于已知Wnt靶点的方式添加Wnt3a后上调FOSB公司和BCL-X公司L（左）
[32]表明这些也是β-catenin靶点。此外，Dickkopf 1（Dkk1）治疗对Wnt信号的抑制导致所有SATB1调节基因的转录抑制，这些基因也被Wnt信号靶向(，巴3）。在SATB1调节基因中，ThPOK公司（ZBTB1-7B）表现出相互调节的模式。Wnt3a处理后ThPOK下调，而Dkk1抑制Wnt信号时ThPOK显著上调（超过20倍）。在胸腺细胞已知的Wnt靶点中，很少有基因如TRAIL（跟踪）和PP2A型
[32]Wnt3a处理下调，Dkk1处理上调。更重要的是，TIMP1公司既不被SATB1靶向，也不被β-catenin靶向的胸腺细胞Wnt3a或Dkk1治疗不会影响其作用，这表明这种作用对SATB1和Wnt/β-catentin靶向是特异的().ERBB2号机组是SATB1的靶点，但不是β-catenin的靶点。因此，Wnt3a治疗不会对其产生影响，进一步证明为了克服SATB1介导的抑制，SATB1:β-catening功能相互作用对SATB1基因组靶点至关重要(). 使用胸腺细胞与补充IL-7和Flt3配体的OP9-DL1细胞共同培养进行基因表达分析，结果表明Wnt的转录靶向PP2A和BCL-X公司L（左）与在对照OP9细胞上培养的细胞没有显著差异(图S5B). 这些结果表明，在所采用的培养条件下，对基因表达的影响并不是由于这些处理对胸腺细胞活力的不同影响。因此，与β-catenin的相互作用会显著改变SATB1调节基因的转录状态，其中许多也是已知的Wnt靶点。为了研究SATB1如何直接调控这些基因的表达，我们进行了体外结合试验，以评估SATB1在这些基因的不同调控区域上的结合状态，并观察到SATB1与多个基因上游1kb区域内的至少一个位点结合(图S6). 为了确认转录上调是否由SATB1和SATB1招募的因子介导，我们对这些基因的启动子进行了ChIP分析。从未经处理的对照、Wnt3a或Dkk1处理的人类胸腺细胞中分离出染色质，并使用SATB1、β-catenin、p300和H3K9乙酰化（H3K9Ac）抗体进行免疫沉淀。用寡核苷酸引物侧翼的上游1kb调控区的不同区域对从免疫沉淀中纯化的DNA进行PCR扩增中国,PPM1A（PPM1A）、和白介素-2启动子和SBS位于BCL2级
[27]ChIP分析显示，体内SATB1并非占据了所有体外结合位点(). 引人注目的是，在Wnt3a处理后，SATB1在受SATB1下调的基因启动子上的占有率增加了1.5到4倍。这种占有率的变化是Wnt信号的结果，因为Dkk1治疗导致体内结合位点上SATB1占有率减少1.5到6倍(). β-catenin、p300和H3K9Ac的占用变化也反映了SATB1的变化，表明SATB1占用是导致β-catening和p300补充的主要事件(). 占用率的这些变化具有高度的特异性，并且仅限于SBS，因为近端区域中国和远端PPM1A（PPM1A）在体外和体内未与SATB1结合的启动子在SATB1、β-连环蛋白和p300的占有率方面没有任何显著变化(). 因此，Wnt信号导致SATB1在其靶基因上的占有率增加，然后招募β-catenin和p300上调靶基因。
Wnt信号通过招募β-catenin300复合物导致SATB1靶基因上调。（A） Wnt信号对胸腺细胞中典型SATB1调节基因（上排）和Wnt调节基因（下排）转录状态的影响。使用从对照人类胸腺细胞（bar1）和用Wnt3a（bar2）或Dkk1（bar3）处理48小时的胸腺细胞中提取的RNA进行定量RT-PCR分析，如材料和方法。与未经处理的对照组相比，处理细胞中的基因表达值被标准化，设置为1。每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。TIMP-1公司和ERBB2号机组作为控制基因，TIMP-1不受SATB1和β-catenin的调节，而ERBB2作为SATB1依赖性基因[49]而β-catenin-非依赖性控制基因。（B） SATB1调控基因1 kb上游调控区中SATB1、β-连环蛋白、p300乙酰转移酶和H3K9乙酰化的占有率Bcl-2型,PPM1A（PPM1A）,中国、和白介素-2通过ChIP分析监测。从对照、Wnt3a或Dkk1处理的人类胸腺细胞中分离出染色质，并按照材料和方法。通过进行定量实时PCR分析并将C类
吨带有输入和IgG控件的值。每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。通过ChIP分析的区域在各自基因中的相对位置在它们的占有率剖面图上方以图解方式表示。星形表示体外SBS，而圆圈表示非结合位点。基因的名称在每一列图的下方，而用于ChIP的抗体的名称则在每一行的右侧。
SATB1和β-连环蛋白之间的直接相互作用是其转录效应所必需的
为了确定Wnt信号的转录调控是SATB1和β-catenin相互作用的直接结果还是它们相互作用的间接影响，我们使用了β-catentin的缺失结构，其中C末端删除截断（ΔC-term）由aa 1–576和aa 577–780构成的唯一C终点港。我们测试了这种相互作用区域的过度表达是否对SATB1和β-catenin相互作用起主导负作用的可能性。为此，我们在人类胚胎肾（HEK）-293T细胞中过度表达了作为红色荧光蛋白（RFP）融合物的β-catenin的1–576和577–780区域，并通过添加LiCl诱导β-catentin信号传导。SATB1免疫沉淀和抗β-连环蛋白免疫印迹分析证实，它们在氯化锂处理的细胞中形成复合物(，车道1）。然而，当C末端（577-780）过度表达时，内源性β-连环蛋白不再与SATB1相关，如免疫共沉淀试验中缺乏信号所证明的那样(，车道3）。ΔC项（1–576）的过度表达并未导致内源性β-catenin的位移(，车道2）。这一结果表明，内源性全长β-连环蛋白和β-连环素过度表达的C末端相互竞争，与SATB1结合；因此，后者对它们的关联起着主导性的负面作用。有趣的是，在这种条件下的定量RT-PCR分析减少了稳定β-连环蛋白对c-Myc公司已知受SATB1抑制[15]然而，ΔC项β-catenin的过度表达并没有改变c-Myc公司(). 因此，C-末端的过度表达改变了β-catenin对体内SATB1靶点转录的影响。为了研究这种作用的分子机制，我们测试了SATB1和β-catenin在c-Myc公司发起人。ChIP分析证明了SATB1和β-catenin在c-Myc公司启动子在体内，但不在起始位点上游10kb的另一个区域(图S7). 接下来，我们在HEK 293T细胞中独立地过度表达VP16融合的β-catenin截短片段1–137和666–780，分别代表其极端N端和C端，然后用LiCl处理24小时。β-catenin的极端末端区域在本试验中过度表达，以避免与臂重复序列（如TCF）相互作用的蛋白质的任何干扰。使用SATB1和β-catenin抗体进行ChIP分析，然后进行定量ChIP PCR，结果表明β-catentin（666-780）C末端区域的过度表达导致β-catening在c-Myc公司SBS公司(，杆6）。相反，β-catenin（1–137）N末端区域的过度表达并没有发挥同样的作用(，巴5）。由于此处使用的抗β-catenin表位仅跨越N末端区域，我们使用VP16融合标签的抗体来监测C末端是否确实被SATB1招募。定量ChIP PCR使β-catenin的C末端在c-Myc公司SBS公司()为全长β-catenin的体内移位提供了有力证据。接下来，我们在级联TCF结合位点驱动的报告子TOP-Flash及其非TCF结合突变体FOP-Flash的控制下监测转录活性[33]有趣的是，尽管SATB1并不直接绑定到一致的TCF绑定位点(图S8)，SATB1的过度表达导致TCF报告子驱动转录的抑制(，比较杆1和2），表明SATB1可能与TCF竞争形成β-catenin复合物。引人注目的是，SATB1的沉默上调了TCF-驱动的转录（bar 3），当β-catenin同时过度表达时，这种转录会显著诱导，这表明SATB1在体内滴定β-catentin中的作用(，巴8）。报告活性的增加明显高于单独使用β-连环蛋白（bar 4）。我们使用β-catenin的T41A组成活性突变体进行TCF报告分析。接下来，我们使用如上所述的β-catenin的RFP融合N项（1–576）和C项（577–780）区域来测试Wnt响应报告活性是否是SATB1和β-catentin相互作用的直接结果。与TCF相互作用但不与SATB1相互作用的N项（1–576）β-catenin的过度表达上调了TCF报告者的活性，尽管上调幅度低得多（bar 5）。β-catenin的臂重复序列区域的激活作用可以通过其隔离抑制TCF-β-catentin相互作用的抑制剂（如ICAT）的能力来解释。然而，当只过度表达与SATB1相互作用但不与TCF相互作用的β-catenin的C末端区域（577–780）时，报告活性被完全消除（bar 6），可能是由于内源性p300滴定所产生的主要负效应。这种相互作用可能导致CBP/p300与TCF反应元件上的TCF:β-catenin复合体结合的可用性降低，从而导致TCF和β-catentin之间的非功能性相互作用。或者，当β-catenin的C末端过度表达时，内源性全长β-catentin池可能无法与TCF结合并随后激活靶基因，而可能只是被翻转过来。总之，这些发现提供了直接证据，证明SATB1-β-catenin相互作用是介导Wnt依赖性效应对靶基因表达的必要条件。
SATB1和β-catenin之间的直接相互作用对靶基因调控至关重要。（A） 截短β-catenin（577–780 aa）的过度表达竞争性地克服了SATB1与内源性全长β-catening的关联。使用LiCl处理的HEK 293T细胞的提取物和抗SATB1进行共免疫沉淀，然后使用WB和抗β-连环蛋白，如材料和方法星号表示β-catenin的免疫沉淀截短C末端的位置，该末端正好位于免疫球蛋白重链（IgH）的上方。下面板描述了WB和用于免疫共沉淀的输入提取物。（B） SATB1–β-catenin相互作用对SATB1调节基因转录状态的影响c-Myc公司进行定量RT-PCR分析，如材料和方法使用从未经LiCl处理的HEK 293T细胞中提取的RNA（bar1，归一化为单位值），使用LiCl（bars 2-4），并转染β-catenin的C-term（577-780 aa）（bar3）和N-term（1-576 aa）。在分离RNA之前，在给予所有这些处理后培养细胞48小时。每个误差条描述了从三倍计算的标准偏差。（C） 截短的β-连环蛋白C末端（666–780 aa）的过度表达竞争性地克服了内源性全长β-连环素与SATB1基因组靶点的关联。用编码β-连环蛋白的VP16标签、VP16融合的N-端（1-137个氨基酸）或C-端（666-780个氨基酸）结构域的pACT载体转染HEK 293T细胞，并用LiCl处理。24小时后，收集细胞，通过超声分离染色质，并使用棒状物上指示的抗体进行ChIP分析。本试验中使用的β-catenin抗体是针对其N末端的。所使用的表达式向量和构造在左侧进行了示意性描述。使用特异于c-Myc公司-SBS如中所述材料和方法图中显示了通过定量实时PCR分析测量的ChIP-PCR产物在载体控制（“V”）上的折叠富集。负值表示占用率降低，而正值表示与病媒控制相关的占用率增加。灰色和黑色条表示LiCl处理的HEK 293T细胞中SATB1（条2–3）、β-catenin（条5–6）和VP16（条8–9）的占位折叠变化，分别过度表达β-catentin的N项（“N”）或C项（“C”）结构域截断。（D） 通过使用TOPFlash和FOPFlash报告基因构建物对HEK 293T细胞进行反式激活分析，并在指定组合中联合转染SATB1、β-catenin（T41A）、siSATB1、si-β-catentin、β-catanin N末端（1–576 aa）和β-catenic C末端（577–780 aa），来测量Wnt信号活性。报告者分析中使用的β-catenin的T41A突变不能被GSK-3β磷酸化，因此构成稳定和激活。如中所述，在48小时后测量报告者的活动材料和方法测定TOPFlash转染细胞与FOPFlash转基因细胞中荧光素酶活性的比率，并绘制为相对TCF活性。每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。
SATB1与TCF竞争对TCF调节基因转录β-连环蛋白信号转导的影响
由于我们测试了许多SATB1和TCF-1靶基因的转录，因此我们测试了它们是否相互作用。胸腺细胞提取物与抗TCF-1的免疫沉淀没有降低SATB1，表明它们缺乏物理相互作用(，车道2）。TCF蛋白家族由四个成员组成，通过选择性剪接以多种亚型表达[34]TCF-4是包含所有已知功能域的所有TCF家族蛋白中最大的一种，因此我们将其用于结合研究，以便测试所有可能的域，包括其他TCF亚型中不存在的域。TCF-4在T细胞发育中不起任何作用[35]但在上皮细胞如HEK-293T中起重要作用[36]因此，我们使用来自对照组和经氯化锂处理的HEK 293T细胞的提取物，使用抗TCF-4进行免疫沉淀。使用抗SATB1的免疫印迹分析显示，即使在LiCl处理后，SATB1和TCF-4之间也没有相互作用(，车道5和6）。在确定这两种蛋白质不相互作用后，我们随后探索它们是否与β-连环蛋白竞争关联。我们通过在固定化GST-β-catenin和GST-Arm蛋白上加载TCF-4进行了体外竞争实验。然后用SATB1的三个功能域（即PDZ、HD和CD）分别攻击结合的TCF-4，然后洗脱与色谱柱结合的TCF-4并通过免疫印迹分析进行监测。引人注目的是，尽管在与HD或CD孵育后的洗脱液中可以检测到TCF-4蛋白(与PDZ结构域（第2区）孵育后几乎无法检测到TCF-4，表明TCF-4与β-catenin亲和矩阵分离。相反，与GST-Arm重复序列亲和柱结合的TCF-4没有被PDZ结构体取代(，车道7），表明SATB1的PDZ和β-catenin的C末端区域之间的直接相互作用是其与TCF-4竞争的能力所必需的。为了监测TCF-4和SATB1是否在体内竞争，我们使用转染了对照Flag载体或Flag-TCF4的HEK-293T细胞的提取物进行了联合免疫沉淀分析，然后用氯化锂处理。与载体对照组相比，用抗SATB1免疫沉淀法在TCF-4过度表达时显著降低β-catenin下拉(). 该观察为SATB1和TCF-4与β-catenin相互作用的体内竞争提供了有力证据。为了测试这两种转录因子在体内对β-catenin募集的竞争是否影响基因表达，我们监测了两个TCF应答基因整合素β1和细胞周期蛋白D1的表达[37],[38]T41A组成活性β-catenin的过度表达上调了这些基因(，巴2）。这两个基因的表达可能通过滴定TCF-相关β-连环蛋白（bar 6）对SATB1过度表达产生负面影响。当SATB1和β-catenin同时过度表达时，整合素β1和细胞周期蛋白D1的转录减少约2倍（bar 3），表明β-catentin的过度表达部分解除了SATB1介导的下调。然而，N-项（1-576）β-连环蛋白的过度表达对SATB1的共表达没有产生类似的影响(，比较车道4和5），可能是因为它缺少β-catenin的SATB1相互作用的C末端区域。这一结果为SATB1的要求提供了有力的证据：β-连环蛋白相互作用对观察到的基因调控作用。综合考虑，这些数据表明，SATB1通过竞争性招募β-catenin介导β-catentin信号传导，从而也影响TCF调节基因的转录。
TCF和SATB1之间的β-catenin招募竞争影响TCF介导的转录调控。（A） SATB1不与TCF蛋白相互作用。按照中所述进行免疫沉淀材料和方法用抗TCF-1（第2条线）和抗SATB1（第3条线）免疫沉淀来自经氯化锂处理24小时的人胸腺细胞的核提取物，然后用抗SATB1免疫印迹。同样，通过将抗TCF-4与HEK 293T细胞的核提取物培养在LiCl存在（第6道）和不存在（第5道）的条件下24小时，然后用抗SATB1进行免疫印迹，进行免疫沉淀。输入（通道1和5）代表IP所用核提取物的5%。（B） 体外竞争试验按照材料和方法TCF-4包含TCF家族蛋白的所有已知功能域。简言之，来自Flag-TCF-4转染的HEK 293 T细胞核提取物的TCF-4分别与GST-β-catenin（1-5通道）或GST-Arm（6-7通道）结合在谷胱甘肽-Sepharose上。然后将结合复合物与所示的各种重组蛋白孵育，并通过Western blot分析监测TCF-4与柱的结合。“-”表示未添加蛋白质，直接从色谱柱中洗脱TCF-4。上面的面板表示使用抗TCF-4的WB分析，而下面的面板表示考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（15%）所使用的各种重组蛋白的图谱。（C） SATB1和TCF-4在体内与β-连环蛋白相互竞争。从转染Flag-TCF4（第2道）或空载体（第1道）的HEK 293T细胞经LiCl处理的提取物中，进行共免疫沉淀以拉下SATB1:β-catenin复合物。分别使用抗SATB1和抗β-catenin进行IP和WB。如中下部面板所示，使用相应抗体通过免疫印迹分析监测Flag-TCF4和SATB1的表达。（D） SATB1在体内抑制TCF靶点。用指定的构建物转染HEK 293T细胞，以在指定的组合中过度表达全长β-连环蛋白（T41A）、N-末端β-连环素（1-567 aa）和SATB1或空载体。由这两种结构编码的β-连环蛋白可以转位到细胞核，因此能够反式激活Wnt/TCF/β-连环素靶点；然而，N项（1–576）蛋白不与SATB1相互作用。转染48小时后分离RNA，通过实时RT-PCR分析对TCF应答基因整合素β1和细胞周期蛋白D1进行定量转录谱分析，如材料和方法.
SATB1通过β-连环蛋白信号转导去乙酰化并将β-连环素招募到其靶基因
SATB1的DNA结合活性受其翻译后修饰如磷酸化和乙酰化的调节。尤其是乙酰化对SATB1的DNA结合活性有严重的负面影响[21]为了研究SATB1在体内基因组靶点上占据率增加的分子机制，我们监测了β-catenin积累过程中SATB1的乙酰化水平。我们使用SATB1抗体对HEK 293T和经LiCl处理的Jurkat细胞进行了为期36小时的SATB1免疫沉淀，每隔6小时进行一次，然后使用泛乙酰抗体进行免疫印迹。有趣的是，氯化锂处理导致HEK-293T细胞和Jurkat T细胞中SATB1乙酰化的时间依赖性降低(). 在本研究中，我们观察到两条乙酰化蛋白带。然而，SATB1的分子量仅与上带相匹配。较低的谱带可能是由于SATB1相互作用蛋白的免疫沉淀，该蛋白也在Wnt信号传导时脱乙酰。而SATB1水平在时间过程中没有变化；正如预期的那样，β-catenin在36小时内稳定下来(). 同样，在BIO治疗后，我们观察到SATB1的时间依赖性去乙酰化和β-连环蛋白在原代人胸腺细胞中超过36小时的积累(). 有趣的是，已知能乙酰化SATB1的PCAF乙酰转移酶[21]在胸腺细胞经BIO治疗后以时间依赖性方式下调()这表明在这个时间过程中SATB1脱乙酰化的可能机制。因此，IgH MAR和白介素-2LiCl处理后，启动子介导的报告活性以时间依赖的方式上调(). 为了在原始T细胞中诱导Wnt信号传导，我们使用可溶性Wnt3a配体并进行IgH-MAR-核糖核酸酶报告分析。用Wnt3a治疗后，报告活性在36小时内被刺激6倍以上，表明β-catenin稳定，可能与去乙酰化SATB1的相关性增加。脱乙酰SATB1对DNA具有较高的亲和力[21]并在Wnt信号传导中招募各种辅助因子，如β-catenin和p300，导致MAR相关转录上调。IgH MAR和白介素-2远端启动子报告人构建港口SBS[17]但不包含共识TCF结合位点；因此，观察到的上调仅是由于SATB1。因此，这些数据表明Wnt/β-catenin信号传导诱导SATB1去乙酰化，从而促进其与β-catentin的关联，从而减轻SATB1介导的抑制。接下来，为了以时间依赖的方式评估SATB1-β-catenin对其基因组靶点的占有率，我们通过ChIP监测了它们在包含SBS的各种基因启动子中的占有率。氯化锂处理后，SATB1入住c-Myc公司启动子增强，β-catenin也遵循类似模式(). 两者都有白介素-2和c-Myc公司受SATB1负调控[15],[17]但在Wnt信号发送时被诱导[28]可能是通过直接招募SATB1:β-catenin复合物到含有SBS的上游调控区域(图S7). 此外，SATB1:β-catenin复合物占有率的时间依赖性增加伴随着启动子处H3K9乙酰化的增加，这表明转录激活(). 总的来说，这些发现进一步证实了β-catenin的募集显著改变了SATB1调节基因的命运。
β-catenin信号增强体内SATB1与靶点的结合。（A） SATB1的去乙酰化是Wnt/β-catenin信号传导的功能结果。在指定的时间点，使用LiCl处理的HEK 293T和Jurkat细胞以及BIO处理的人类胸腺细胞的核提取物免疫沉淀SATB1，然后使用带有抗泛乙酰抗体的WB。下部面板显示了时间进程中SATB1和β-catenin的表达水平。虽然在此期间SATB1水平没有太大变化，但β-catenin逐渐稳定，表明Wnt/β-catening信号在所有三种细胞类型中都是活跃的。用抗PCAF对这些提取物进行免疫印迹分析，发现PCAF在诱导人类胸腺细胞Wnt信号时下调。用抗β-微管蛋白免疫印迹作为胸腺细胞提取物的负荷控制。（B） 在Wnt信号传导的诱导下，MAR相关的报告活动被上调。在LiCl处理HEK-293T细胞的过程中，或在Wnt3a处理的人类胸腺细胞中，对IgH-MAR和IL-2报告子的活性进行监测，如材料和方法每个误差条表示从三倍计算的标准偏差第页值小于0.001。（C） 进行ChIP分析，以监测SBS内SATB1、β-catenin和H3K9Ac的占用情况白介素-2和c-Myc公司基因座如所述材料和方法使用LiCl处理Jurkat细胞24小时后的抗SATB1、抗β-catenin和抗H3K9Ac免疫沉淀染色质，通过实时PCR分析各个SBS计算占用率的变化。零时间的入住率被视为基线控制，其他时间点的入住率变化被计算为相对于控制的相对入住率。
Wnt信号传导在未分化CD4中具有活性+T细胞与分化TH（H）单元格
Wnt家族多个成员在胸腺细胞中的表达已被证实[39]然而，Wnt分子或任何下游效应器的表达在CD4分化中均未被记录+T细胞。测试CD4中Wnt信号是否激活+T细胞，我们分离出原始CD4+来自人类脐血的T细胞，在没有Wnt激动剂的情况下，在级联TCF结合位点驱动的报告者TOP-Flash的控制下监测转录活性。对照未经治疗的CD4+T细胞显示出低但一致的TCF报告活性(，bar 1），表明T细胞产生低水平Wnt信号。用Dkk1处理或转染siβ-catenin几乎完全消除了内源性Wnt活性(，bars 2和3），表明Wnt信号在未分化CD4中是活跃的+T细胞。组成活性T41Aβ-catenin的过度表达导致TCF活性显著增加，表明CD4+T细胞对Wnt/β-catenin信号有反应。不同亚群胸腺细胞的差异敏感性归因于Wnt成分的差异表达[39].调查CD4是否+从脐血和体外培养的T细胞由于产生Wnt而对Wnt信号有反应，我们使用RT-PCR和实时定量RT-PCR检测了几种Wnt的存在。大多数被研究的Wnts似乎在这些细胞中有差异表达。Wnt 2是最显著的Wnt，其次是Wnt 4和Wnt 5a(). Wnt 5b和Wnt 1的表达水平极低，只能通过定量RT-PCR检测(). Wnt 5b在SP和DP胸腺细胞中高度表达[39]因此，它被用作计算CD4中其他Wnts折叠表达的参考+T细胞。在第二次检测中，原始CD4+首先用平板结合的抗CD3和可溶性抗CD28激活T细胞。吨H（H）1和TH（H）然后分别通过添加细胞因子IL-12和IL-4诱导细胞分化，并分化细胞72小时H（H）1标志性细胞因子IFN-γ、IL-12和TH（H）使用蛋白珠阵列分析细胞上清液中的2标记细胞因子IL-4，以确认其极化(图S9). 通过免疫印迹分析两种T亚型细胞核提取物来监测β-连环蛋白在分化时的稳定性H（H）细胞。在两个T细胞中均检测到内源性稳定的β-连环蛋白H（H）1和TH（H）2个细胞，尽管TH（H）2个细胞表达的β-连环蛋白比T细胞高2倍H（H）1 (，将车道4与车道1进行比较）。为了监测Wnt信号在分化过程中对β-catenin稳定性的影响，激活CD4+在可溶性Dkk1或Wnt激动剂BIO存在下，T细胞分化72小时。用Dkk1处理导致内源性稳定的β-连环蛋白减少，这在T细胞中更为显著H（H）与T细胞相比有2个细胞H（H）1（将车道6与车道3进行比较）。BIO治疗导致β-catenin稳定，主要在TH（H）2个单元格(，比较泳道4和泳道5），表明Wnt信号传导在这些细胞中是活跃的。因此，这些结果证实了低水平Wnt信号是由TH（H）细胞本身以及β-连环蛋白稳定等下游过程也发生在T细胞的两个亚型中H（H）细胞，尽管程度不同。
Wnt信号在幼稚CD4中是活跃的+T细胞与分化T细胞H（H）细胞。（A） 天真的CD4+从脐血中分离出T细胞，如材料和方法Wnt信号活性是通过使用TOPFlash和FOPFlash报告结构进行反式激活分析来测量的。48小时后，在未经处理的对照细胞（bar1）、Wnt抑制剂Dkk1处理的细胞（bar2）以及如图所示的si-β-catenin（bar3）和β-catentin（T41A）（bar4）共转染后，测量TCF报告活性。在所有样品中，在不添加任何Wnt激动剂的情况下测量报告活性。测定TOPFlash转染细胞与FOPFlash转基因细胞中荧光素酶活性的比率，并绘制为相对TCF活性。每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。（B） CD4中Wnts的表达+T细胞。天真的CD4+从脐血中分离出T细胞，如材料和方法通过对从这些细胞中提取的总RNA进行RT-PCR分析，确定所示Wnts的mRNA水平（顶面板）。通过定量RT-PCR分析来自两个生物复制品的RNA来监测Wnt的表达（下图）。将Wnt5b的表达水平作为一个单位，用同一样本中的GAPDH表达归一化后计算其他Wnts的相对折叠表达。（C） 免疫印迹分析监测β-catenin在T细胞分化中的稳定性H（H）细胞。天真的CD4+使用板结合抗CD3和可溶性抗CD28激活细胞，并通过添加IL-4或IL-12进行分化，如材料和方法.从对照细胞和极化至T的细胞制备核提取物H（H）1和TH（H）2，用Wnt激动剂BIO或Wnt抑制剂Dkk1治疗，然后用抗β-连环蛋白（上部）和抗γ-微管蛋白（下部）进行免疫印迹分析。每个泳道代表从5×106分化和处理的细胞。β-catenin面板下方的数字表示免疫印迹指示通道中β-catentin表达的折叠变化，与作为负荷控制的γ-微管蛋白进行标准化。根据各谱带的密度定量计算折叠变化值。γ-微管蛋白面板下方的数字表示免疫印迹的单个通道。
Wnt信令和SATB1影响TH（H）细胞谱系承诺
测试T中是否涉及Wnt信号H（H）细胞承诺，我们监测Wnt抑制剂Dkk1对T转录的影响H（H）2个标记GATA-3协议.天真的CD4+从人脐带血中分离T细胞，并用平板结合的抗CD3和可溶性抗CD28（TH（H）0状态）[26]并在存在上述特定细胞因子的情况下进行分化。将可溶性Dkk1添加到TH（H）培养2个细胞。细胞分化72小时，每24小时补充一次Dkk1GATA-3协议被监测为T的指标H（H）2分化。定量转录谱分析显示GATA-3协议Dkk1治疗后T细胞的表达被抑制了3倍以上H（H）2个子集，表明Wnt信号对上调GATA-3协议T分化期间H（H）2个单元格(). 直接评估SATB1在T中的作用H（H）细胞分化，我们通过过度表达和siRNA介导的沉默来改变其表达水平，并监测CD4的分化+细胞。干扰siRNA被用作对照。CD4细胞+转染siSATB1或SATB1表达构建物的细胞培养24 h，用平板结合的抗CD3和可溶性抗CD28激活，加入细胞因子极化，进一步生长24 hH（H）2个标记GATA-3协议使用从这些细胞中提取的总RNA通过定量RT-PCR进行监测。siRNA介导的SATB1表达沉默GATA-3协议在T中被下调H（H）0和TH（H）2个单元格(). 的表达式GATA-3协议在加扰siRNA处理的对照T中H（H）0个单元格被视为基线(，巴1）。SATB1击倒后，GATA-3协议在T细胞中表达减少2倍H（H）0个单元格（栏2）。值得注意的是，在TH（H）2个单元格GATA-3协议在SATB1击倒后被下调了11倍以上（bar 6）。下调GATA-3协议单位：TH（H）2比T更引人注目H（H）0子集，表示需要SATB1GATA-3协议以T表示H（H）2个单元格。SATB1对GATA-3协议SATB1的过度表达进一步证实了其表达，导致GATA-3协议在这两个亚组中，与各自的对照组相比（将条形图3和7分别与1和5进行比较），表明SATB1正向调节GATA-3协议表达式。在这些条件下，另一个T的表达H（H）2-特异性转录因子c-Maf没有显著改变(图S10)表明SATB1的调节作用至少在T细胞分化早期对GATA-3具有特异性H（H）细胞。
SATB1和β-catenin调节GATA3和T的表达H（H）2种细胞因子在T细胞分化中的Wnt依赖性H（H）2个单元格。（A） 主动Wnt信号对T辅助细胞分化很重要。吨H（H）细胞在有或无Dkk1的情况下在体外分化，如材料和方法
[26]。对照细胞仅用载体（1×PBS）处理。极化72小时后，分离出总RNAGATA-3协议转录物通过定量RT-PCR进行分析，如材料和方法.GATA-3协议β-actin在这些细胞中的表达正常化。该图显示了GATA-3协议对照组和Dkk1处理的TH（H）细胞。计算相对于对照T的折叠变化H（H）0子集，其中GATA-3协议将表达水平设置为基线（条1）。每个误差条代表三倍计算的标准偏差。下部面板显示了SATB1和β-actin的相应转录谱。（B） SATB1和β-catenin调节GATA-3协议T辅助细胞中的表达。天真的CD4+用双重siSATB1、siβ-catenin或SATB1过表达质粒DNA转染T细胞，如材料和方法和所述的体外分化[26]作为对照，转染双链干扰RNA（Scr）。极化72小时后，分离出总RNAGATA-3协议转录物通过定量RT-PCR进行分析，如材料和方法.GATA-3协议β-actin在这些细胞中的表达正常化。该图显示了折叠变化GATA-3协议对照转录物（Scr）（bars 1和5）、SATB1沉默（bars 2和8）、SATB1-过度表达（bars 3和7）和β-连环蛋白沉默（bars-4和8）H（H）0和TH（H）2个单元格。计算干扰RNA转染T的折叠变化H（H）0子集，其中GATA-3协议将表达水平设置为基线（条1）。每个误差条代表三倍计算的标准偏差。下部面板显示了T中SATB1、β-catenin和β-actin的相应转录谱H（H）0和TH（H）敲除和过度表达后分别为2个细胞。（C，D）T的量化H（H）从T细胞培养上清液中提取2种细胞因子Il-4、Il-10和Il-13H（H）在有无Dkk1（C）或转染siSATB1和siβ-catenin（D）的情况下培养72小时的细胞，使用如材料和方法所示T的表达式H（H）2种细胞因子以pg/ml表示，每个误差条代表从三份中计算的标准偏差。
T的分化H（H）2细胞的特征是分泌由T细胞编码的标志性细胞因子H（H）2细胞因子位点[40]因此，监测Wnt/β-catenin信号和SATB1对分化T细胞中特征性白细胞介素表达的影响H（H）T细胞培养上清液H（H）受到GATA-3协议敲除SATB1和β-catenin以及Dkk1处理的T细胞培养上清液后的表达谱H（H）收集细胞。使用多重蛋白珠阵列监测对照、Dkk1处理和siRNA处理细胞上清液中分泌白细胞介素的表达。引人注目，签名TH（H）Dkk1治疗后IL-4、IL-10和IL-13等2种细胞因子下调()在敲除SATB1和β-catenin后()，独立确认T期间SATB1和Wnt/β-catenin信号的要求H（H）细胞分化。敲除SATB1还导致T细胞IL-4转录物和细胞内IL-4水平显著下调H（H）2个单元格(图S11). 总之，这些结果表明，SATB1和Wnt/β-catenin信号在分化T细胞的过程中积极调节标志性白细胞介素的表达H（H）2个单元格。
SATB1规定GATA-3协议T中的表达式H（H）2细胞通过招募β-连环蛋白和p300GATA-3协议以Wnt-Dependent方式推荐人
了解SATB1和β-catenin是否调节GATA-3协议独立表达或功能连接，我们监测了SATB1在转录起始位点1kb上游区域的占有情况GATA-3协议EMSA在体外建立了SATB1在转录起始位点上游约600–900 bp的区域内的直接结合(图S12). 接下来，我们使用人类CD4监测体内SATB1的占有率+吨H（H）使用siSATB1沉默SATB1表达的细胞。用干扰RNA（Scr）转染的细胞作为对照。siSATB1和Scr转染细胞均分化为TH（H）在接下来的72小时内添加IL-4，形成2细胞谱系。仅被板结合抗CD3和抗CD28激活且未经IL-4处理的细胞称为T细胞H（H）0.我们对这些分化细胞进行ChIP分析，并监测其上游区域SBS中SATB1和β-catenin的占有率GATA-3协议启动子通过定量PCR分析洗脱的染色质。作为ChIP分析的对照，我们使用了GATA-3启动子−1500到−1800 bp的另一个区域，该区域不直接与SATB1（非SBS）结合(图S12). 在对照组（Scr）T中，从分化24到72小时，启动子上SATB1的占有率逐渐增加H（H）2个单元格(，杆5、9和13）。SATB1被击倒导致其在GATA-3协议启动子（条6、条10和条14）。引人注目的是，β-catenin占用率在对照T分化期间也增加了H（H）2个细胞，并且在SATB1敲低时显著减少（分别将条带7、11和15与条带8、12和16进行比较）。在分化过程中，未在上游非SBS观察到SATB1或β-catenin的占有率增加（棒状物21–32），这表明SATB1在SBS招募β-catentinGATA-3协议发起人。
SATB1在β-catenin和p300结合位点的招募GATA-3协议启动子依赖于Wnt。（A） SATB1在SBS招募β-cateninGATA-3协议发起人。天真的CD4+T细胞分化为T细胞H（H）通过在存在或不存在siSATB1或干扰RNA（Scr）的情况下添加IL-4 24、48和72小时，获得2个亚型，如材料和方法.居住GATA-3协议T期SATB1和β-catenin启动子H（H）通过定量实时PCR对SBS（上图）和上游非SBS区域（下图）进行监测，使用来自体外分化T细胞的染色质免疫沉淀H（H）单元格，如所述材料和方法数据表示输入染色质标准化后，与相应的IgG对照物相比，ChIP产品的相对占有率。每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。（B） 天真的CD4+T细胞分化为T细胞H（H）在Wnt抑制剂Dkk1存在或不存在的情况下，通过添加IL-4 72小时，形成2亚型，如材料和方法.不同的占用率GATA-3协议T期SATB1、β-catenin和p300启动子H（H）通过定量实时PCR对SBS（上部图）和上游非SBS区域（下部图）进行监测，使用来自体外分化T细胞的染色质免疫沉淀H（H）细胞。以载体（1×PBS）处理的细胞作为对照。这三种蛋白质在GATA-3协议启动子在T中确定H（H）0和TH（H）2个子集。数据表示输入染色质标准化后，ChIP产品相对于相应IgG对照的相对占有率。误差条表示从三倍计算的标准偏差。插图描述了GATA-3协议启动子显示SBS（星形）和非SBS（圆形）的相对位置。箭头表示PCR引物设计对应区域的位置。
评估β-catenin对SATB1的积极影响的贡献：β-catentin复合物对GATA-3协议启动子，我们通过处理分化的TH（H）带有Dkk1的单元格。T型钢H（H）如上所述分化细胞并用Dkk1处理72小时H（H）细胞（TH（H）0）用作对照。我们分化细胞72小时，因为β-catenin和SATB1在GATA-3协议分化72h后观察到。从分化T中分离的染色质H（H）0（控制）和TH（H）使用SATB1、β-catenin和p300抗体对Dkk1处理和未处理的细胞进行免疫沉淀。这些蛋白质在SBS中的占有率GATA-3协议通过免疫沉淀DNA的定量PCR，在Wnt-on-off条件下监测启动子。在Dkk1治疗后（Wnt-off），由于核β-catenin水平降低，其在GATA-3协议启动子也显著减少(，比较杆9和10）。Dkk1处理后，SBS中SATB1的占有率降低（对比杆7和8），这表明需要Wnt信号才能增加其基因组靶点上SATB1的占据率。此外，p300的入住率在GATA-3协议Dkk1治疗后的启动子（比较杆11和12），证实了SATB1:β-连环蛋白复合物招募p300的观察结果。这进一步解释了观察到的GATA-3协议经Dkk1处理(). 在非SBS中未观察到SATB1、β-catenin和p300的占用率变化GATA-3协议发起人(，车道19–24），表明Wnt在SBS的SATB1招募依赖于GATA-3协议启动子需要上调GATA-3协议在T期间H（H）2分化。
讨论
SATB1在整个基因组中的非随机占据可能导致小鼠胸腺细胞中形成一个特征性的“笼状”网络，将异染色质与常染色质区分开来[15],[20]此外，SATB1在MAR上显示的“聚集”型占有率和基因上游调控序列表明SATB1作为结构和调控染色质成分的双重作用[19]SATB1可能占据染色质间区域或核空间，其中包含转录平衡的基因[20]SATB1将β-catenin隔离在这个核隔间可能会产生什么后果？初级胸腺细胞中SATB1和β-catenin的免疫染色表明，它们共同定位于染色质间隙，并在细胞核内形成一个独特的亚结构。由于SATB1是已知的唯一含有PDZ样信号结构域的染色质相关蛋白，β-catenin的C末端通过该结构域与SATB1相互作用，因此也可以推测Wnt信号级联可能与PDZ信号级联相互作用。β-连环蛋白本身不与DNA结合；因此，SATB1必须将其招募到基因组靶点。一旦被SATB1招募到其基因组靶点上，β-连环蛋白可能会招募染色质修饰和重塑复合物来转录Wnt靶基因。这方面类似于TCF/LEF家族HMG盒转录因子，它需要辅助因子来激活其招募位点的转录[34],[41]HMG盒介导与核心一致序列的序列特异性结合AGATCAAAGG公司
[42]。SATB1还以序列特异的方式将DNA与12-mer一致序列结合塔塔塔塔塔类似HD共识[23]鉴于SATB1和TCF在DNA上有不同的识别位点，SATB1直接竞争TCF结合位点的可能性较小。事实上，体外结合研究提供了证据，证明SATB1并不直接与TCF共识元素结合。然而，由于Wnt信号传导似乎也会在体内影响SATB1反应性IgH-MAR连接的报告基因，因此不能排除SATB1对TCF结合位点产生影响的可能性。许多受SATB1调控的基因也可能对Wnt信号产生反应，因此本研究有可能揭示T细胞中迄今未知的Wnt靶点。事实上，我们的基因表达谱数据揭示了ThPOK是胸腺细胞中一个新的Wnt靶点。ThPOK被SATB1抑制[21]（Limaye和Galande，手稿正在准备中），对CD4 T细胞的发育很重要[43]然而，只有一个特定的SATB1靶点子集对Wnt/β-catenin而不是所有靶点作出反应的确切机制需要进一步研究。
TCF和SATB1的细胞表达水平在决定它们与β-catenin相互作用的结果中起决定性作用。我们发现SATB1与TCF在隔离β-catenin方面存在竞争。由于并非所有SATB1靶点都是Wnt靶点，反之亦然，因此在这些效应蛋白中选择β-catenin的伴侣可能决定细胞的发育命运。SATB1和TCF之间可能存在功能冗余，因为TCF在某些细胞类型中表达，但SATB1不表达，反之亦然。分化48小时后，TH（H）1细胞主要表达TCF-1，SATB1在低水平表达，而TH（H）2个细胞仅表达SATB1[26]当这两种蛋白在同一细胞中同时表达时，研究决定启动子上SATB1和TCF-1占位的机制将很有意义。我们测试的一种可能性是，它们通过与β-catenin相互作用来竞争占据基因组靶点。TCF通过臂重复与β-catenin相互作用，而SATB1与其C末端相互作用，因此这种竞争不是由β-catentin上的相互作用位点驱动的。因此，竞争可能由这些蛋白质的翻译后修饰和相关伙伴驱动。TCF和SATB1的DNA结合位点不相似，因此竞争不是在DNA结合水平上，而是在蛋白质相互作用水平上。引人注目的是，当SATB1过度表达时，非SATB1靶点的TCF应答基因以β-连环蛋白依赖的方式受到负面影响，表明β-连环素的滴定。
许多研究专门探讨了Wnt信号与淋巴细胞发育的相关性，通常涉及TCF功能的遗传和/或生化分析[2],[32],[35],[39],[44]–[48]Wnt信号对胸腺T细胞的发育至关重要，它存在于所有胸腺细胞亚群中，但程度不同[2],[35],[39],[45]Wnt信号的不同敏感性归因于Wnt（s）及其受体的差异表达，以及激活信号分子（如TCF-1和β-catenin的长型）在不同T细胞亚群中的差异表达[39]胸腺中各种Wnts和Fz的高度冗余掩盖了它们在敲除小鼠模型中的重要性[2]然而，可以通过Wnt/β-catenin途径负调控因子的过度表达来阐明β-catentin在T细胞发育中的作用[10]对Wnt/β-catenin信号传导调节T细胞基因表达的分子机制的研究也仅限于TCF/LEF家族蛋白[34]我们发现SATB1和β-catenin之间的物理联系及其在调节多个基因转录中的作用，为Wnt/β-catenin信号传导在T细胞发育和分化中的作用提供了前所未有的线索。已知SATB1在T细胞发育过程中协调多个基因的时空表达[21],[25]SATB1缺陷对胸腺细胞发育的影响类似于β-连环蛋白或TCF缺陷胸腺细胞[11],[25],[46]虽然已知Wnt信号在所有胸腺细胞亚群中都存在，但由于β-catenin和TCF-1等激活Wnt传感器的高表达，它主要发生在双阴性（DN）亚群中[39]。有趣的是，在萨特B1缺陷小鼠的DN细胞数量大大减少[25]Wnt/β-catenin信号传导在胸腺细胞发育的后期也起作用，如分化为CD4+CD8（CD8）+DP电池[47]，生成成熟CD8+SP胸腺细胞[48]和CD4的分化+SP细胞至TH（H）2个细胞（本次调查）。SATB1可能对上述所有因素都有贡献，因为在萨特B1空白小鼠胸腺细胞的发育在DP期受阻，很少观察到CD8 SP细胞[25]、和萨特B1在T期早期上调H（H）细胞分化[26]然而，SATB1并没有被直接证明对T很重要H（H）细胞发育，Wnt信号在这一过程中的作用也是前所未有的。我们显示CD4+T细胞接受Wnt信号可能是因为它们自己产生不同的Wnt。T的微分灵敏度H（H）Wnt信号的细胞亚型可能是由于β-连环蛋白稳定等下游过程在T细胞中显著发生H（H）2个亚型。我们的研究确定了SATB1的作用：β-catenin协同作用在这一重要的生物现象中。此外，SATB1重组染色质组织和基因表达谱以促进乳腺肿瘤生长和转移[49]我们的研究通过β-连环蛋白和染色质修饰机制的招募为这种重编程提供了一种可能的机制。SATB1介导的β-catenin及其配对物在染色质上的有序沉积对各种发育系统和肿瘤发生过程中Wnt信号的全球基因调控的影响有待进一步研究。
根据我们的研究结果，我们提出，当β-catenin磷酸化和降解时，在缺乏Wnt信号的情况下，SATB1主要作为大多数基因的阻遏物，并将不同的染色质重塑复合物招募到其基因组靶点。然而，在β-catenin稳定后，它与常染色核室中的β-catening结合，并且随着β-catentin的招募和H3K9乙酰化，它与靶DNA的结合增强。因此，我们的研究提供了一种机制来解释SATB1的调节功能是如何以信号依赖的方式从阻遏物调节到激活物的。SATB1是染色质重塑因子的“登陆平台”[16]并且根据其翻译后修饰状态，可以选择性地使用其相关伴侣来调节靶基因转录[21]Wnt信号激活SATB1靶基因，否则SATB1会抑制这些靶基因。这种转换机制类似于TCF:β-catenin复合物的报道，其中β-catenin与TCF的相互作用克服了阻遏物效应，多个基因被激活[34]类似地，含有β-catenin-HD的蛋白质Prop1复合物也作为一个二进制开关同时激活关键谱系决定因子的表达坑1并抑制编码谱系抑制转录因子的基因赫斯1通过TLE/Reptin/HDAC1共升压复合物发挥作用[50]该功能类似于MyoD、CREB和STAT-1因子的功能，它们同时与几种修饰剂相互作用，并选择性地利用其酶活性来刺激启动子[51],[52].
Wnt信号转导后SATB1的去乙酰化是调节转录的关键事件。乙酰化已被证明可消除SATB1的DNA结合活性[21]因此，去乙酰化对于提高其在基因组靶点上的占有率是必需的。然而，这两种蛋白质的乙酰化对它们的结合和调节转录的能力有相反的影响（Notani和Galande，手稿正在编写中）。因此，Wnt信号传导导致SATB1的去乙酰化，这促进了其与β-连环蛋白的相互作用，从而导致SATB1在其基因组靶标上的募集增强。因此，乙酰化这两种蛋白质（分别为PCAF和p300）的组蛋白乙酰转移酶（HAT）可能在Wnt信号传递时调节SATB1介导的转录。TCF是已知在Wnt靶基因上招募β-catenin的转录因子，需要p300作为辅因子才能发挥激活剂的作用[7]，而SATB1依赖于PCAF实现此类功能[21]因此，TCF、SATB1和β-catenin的翻译后修饰可以微调Wnt信号级联的转录结果。有趣的是，PCAF本身在人类胸腺细胞的Wnt信号中下调，特别是在以后的时间点。然而，在很早的时间点（Wnt信号诱导后9小时内），PCAF上调，SATB1的乙酰化也上调，导致其与CtBP1辅升压因子分离[53]因此，乙酰化似乎是控制SATB1以Wnt依赖方式作为多个基因的激活剂或阻遏剂发挥作用的分子开关。
SATB1在调节T中的作用H（H）已提出2个特异性细胞因子位点，其中SATB1促进白介素-4,白介素-5,白介素-13、和c-Maf公司通过在T细胞上形成浓密的环状、转录活性高阶染色质结构H（H）2细胞激活[18].T型H（H）细胞分化由信号蛋白介导，包括STAT4和STAT6，导致转录因子的表达，如GATA-3协议和c-Maf公司（单位：TH（H）2个单元格）或T型赌注（单位：TH（H）1个单元格）[12].GATA-3介导TH（H）通过三种不同机制的2种反应：诱导TH（H）2细胞因子产生，T选择性生长H（H）2细胞和T抑制H（H）1促进因素[13],[54]此外，GATA-3表达对于TH（H）2极化[55]GATA-3是T的标记H（H）2细胞和SATB1在T细胞中也上调H（H）2个单元格[26]因此，监测SATB1在T中的作用H（H）细胞分化，我们沉默SATB1表达并监测TH（H）量化细胞分化GATA-3协议表达式。有趣的是，在siRNA介导的SATB1敲低后，GATA-3协议表达显著减少，表明TH（H）2极化取决于SATB1。SATB1在T细胞过度表达的结果进一步证实了这一点H（H）2个细胞，明确证明SATB1是GATA-3协议Wnt/β-catenin信号在CD4中激活+吨H（H）β-catenin稳定后的细胞。β-连环蛋白在T细胞中的微分稳定H（H）1和TH（H）2种亚型可能解释了这些细胞中基因表达的差异模式。因此，我们使用Dkk1治疗来抑制T细胞中活跃的Wnt信号H（H）2个单元格。在Dkk1处理后，GATA-3协议表达显著减少，表明GATA-3协议以Wnt/β-catenin信号依赖方式调节。值得注意的是，在这些条件下，c-Maf不受SATB1或β-catenin的调节。因此，至少在人类CD4的早期承诺和分化期间+吨H（H）细胞，SATB1似乎不调节c-Maf。SATB1通过直接结合其启动子元件来调节GATA-3，并且可能不会以这种方式调节c-Maf。然而，可能需要进一步的研究来探讨SATB1在T细胞不同阶段对c-Maf的调节作用H（H）在分化的小鼠T细胞中，已经证明了SATB1对c-Maf的正向调节，从而导致分化H（H）2细胞系（克隆D10）[18]最引人注目的是，签名T的表达H（H）2细胞因子，如IL-4、IL-10和IL-13，也受到SATB1和Wnt信号的正向调节，这从SATB1或β-catenin沉默后的下调和Dkk1抑制Wnt信号中可以看出。本研究中使用的早期分化时间点在细胞培养上清液中不会产生非常高数量的分泌细胞因子。有趣的是，在RNA水平和细胞内蛋白水平上，观察到IL-4的显著下调。IL-4和其他细胞因子的分泌可能在分化72小时后激增。然而，siRNA的沉默作用不会持续这么长时间，因此在培养72小时后无法监测siSATB1或siβ-catenin的作用。有趣的是，白介素-10基因位于T之外H（H）2个细胞因子位点，但由SATB1以Wnt依赖的方式协调调节。在GATA-3协议-T不足H（H）2个细胞，产生特征TH（H）IL-4和IL-13等2种细胞因子以及IL-10也减少，表明GATA-3协议是协调T的主要协调人H（H）2响应[13]此外GATA-3协议感应TH（H）分化型和不可逆型T细胞中2种细胞因子的表达H（H）1个单元格[56]因此，确定GATA-3协议表达直接影响TH（H）2分化。因此，在Wnt信号抑制剂（Dkk1）存在或β-catenin被击倒时，TH（H）2分化似乎受到以下因素的影响GATA-3协议因此，我们建议SATB1介导TH（H）2调节分化GATA-3协议表达式，从而得到签名T的表达式H（H）2种细胞因子呈Wnt/β-catenin依赖性。有趣的是，最近的一项研究报道肾导管特异性失活GATA-3协议导致大量异位输尿管出芽，表明GATA-3作用于β-连环蛋白信号下游，以防止异位后肾诱导[57]最近一项使用TCF-1和β-catenin缺陷小鼠的研究证实，TCF-1启动TH（H）2活化CD4的分化+通过促进GATA-3表达和抑制IFN-γ表达促进T细胞[58]因此，越来越多的证据表明GATA-3协议由Wnt信号调节。
我们的研究还提供了调节GATA-3协议SATB1的表达：β-catenin复合体以Wnt信号依赖方式表达。内部SBS的ChIP分析GATA-3协议T分化启动子H（H）2个细胞显示SATB1和β-catenin的占有率随时间增加。在沉默SATB1后，其占有率预计会降低，但即使β-catenin的占有率也显著降低了几倍，这表明SATB1是介导β-catentin在GATA-3协议可能还有其他目标。SATB1的招募：β-catenin复合物GATA-3协议启动子对Dkk1处理敏感。此外，由于β-catenin在SATB1基因组靶点上招募p300，p300的占用也与β-catening的占用一样减少，可能导致观察到的GATA-3协议通过Dkk1处理抑制Wnt信号。尽管控制TH（H）0细胞也显示出类似的Dkk1敏感性模式，在GATA-3协议启动子SBS，其折叠占用率在TH（H）2个单元格。SATB1:β-catenin复合体在位于GATA-3协议启动子，对Dkk1不敏感。与多个其他基因一样，同一启动子不同区域上不同因子的差异占有似乎是调控转录的机制GATA-3协议有趣的观察结果是，这种差异募集依赖于Wnt信号传导。因此，我们的结果为理解Wnt信号在T细胞中的作用提供了分子机制H（H）2区别并定义SATB1在此过程中的独特作用。
材料和方法
抗体和试剂
β-catenin和SATB1抗体购自BD Biosciences。抗PCAF和泛乙酰赖氨酸的抗体来自圣克鲁斯生物技术公司；β-catenin N末端、VP-16和H3K9ac的抗体来自Upstate Technologies。抗Flag是从Sigma-Aldrich Corp.获得的，siSATB1和siβ-catenin双链RNA是从Santa Cruz Biotechnology获得的，BIO是从Calbiochem获得的。重组Wnt3a、Dkk1和细胞因子从研发系统获得。在兔子体内培养用于IP和WB的抗-SATB1，并使用标准程序使用免疫亲和层析纯化。
质粒
C.Neuveut博士提供了β-catenin突变体T41A和GST 1–12臂重复序列的表达结构，M.Dunach博士提供了pGEX6P3-β-catentin。缺失构建体pGEX6P3-β-catenin-1–535是通过用SpeI和XhoI消化pGEX6P3-β-catenin并将较大的片段降级到pGEX6P3中而产生的。用EcoRI消化pGEX6P3-β-catenin，将1 Kb片段亚克隆到pGEX6 P2中，获得pGEX4P2-β-catanin-425-781。截短的β-catenin的RFP融合版本由pDsRed Express C1载体（Takara Clontech）中对应于aa 1–576和577–780的β-catanin cDNA的亚克隆区域产生。在pACT和pBIND质粒（Promega）中分别克隆了各种VP16-β-catenin截断和Gal4DBD:SATB1以及Gal4BDD:PDZ融合。TOP和FOP记者结构是R.T.Moon博士的善意礼物。pTriEx-SATB1、各种SATB1结构域构建物以及报告者构建物pGL3-Basic-IgH-MAR和pGL3-Basic-IL-2已经在前面进行了描述[17],[21].
免疫染色
从3周龄Balb/C小鼠分离胸腺细胞。胸腺细胞用2%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100渗透，然后进行SATB1和β-catenin抗体染色（BD Biosciences）。使用的二级抗体与Alexafluor染料488和594（Invitrogen）结合。用DAPI进行DNA复染。在垂直荧光显微镜（AxioImager Z1型，卡尔蔡司）下观察细胞，并使用Apotome模块（卡尔蔡斯）增强数字图像。用Axiovision软件（卡尔蔡司）生成染色细胞的剖面图，显示来自核内部的信号。
体外结合试验
GST:1-178、GST:1-535、GST:425-781和GST:Arm repeats ofβ-catenin和GST:PDZ、GST:CD+HD、GST:0CD和GST:0HD的SATB1表达和纯化自大肠杆菌(大肠杆菌). 通过caspase-6在柱上裂解特定的融合蛋白，以获得所述的不含GST的蛋白[59]完整的GST融合蛋白与谷胱甘肽Sepharose 4B珠（GE Healthcare）孵育2小时。35S标记的SATB1是根据制造商的说明通过体外转录和翻译耦合制备的（Promega）。全长SATB1表达为6XHis-SATB1大肠杆菌并绑定到Ni-NTA珠子上（Qiagen）。用1×PBS洗涤结合蛋白，并用亲和纯化的重组蛋白或100µg Jurkat或SW 480细胞核提取物或体外转录和翻译的SATB1培养2–3 h。然后用含有0.1%triton X-100的1×PBS洗涤复合物，并用2×SDS-负载缓冲液洗脱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，免疫印迹分析。
细胞培养、转染和报告分析
HEK细胞系293T、结肠癌细胞系SW480和T细胞淋巴母细胞Jurkat细胞分别在DMEM或RPMI 1640（Invitrogen）中培养，并添加10%FCS（Invit罗gen）。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞和指定表达结构。转染细胞后培养24小时，然后分别以20 mM或1.0µM的最终浓度将LiCl或BIO添加到培养基中，除非另有说明，否则将细胞进一步培养24小时。如前所述，转染48小时后进行反激活分析[17]简单地说，根据制造商的说明，收获细胞并用1×PBS洗涤，然后用Luclite试剂（Perkin Elmer）裂解。使用TopCount（Packard）测量荧光素酶计数，并使用Sigmaplot ver.10绘制相对活性图。为了监测Wnt/TCF活性，使用了TOPFlash和FOPFlash报告分析系统。HEK 293T细胞或原始CD4+T细胞与指定的表达载体和TOPFlash或FOPFlash报告子构建物共转染。在每次转染中使用等质量的DNA，如果每次转染反应需要，则使用载体DNA对DNA进行归一化。计算TOPFlash转染细胞与FOPFlash转基因细胞中荧光素酶活性的比率，并绘制为相对TCF活性。除非另有说明，否则使用独立转染的HEK 293T细胞重复所有报告者分析至少三次，条形图表示值+/-s.d。观察到的差异的统计显著性通过以下公式计算t吨测试。
协同免疫沉淀
使用含有0.1%Triton X-100的1×PBS将500µg核提取物稀释三次，并使用1.0µg兔或鼠IgG和蛋白A/g珠（Pierce）进行预处理。通过与抗SATB1或抗β-连环蛋白孵育2 h，对预清除的裂解物进行免疫沉淀；然后加入蛋白A/G珠，并通过在端到端旋转器上在4°C下孵育4小时来进一步混合。通过用各自的抗体进行免疫印迹来分析蛋白质复合物。
炸薯条
ChIP基本上按照所述进行[17]简单地说，通过在培养基中添加最终浓度为1%的甲醛，使细胞交联，并在室温下培养10分钟，用125 mM甘氨酸中和，然后使用生物破坏者（Diagenode）进行超声波处理，以破解染色质，获得200–500 bp的片段。用含有50%蛋白质a/G珠浆（Pierce）、鲑鱼精子DNA和BSA的鸡尾酒预先分离超声染色质。用特定抗体孵育预先分离的染色质，并将各自的Ig型用作同型对照。然后加入蛋白A/G珠混合物以拉下抗体结合的染色质，并使用含有SDS和DTT的生物碳酸钠缓冲液进行洗脱。洗脱的染色质去交联，用蛋白酶K处理去除蛋白质。纯化的免疫沉淀染色质用特异性引物进行PCR扩增。输入染色质作为对照。
实时PCR
使用iQ-SYBR Green mix（Bio-Rad）使用iCycler（BioRad）进行定量PCR。ΔCt值使用以下公式计算：ΔCt=（Ct目标−Ct输入). 基因表达的折叠差异计算如下：折叠差异=2（处理-负载控制）/2（控制−负载控制）。通过将实验样品的表达水平除以相应的对照样品，计算折叠变化。
道德声明
这项研究是根据《赫尔辛基宣言》中表达的原则进行的。医疗研究机构伦理委员会批准了涉及人体样本的研究，并根据委员会的指南获取了组织。所有患者都提供了书面知情同意书，以采集样本并进行后续分析。
未成熟人胸腺细胞的分离
胸腺组织取自当地医院接受心脏手术的儿童，这些儿童没有任何免疫异常病史。将组织切成小块，并通过在RPMI 1640培养基中的组织筛上研磨收集胸腺细胞。将胸腺细胞悬浮液通过70µm的筛子，以去除团块和碎片。通过这种方式获得的胸腺细胞没有胸腺上皮细胞，这一点可以通过上皮/基质细胞标记物EPCAM和UEA-1的染色来证实。将来自3-4名捐赠者的胸腺细胞合并，以减少个体差异。
外周血CD4的分离+单元格
使用Ficoll-Paque（GE Healthcare）从当地医院采集的人脐血中分离出外周人单核细胞。CD4细胞+使用人CD4从PBMC中选择性分离T细胞+T细胞分离（BD Biosciences）按照制造商的说明进行。
T的体外极化H（H）1和TH（H）2个单元格
CD4细胞+T细胞在添加10%FCS（Invitrogen）的RPMI 1640培养基中培养。细胞培养在预涂有0.5µg/ml抗CD3的24孔板中，并存在0.5µg/ml可溶性抗CD28（eBiosciences）。吨H（H）使用2.5 ng/ml IL-12和T诱导1极化H（H）2用10 ng/ml IL-4极化（研发系统）。极化48小时后，添加17 ng/ml的IL-2（研发系统）。在24至72小时的不同时间点进一步培养极化细胞。
细胞因子定量
对照组和治疗组的上清液H（H）用离心法收集细胞。使用Bio-Plex T测量这些上清液中各种细胞因子的水平H（H）1-T型H（H）2个试剂盒和Bio-Plex蛋白质阵列读取器（Bio-Rad），按照制造商的说明。分泌的细胞因子水平根据各自的培养基进行标准化。
T细胞的转染和RNA的分离
如前所述，分离的T细胞在体外分化[26]胸腺细胞和CD4+根据制造商的说明，使用Nucleofector设备（Amaxa）对T细胞进行电穿孔。细胞在添加10%FCS的RPMI 1640培养基中培养24小时。24小时后，按照上述方法激活和极化细胞。Wnt信号通过以50 ng/ml添加纯化的重组Wnt3a（R&D系统）来诱导，或通过以400 ng/ml加入Dkk1（R&D-系统）来抑制。在存在或不存在Dkkl的情况下极化72小时后，收集细胞并将其分为三部分。染色质由上述两部分细胞制备而成。从剩余三分之一的细胞中分离出总RNA，并按照制造商的说明使用细胞信号试剂盒（Ambion）制备cDNA。
支持信息
图S2
SATB1和β-连环蛋白在体内相互作用。（A） 通过将抗β-连环蛋白和抗SATB1抗体与等分Jurkat核提取物分别孵育，进行协同免疫沉淀反应，如材料和方法然后分别使用抗SATB1和抗β-catenin进行Western blot（WB）。IgH，免疫球蛋白重链。（B） 使用各自的抗体通过免疫印迹分析比较SATB1和β-catenin在HEK 293T、Jurkat和SW480细胞中的表达水平。在制备核提取物之前，用LiCl处理细胞24小时。免疫印迹分析显示，SATB1在HEK 293和Jurkat细胞（1、2道）中内源性表达，而在SW480细胞（3道）中不表达。β-catenin在所有三个细胞系（4-6道）中表达；然而，其表达水平在SW480细胞中最高。
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图S3
用于体外下拉的蛋白质的定性分析。考马斯染色凝胶描绘了GST下拉实验中使用的各种GST-β-catenin（3–5、9、10道）和SATB1（13、14道）截短物的纯度。His-SATB1对应于6×组氨酸标记的全长SATB1，CD+HD是SATB1的C末端一半，包含DNA结合区域，而PDZ表示SATB1的N末端1–204氨基酸包含其PDZ样信号结构域。
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图S4
β-连环蛋白激活SATB1介导的转录。如以下所述，在MAR-连锁报告物分析中监测SATB1和组成活性突变体β-连环蛋白（T41A）过度表达的功能后果：材料和方法IgH-MAR-核糖核酸酶结构由IgH-MA的25 bp富含AT-的核心的七个拷贝组成[62]是SATB1的高亲和力结合位点[23],[24]在pGL3Basic载体（Promega）中克隆。IgH-MAR本身促进荧光素酶的转录[30]已知SATB1与该元素结合并抑制相关报告子的转录[17]每个误差条表示从三倍计算的标准偏差。
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图S5
从新生儿胸腺中分离出人类胸腺细胞，如材料和方法并如所述与OP9或OP9-DL1细胞共同培养
[63]
.简而言之，胸腺细胞在补充有10%FCS的RPMI 1640培养基（Invitrogen）和Wnt3a（10µg/ml）（Wnt激动剂）或DKK1（100 ng/ml）（Wnt抑制剂）的OP9或OP9-DL1细胞单层上培养48小时。共同培养还补充了rIL-7（5 ng/ml）和FlT3配体（5 ng/ml）（研发系统）。（A） 48小时后采集细胞，使用标准方案通过MTT分析监测细胞活力。简单地说，将噻唑蓝四唑溴化物（USB）以1 mg/ml的浓度添加到胸腺细胞培养物中，并孵育1 h。通过离心收集细胞，将细胞颗粒重新悬浮在二甲基亚砜中，并在570 nm处进行测量。将吸光度读数转换为存活率百分比，并将对照未处理细胞的存活率标准化为100%。（B） 在共培养48小时后，用台盼蓝染料排除法评估细胞死亡。在相应时间点后采集胸腺细胞，并将其重新悬浮在PBS中。向细胞悬浮液中加入少量0.4%Tryan蓝，并在室温下培养5分钟。然后使用血细胞仪观察细胞，并对因活性染料排斥而未内化染料的细胞进行计数并换算成存活率。对照未经处理的细胞的存活率标准化为100%。如（A）和（B）所示，经Wnt3a或DKK1处理并与对照OP9或OP9-DL1细胞共同培养的胸腺细胞的活力没有显著差异。（C，D）Wnt信号对典型Wnt调节基因BCL-X转录状态的影响L（左）（C） 胸腺细胞中的PP2A（D）。如上所述，胸腺细胞与对照OP9或OP9-DL1细胞共同培养。使用从对照人类胸腺细胞和用Wnt3a或Dkk1处理48小时的胸腺细胞中提取的RNA进行定量RT-PCR分析，如材料和方法。与未经处理的对照组相比，处理细胞中的基因表达值被标准化，设置为1。右边的颜色键表示各种处理和共培养。
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图S6
多基因调控区的SBS分析。EMSA分析使用32P标记的上游监管区域来自中国,PPM1A（PPM1A）,c-Myc公司基因，以及BCL2级纯化的GST用作GST:SATB1融合蛋白的对照。从1 kb上游区域测试的多个区域中国和PPM1A（PPM1A）示意性地描绘在EMSA面板的顶部。两个区域（一个位于近端中国启动子和远端一个PPM1A（PPM1A）启动子）以非常高的浓度结合SATB1，这表明亲和力非常低。恒星表示SBS，而圆圈表示非结合区域。左下角的面板描述了重组SATB1与32包含人类−1183至−1383 bp的P标记区域c-Myc公司发起人。
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图S7
SATB1和β-catenin占据
白介素-2
和
c-Myc公司
体内启动子。（A） Jurkat细胞的ChIP-PCR分析显示SATB1和β-catenin在白介素-2LiCl存在（+）和不存在（−）时的启动子。按照中所述进行ChIP分析材料和方法LiCl治疗导致在IL-2启动子SBS处SATB1的占有率增加，随后可能在该位点招募β-catenin。用于ChIP的抗体显示在车道顶部。（B） 对使用Wnt激动剂BIO处理的Jurkat细胞进行ChIP-PCR分析，如材料和方法SATB1和β-catenin均占据人体SBSc-Myc公司在这些条件下（顶面板，第2和第3车道）。上游区域（−10 kb）c-Myc公司用作ChIP（下面板）的阴性对照。
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图S8
SATB1在体外不与TCF共识相结合。使用重组SATB1的TCF共有结合位点的体外结合分析通过EMSA进行，如材料和方法各面板使用32P标记的野生型（1-5道）和突变TCF（6-10道）共有序列。32P-标记的IgH-MAR被用作SATB1结合的阳性对照（11–15车道）。
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图S9
CD4极化的确认+T细胞到TH（H）1和TH（H）2个子集。T细胞培养上清中标志性细胞因子的定量H（H）使用复合珠阵列读取器同时进行72 h的细胞生长，如材料和方法正如预期的那样，TH1细胞产生IFN-γ和IL-12，而TH（H）2个细胞产生IL-4，证实这些细胞属于各自的谱系。
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图S10
c-Maf在T细胞分化中的表达分析H（H）细胞。天真的CD4+用双重siSATB1、siβ-catenin或SATB1过表达质粒DNA转染T细胞，并按材料和方法作为对照，转染双链干扰RNA（Scr）。极化72小时后，分离出总RNAGATA-3协议转录物通过定量RT-PCR进行分析，如材料和方法在这些细胞中，c-Maf的表达与β-actin的表达相一致。该图显示了对照组（Scr）中c-Maf转录物的相对变化（bars 1和5）、SATB1沉默（bars 2和6）、SATB1-过度表达（bars 3和7）和β-连环蛋白沉默（bars-4和8）TH（H）0（钢筋1-4）和TH（H）2个（5–8条）电池。根据干扰RNA转染的T细胞计算表达水平的变化H（H）c-Maf表达水平设置为1（bar 1）的0子集。每个误差条代表三倍计算的标准偏差。天真的CD4+用双重siSATB1、siβ-catenin或SATB1过表达质粒DNA转染T细胞，如材料和方法和所述的体外分化[26]作为对照，转染双链干扰RNA（Scr）。极化72小时后，分离出总RNAGATA-3协议转录物通过定量RT-PCR进行分析，如材料和方法.GATA-3协议β-actin在这些细胞中的表达正常化。该图显示了折叠变化GATA-3协议对照转录物（Scr）（bar 1）、SATB1沉默（bar 2）、SATB1-过度表达（bar 3）和β-连环蛋白沉默（bar 4）TH（H）2个单元格。计算干扰RNA转染T的折叠变化H（H）0子集，其中GATA-3协议将表达水平设置为基线（条1）。每个误差条表示从三个样本中计算出的标准偏差。
（0.11 MB畅通节能法）
图S11
IL-4在siRNA介导的SATB1沉默诱导T细胞分化中下调H（H）2个单元格。人CD4+用Scrambled（Scr）和si-SATB1合成双链RNA转染T细胞，然后极化为T细胞H（H）如中所述材料和方法72小时后，收集细胞并用于监测IL-4的表达。（A） IL-4基因表达谱。总RNA被分离出来，IL-4转录物被RT-PCR分析，如材料和方法GAPDH的表达作为RT-PCR中RNA量的对照。（B） CD4+T细胞在TH（H）在2种条件下培养3天后收获细胞。在收获细胞前4小时，将布雷费尔丁A添加到培养基中。在室温下使用1%多聚甲醛将细胞固定20分钟。然后用0.5%皂苷使细胞渗透，并用抗IL-4-PE偶联物（BD Biosciences）染色30分钟。用流式细胞仪（BD FACS Calibur）采集染色细胞，并用CellQuest软件（BD bioscience）进行分析。
（1.96 MB TIF）
图S12
上游监管区域分析
GATA-3协议
.体外结合分析GATA-3协议使用重组SATB1的启动子由EMSA执行，如材料和方法SATB1在2 kb（+1至−2000 bp）上游调控区的结合GATA-3协议通过使用监视32该区域的P标记片段。我们重点研究了在−900到−600 bp的区域中的高亲和力SBS和在上游区域中包含人类−1800到−1500 bp的非SBSGATA-3协议发起人。EMSA面板顶部的示意图描述了启动子内这些区域的相对位置。星号表示SBS的位置，而圆圈表示非结合位点。
（0.25 MB TIF）
表S1
基因和基因ID列表。本文中研究或提及的基因及其各自的基因ID被制成表格。
（0.05 MB DOC）
视频S1
SATB1和β-连环蛋白在小鼠胸腺细胞的细胞核中共定位。三重染色免疫荧光图像（Alexa 488、Alexa 546和DAPI）。胸腺细胞核用DAPI进行复染，以标记细胞核中DAPI强区和弱区。这部电影描绘了与。使用AxioImager Z1立式荧光显微镜（卡尔蔡司）的“Apotome”模块以0.2µm的间隔捕获图像的光学部分。使用反褶积软件（Carl Zeiss）中的逆定理对图像进行进一步处理。这两种蛋白质的“笼状”染色模式包围着异色斑点，至少在整个胸腺细胞核部分重叠。
（0.05 MB WMV）
视频S2
β-catenin在小鼠胸腺细胞核内形成一种典型的“笼状”亚结构。单染色免疫荧光图像（Alexa 488）。这部电影描绘了与。如上所述，使用Apotome模块（卡尔蔡司）拍摄图像。β-catenin染色模式明显类似于SATB1的“笼状”分布特征。
（0.04 MB WMV）
致谢
我们感谢C.Neuveut博士的β-连环蛋白突变体T41A和GST 1-12臂重复表达构建体，M.Dunach博士的pGEX6P3-β-连环蛋白，R.T.Moon博士的TOP/FOPFlash报告构建体，以及J.C.Zúñiga-Pflücker博士的OP9-GFP和OP9-DL1细胞。我们感谢Pavan Kumar博士对ChIP实验的建议，感谢J.Dhawan博士和S.Chiplunkar博士的讨论。S.Gawai和T.Bhankhede提供了出色的技术帮助。我们感谢基因型技术的M.C.Raja博士、S.Rao博士和V.Madavan博士在微阵列数据分析方面的帮助。我们感谢H.Ahlfors对CD4的建议+T细胞分离。
缩写
| ACF公司 | ATP利用染色质组装和重塑因子 |
| 手臂 | 阿玛迪略 |
| 生物 | 6-溴代二脲-3′-肟 |
| 美国海关与边境保护局 | CREB结合蛋白 |
| 光盘 | 剪切域 |
| 炸薯条 | 染色质免疫沉淀 |
| CREB公司 | cAMP反应元件结合蛋白 |
| C类吨 | 阈值周期 |
| DAPI公司 | 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚 |
| DKK1（丹麦克朗） | 迪克科夫1 |
| 数据链路1 | 类Delta配体1 |
| 二甲基亚砜 | 二甲基亚砜 |
| DN（公称直径） | 双重负极 |
| DP公司 | 双重正极 |
| EMSA公司 | 电泳迁移率漂移分析 |
| 未来作战系统 | 胎牛血清 |
| 三层楼 | FMS样酪氨酸激酶3 |
| 法兹 | 卷曲的 |
| GSK-3β | 糖原合成酶3β |
| 消费税 | 谷胱甘肽S转移酶 |
| H3K9小时 | 组蛋白3赖氨酸9 |
| 帽子 | 组蛋白乙酰转移酶 |
| 高清 | Homeo域 |
| HDAC1型 | 组蛋白脱乙酰酶1 |
| HEK公司 | 人类胚胎肾 |
| HMG公司 | 高流动性集团 |
| 干扰素γ | γ干扰素 |
| 白介素-10 | 白细胞介素10 |
| 白介素-12 | 白细胞介素12 |
| 白介素-13 | 白细胞介素13 |
| 白介素-4 | 白细胞介素4 |
| 白细胞介素-7 | 白细胞介素7 |
| IP（IP） | 免疫沉淀 |
| LEF公司 | 淋巴增强因子1 |
| 氯化锂 | 氯化锂 |
| 宗教硕士 | 矩阵连接区域 |
| MTT公司 | （3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴） |
| 美国公共广播电视公司 | 磷酸盐缓冲盐 |
| PCAF公司 | p300/CBP相关因子 |
| 浦东新区 | 突触后密度蛋白（PSD95）、果蝇椎间盘大肿瘤抑制因子（DlgA）和闭锁带蛋白-1（zo-1） |
| 招标书 | 红色荧光蛋白 |
| RPMI公司 | 罗斯韦尔公园纪念学院 |
| 逆转录聚合酶链反应 | 逆转录聚合酶链反应 |
| 萨特B1 | 富含AT的特殊结合蛋白1 |
| SBS公司 | SATB1结合序列 |
| SDS公司 | 十二烷基硫酸钠 |
| 服务提供商 | 单个正极 |
| STAT4（状态4） | 信号转导子和转录激活子4 |
| 状态6 | 信号转导子和转录激活子6 |
| 吨H（H） | T助手 |
| 待定 | TATA结合蛋白 |
| TCF公司 | T细胞因子 |
| TCR公司 | T细胞受体 |
| 工作分解结构 | 西方印迹法 |
| Wnt（重量） | 无翼型 |
脚注
提交人声明，不存在相互竞争的利益。
这项工作得到了英国威康信托基金的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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