一种新的表观遗传机制果蝇属PIWI和piRNAs介导的体细胞

摘要

一个新的主题是，干细胞的命运和其他发展的基本属性并不是由几个基因的开启或关闭决定的。相反，它们是通过以可遗传的方式改变染色质的局部和全局组织来调节基因组的转录活性来决定的，这个过程称为表观遗传程序设计(苏拉尼2001). 表观遗传学是指通过染色质结构和/或DNA甲基化的可遗传但可能可逆的变化而不是DNA序列本身来调节基因表达。表观遗传编程的调节器被称为表观遗传因子包括特异染色质因子、组蛋白修饰蛋白和DNA甲基化/去甲基化酶。

近年来，非编码小RNA在表观遗传染色质结构域形成中的作用已被揭示，这主要是由于在裂变酵母中令人兴奋的发现葡萄裂殖酵母(Verdel等人，2004年). 核内的非编码小RNA被提议在DNA序列和表观遗传状态之间提供序列特异性接口，可能是通过它们与基因组DNA或新生RNA的碱基连接(瓦森格尔2005). 最近对裂变酵母的研究表明，RNAi介导的异染色质组装是通过自我诱导环机制进行的(Motamedi等人，2004年；Noma等人，2004年；Verdel等人，2004年；Sugiyama等人，2005年). 这个前馈循环中的一个核心参与者是R（右）NAi诱导我启动t吨转录基因秒沉默（RITS）复合物，包含一个染色域蛋白（Chp1）、精氨酸1（Ago1）、一个新蛋白Tas3和siRNAs(Motamedi等人，2004年；Noma等人，2004年；Verdel等人，2004年；Sugiyama等人，2005年). Ago1通过与siRNA结合赋予序列特异性，并招募其他染色质蛋白来启动异染色质化(Noma等人，2004年). 尽管有这些令人兴奋的发现，但非编码小RNA在高等生物表观遗传调控中的作用在很大程度上仍未被探索。在本文中，我们提出了一种新的表观遗传机制果蝇属由Piwi蛋白和Piwi相互作用RNA（piRNAs）介导的体细胞。

精氨酸/Piwi蛋白质和piRNAs

这个鼠兔/argonaute公司(以前)基因家族因其在进化上对生殖系干细胞自我更新的保守功能而首次被发现(Cox等人，1998年；Bohmert等人，1998年；Moussian等人，1998年). 这个基因家族可以分为以前和鼠兔亚科，这里称为以前和鼠兔基因。这两个亚家族编码由四个结构域组成的高碱性蛋白质（pI~10）：可变长度的N末端结构域，中央PAZ(P（P）iwi、，A类rgonaute，以及Z轴wille）结构域与无序列特异性的单链小RNA的3′部分结合，参与小RNA结合的中间结构域，以及RNase H样C末端Piwi结构域(Wang等人2008). 一些Ago蛋白的Piwi结构域具有RNA切片活性，负责由小干扰RNA（siRNAs）介导的mRNA降解(Liu等人，2004年). 然而，并非所有Ago或Piwi蛋白都检测到这种活性(Liu等人，2004年)表明不同的Ago和Piwi蛋白在生化上是不同的。

众所周知，Piwi蛋白具有多种生殖系功能。例如，两种Piwi蛋白果蝇属Piwi和Aubergine最初是在早期胚胎中建立生殖系所必需的母体因子(哈里斯和麦克唐纳2001；Megosh等人，2006年). 母体Piwi的剂量决定了早期胚胎中原始生殖细胞（PGC）的数量。随后，需要Piwi来维持PGC的转录平静(考克斯1999)和种系干细胞自我更新(Cox等人，1998年). 在小鼠中，Piwi蛋白Mili和Miwi在精子发生过程中表达不同。Mili在精原细胞（包括雄性生殖系干细胞）精母细胞和圆形精子细胞中表达，而Miwi在粗线期精母细胞到伸长精子细胞中也表达(邓林2002；Kuramochi-Miyagawa等人，2004年；Unhavaithaya等人，2009年). 相应地，米利（−/−）小鼠生殖系干细胞自我更新受阻，少数逃逸的生精细胞在粗线期表现出终末期阻滞(邓林2002；Kuramochi-Miyagawa等人，2004年；Unhavaithaya等人，2009年). 这暗示Mili在生殖系干细胞自我更新和减数分裂中的作用。相反，米维（−/−）小鼠在圆形精子细胞阶段开始时表现出一致的阻滞，表明其作为精子细胞分化的关键调节器的作用(邓林2002；Kuramochi-Miyagawa等人，2004年；Unhavaithaya等人，2009年). 一个人鼠兔基因被称为希维语在睾丸中表达，其过度表达与起源于恶性PGC和/或生殖系干细胞的精原细胞瘤-常见睾丸癌相关(乔等人，2002年). 此外，鼠兔哺乳动物系统和果蝇属最近，与种系中的转座子沉默有关(Girard和Hannon 2008). 尽管Piwi蛋白在生殖系中具有公认的功能，但其潜在的分子机制仍不明确。

虽然人们普遍认为Piwi蛋白只在种系中起作用，但这些蛋白介导的分子机制在体细胞中，尤其是在果蝇属。这些研究果蝇属为Piwi在体细胞表观遗传调控中的作用提供了几行证据。首先，Piwi是体细胞和生殖细胞中的核蛋白，但早期分裂期（即合胞体）胚胎除外(Cox等人，2000年；Megosh等人，2006年). 其次，Piwi是体细胞中位置效应杂色的典型抑制因子(Pal-Badra等人，2004年)类似于其他关键表观遗传因子，如异染色质蛋白1（HP1）和HP2。第三，鼠兔缺乏导致组蛋白3在赖氨酸9（H3K9me）处甲基化缺失，HP1和HP2从体细胞的多烯染色体上离域(Pal Bhadra等人，2004年). 第四，如下文所述，Piwi直接与HP1相互作用。因此，当Piwi蛋白位于细胞核中时，它可能是异染色质组装所需复合物的关键成分，就像裂变酵母中的Ago1一样(Verdel等人，2004年). 有趣的是，这些研究强调了一个被忽视的事实：Piwi蛋白在体细胞中也有重要功能，至少在果蝇属人Piwi（hiwi）在人CD34+造血干细胞和祖细胞中的表达(Sharma等人，2001年)和胃上皮细胞(Liu等人，2006年)以及Piwi蛋白在涡虫新生代细胞中的表达和功能(Reddien等人，2005年；Rossi等人，2006年；Palakodeti等人，2008年)表明Piwi蛋白在其他生物体中也具有体细胞功能。体细胞中Piwi功能的研究也应阐明其在生殖系中的功能。

Piwi蛋白分子功能的一个重要线索在于其小RNA伴侣，即最近发现的piRNAs(Aravin等人，2006年；Girard等人，2006年；Grivna等人，2006年；Lau等人，2006年；Watanabe等人，2006年). piRNAs与小干扰RNAs（siRNAs）或microRNA（miRNA）在几个方面有所不同。首先，piRNAs与Piwi蛋白相互作用，但不与Argonautes相互作用。小鼠Piwi（Miwi）是piRNA生物生成和/或稳定性所必需的(Grivna等人，2006年)而小鼠Ago2是siRNA途径所必需的(Liu等人，2004年). 第二，piRNAs主要是24-31个核苷酸（nt），而不是~21个核苷酸。第四，大多数piRNAs以链特异性的方式以20–90 kbs的簇与基因组相匹配，每个簇可能代表一个长的单链RNA前体，或者更常见的是两个非重叠和发散转录的前体(Kim 2006年). 相反，siRNAs和miRNAs分别来自双链和短发夹RNA前体。最后，一些piRNA可能参与表观遗传调控（见下文）；而siRNAs和miRNAs通常以mRNAs为靶点。

在果蝇属，piRNA首先被分离为重复相关的小干扰RNA（rasiRNA）(Saito等人，2006年；Vagin等人，2006年). 与siRNAs和miRNAs不同，这些“rasiRNAs”与Piwi或茄子结合，但不与Ago蛋白结合(Vagin等人，2006年). 此外，这些“rasiRNA”的产生既不需要Dicer-1也不需要Dicer-2，它们分别产生miRNA和siRNA。因此，根据定义，它们是piRNAs。尽管如此，绝大多数的piRNAs与以前鉴定的rasiRNAs不同，因为它们表现出DNA链特异性。

Piwi-piRNA复合物与体细胞染色质上的piRNA对应位点结合

为了探讨Piwi蛋白和piRNA在体细胞表观遗传调控中的作用，我们重点研究了Piwi及其相互作用的piRNA在果蝇属。我们克隆了约13000个Piwi相关的piRNAs果蝇属(尹和林2007). 这些piRNA的大小呈高斯分布，平均长度为25个核苷酸，比哺乳动物的piRNA短，但比siRNA和miRNA长。尽管有这么多，但82%的这些piRNA只测序一次，这表明这一分析远未饱和，我们的约13000个piRNA可能只是整个库的一小部分。与此一致，我们收集的Piwi相关的piRNA与Gregory Hannon实验室的收集重叠(Brennecke等人，2007年)13904个Piwi相关的piRNAs中只有10%。进一步包括Haru Siomi实验室收集的330个Piwi相关piRNAs(Saito等人，2006年)，在所有三个集合中只有2个piRNA。根据这些数据，我们估计可能有205000个piRNAs存在于果蝇属仅与Piwi蛋白相关。

Piwi相关的piRNAs对应于所有类型的基因组序列(尹和林2007). 其中三分之一对应于基因组中的独特序列，包括基因编码序列和基因间序列。剩下的三分之二是从重复序列中转录的。事实上，大多数重复的piRNAs都来自转座子序列，该序列仅占全组装常染色体基因组的约10%。这些piRNAs在逆转录子编码区中的表达尤其过多。大量与Piwi相关的piRNAs被映射到着丝粒周围区域、着丝粒下区域和端粒。piRNA在非基因编码区的广泛分布暗示了它们在表观遗传调控中的潜在作用。

为了探索胞体中piRNA的表观遗传功能，我们将重点放在了一个piRNA上，该piRNA与3号染色体（3R-TAS）右臂亚巨细胞区（也称为端粒相关序列，TAS）中的重复序列唯一对应，该区域是3号染色体的一个特征良好的异染色质区域果蝇属这种piRNA（称为3R-TAS piRNA 1）在卵巢和卵巢外体细胞中表达，如果不完全存在，至少在细胞核中富集(图1B和​和3B）。第3页). 记住，Piwi也是体细胞和生殖细胞中的核蛋白(Cox等人，2000年)，我们假设Piwi-TAS piRNA复合物与体细胞和可能的生殖系细胞中3R-TAS基因组序列中的piRNA对应DNA序列相关。为了测试这种可能性，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验，以从整个苍蝇中沉淀Piwi，并量化了跨越3R-TAS1 piRNA编码序列的73-nt区域的数量（D：远端；图1A)，与Piwi共沉淀。Piwi与TAS重复序列相关，是非特异性对照的400倍，是管家基因的46倍49卢比。ChIP进一步证实了这种特定关联myc-piwi公司使用抗Myc抗体转基因。Myc-Piwi在2号染色体的基因间区域富集了16.6倍的3R-TAS（D），在2号染色体的基因间区域富集了11.4倍和11.5倍琥珀酸脱氢酶B和肌动蛋白88F基因。相反，Piwi与所检测的五个piRNA-poor基因组区域中的任何一个都没有关联，甚至与仅387 bp远的近端3R-TAS序列[TAS（P）]也没有关联(图1A). 因此，Piwi与编码3R-TAS1 piRNA的3R-TAS（D）密切相关。

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图1

与3R-TAS（D）序列唯一对应的3R-TAS1 piRNA的表达

（A）3R-TAS的组织。黑色箭头表示唯一映射的3R-TAS1 piRNA的位置和方向。（B）核糖核酸酶保护试验表明，3R-TAS1 piRNA可以保护一个597-bp的反义探针，该探针跨越piRNA编码区，在反义方向覆盖984-bp重复单元的386-982 nt。3R-TAS1 piRNA至少在核提取物（NE）中比全细胞提取物（WCE）中富集（如果不是唯一存在）。M： 10 bp DNA标记。修改自尹和林，2007。

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图3

Piwi促进3R-TAS异染色质的内显特征和转录活性

（A）修饰组蛋白H3Me的结合²K4、H3Me^三K4、H3AcK9、H3Me²K9、H3Me^三用ChIP和qPCR检测K9和HP1a及3R-TAS（D）。通过将3R-TAS（D）DNA的数量与肌动蛋白5C每个单独的实验重复至少三次。标准偏差用于指示误差线。（B）核糖核酸酶保护试验表明，野生型成虫卵巢和卵巢外细胞中均表达3R-TAS1 piRNA。它的表达在鼠兔¹和鼠兔²突变体，并大幅增加了P{周⁺，里⁺}A4-4页插入（四条单独维护的线，221,516,86-2卢比、和R86-2#3已检查，此处显示两行）。所有通道均装载等量的总RNA鼠兔和P{周⁺，里⁺}A4-4页（C）和（D）标注在底部。(C类)Piwi促进眼睛颜色报告基因的转录，白色，插入3R-TAS（D）序列。显示的是w个¹¹¹⁸；P{周⁺，里⁺}A4-4页野生型、杂合型和纯合型菌株鼠兔²背景。修改自尹和林，2007。

然后，我们通过对幼虫唾液腺多基因染色体中的Piwi蛋白进行免疫染色，确认Piwi与体细胞中的基因组序列结合。Piwi确实定位于染色体上富含H3K9me的许多条带，包括染色体3R-TAS区域(图2)。

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图2

PIWI与染色质相关，在许多区域与HP1a共定位

A类果蝇属野生型多线染色体代表的基因组果蝇属三龄幼虫唾液腺细胞。PIWI（绿色）显示与HP1a（红色）在沿着多线染色体臂的多个常染色带、端粒和色心的不同区域（包括3R-TAS区域（箭头））共定位。HP1a最集中于染色体中心和4号染色体。采用日期：Brower-Toland等人，2007年。

尽管直接观察3R-TAS1 piRNA与3R-TAS（D）序列的结合在技术上具有挑战性，但有六条证据强烈支持这种与Piwi的复合物结合：首先，这种piRNA至少在细胞核中富集，如果不是特别存在的话，就像Piwi一样；其次，如免疫共沉淀和电泳迁移率变化所示，它与Piwi结合(尹和林2007); 第三，只有这个piRNA对应于3R-TAS（D），实际上是从这个序列转录而来的(尹和林2007); 第四，Piwi与3R-TAS（D）位点特异性结合；第五，Piwi与多烯染色体上的许多位点结合，包括3R-TAS（D）位点，是核糖核酸酶敏感的(Brower-Toland等人，2007年); 最后，3R-TAS1 piRNA的过度表达可以在很大程度上修复3R-TAS（D）序列的表观遗传缺陷鼠兔突变体（见下文）。这些数据共同表明，Piwi和3R-TAS1-piRNA形成一个复合物，与piRNA匹配的DNA序列结合。

Piwi-piRNA复合物调节体细胞中靶基因位点的表观遗传状态

为了确定Piwi与TAS区域的结合是否对其染色质状态有任何影响，我们检测了野生型和野生型73-bp 3R-TAS（D）序列的组蛋白修饰鼠兔突变体使用对常染色或异色组蛋白修饰特异性的抗体通过ChIP飞行。令我们惊讶的是，在野生型苍蝇中，乙酰化组蛋白3K9、二甲基和三甲基组蛋白3k4等转录激活标记与TAS区域有大量关联，而异染色质标记如HP1a和甲基化H3K9却没有我们预期的那么丰富(图3A). 这表明异染色质可能具有转录活性。在鼠兔突变体，这些常染色组蛋白修饰从TAS区域显著减少。另一方面，异色标记，如HP1a，以及二甲基和三甲基组蛋白3K9，在鼠兔突变体。这表明Piwi可能与其相关的3R-TAS1 piRNA一起促进3R-TAS（D）的常染色特性。

为了测试3R-TAS1 piRNA水平是否对3R-TAS（D）的表观遗传状态有影响，我们分离出一个P元件突变，P{周+，里+}A4-4页插入3R-TAS（D）序列中。这种插入导致野生型苍蝇中3R-TAS1 piRNA的特异性过度表达(图3B)并在鼠兔突变体（数据未显示）。因此，这种对piRNAs表达的拯救恢复了3R-TAS（D）序列的染色质状态，常染色标记H3AcK4增加到野生型水平，异色标记也减少到野生型级别(图3A). 这表明3R-TAS1 piRNA参与了Piwi介导的3R-TAS（D）序列的表观遗传激活。

为了确定Piwi对这些染色质修饰的影响是否确实对体细胞中3R-TAS（D）的转录活性产生功能性影响，我们进行了两个实验来测定体细胞中序列的转录活性。首先，我们使用RNase保护试验来检测TAS piRNA本身的转录。3R-TAS1 piRNA确实是从卵巢和重要的卵巢外体细胞的这个区域转录而来的(图3B). 其次，我们进一步将眼睛颜色报告基因插入到3R-TAS（D）序列中，该序列仅为TAS-piRNA编码序列下游128 bp。在鼠兔⁺/鼠兔⁺苍蝇，眼睛的颜色是记者适度表达的眼睛。在鼠兔⁺/鼠兔⁺苍蝇，表达明显减少皮维⁻/鼠兔⁻突变体，表达几乎检测不到(图3C). 眼睛色素的三个独立定量表明，从杂合突变体到纯合突变体的报告基因表达至少减少了五倍。这些分析进一步支持了Piwi可能与3R-TAS1 piRNA一起促进体细胞中3R-TAS（D）序列功能的转录活性的假设。

Piwi对体细胞3R-TAS（D）转录活性的影响在细胞分裂过程中明显遗传，因为鼠兔突变体和Piwi对3R-TAS（D）的转录激活作用在苍蝇眼睛中以多克隆方式可变地表达(尹和林2007). 这表明Piwi介导的转录激活是一种表观遗传现象。据我们所知，这是第一个说明小RNA相关机制具有表观遗传激活功能的案例。

琵琶与异染色质蛋白1a（HP1a）直接相互作用

为了进一步研究Piwi介导的体细胞表观遗传机制，我们试图鉴定直接的Piwi相互作用物并确定其染色体定位。使用全长（FL）、N末端半体（NT）和C末端半体作为诱饵进行酵母双杂交筛选(图4A)，分别回收了102、100和0个强阳性毒饵(Brower-Toland等人，2007年). 102例Piwi-FL阳性中的44例和100例Piwi-NT编码的HP1a阳性中的39例，HP1a是表观遗传沉默系统的关键组成部分(James等人，1989年；Hiragami和Festenstein 2005)。

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图4

Piwi与HP1a直接互动

（A）PIWI Y2H屏幕中使用的诱饵。PIWI包含N、PAZ、MID和PIWI域。Y2H毒饵为PIWI-FL，残留物1-843；PIWI-NT，残留物1-491；和PIWI-CT，残留物492-843。显示了V30、V130和V813三个“PxV”序列的位置。（B）HP1a交互需要PIWI的V30而不是V130。野生型和V130A PIWI突变体产生相当强的LacZ信号；而V30A、V30A/V130A双突变体或阴性对照（“对照”）中的信号无法检测到。（C）HP1a-色素阴影域（CSD）二聚体与PIWI肽（TSRGSGDGPRVKVFRGSSSGD）复合物的模型。俯视图和侧视图分别显示在左侧和右侧面板中。HP1a-CSD二聚体的每个单体都是彩色编码的（绿色或蓝色）。PIWI肽中的CSD结合基序（PxVxV）以棒状模型（品红色）显示。显示了保守残基（P，V，V）的侧链。化学位移扰动计算为δ_反恐精英=(δ_H（H）²+（0.2δ_N个)²)^1/2经历显著共振扰动的HP1a残留物（δ_反恐精英>在PIWI肽滴定过程中，0.06 ppm）被涂成深绿色和深蓝色，并映射在CSD表面和带状图上。复合体的同源模型是使用XLOOK程序（Lee 1993）和PyMOL（Delano Scientific，South San Francisco，CA）生成的图形建立的。修改自Brower-Toland等人，2007年。

HP1a与Piwi的结合力强且高度特异：HP1a不会与一组无关的诱饵相互作用。HP1a也不能与四个Piwi同源物中的任何一个相互作用果蝇属（茄子，Ago1，Ago，2和Ago3(Brower-Toland等人，2007年). 相反，Piwi与HP1a相互作用，但不与其他两种HP1a样染色质蛋白HP1b和HP1c相互作用。

然后使用酵母双杂交分析和核磁共振分析绘制Piwi-HP1a相互作用域。已知HP1a通过与组蛋白3（H3K9me）的甲基化K9相互作用与异染色质结合。这种相互作用是通过N端色域实现的。此外，HP1a具有与组蛋白H1相互作用所需的中心枢纽结构域，以及HP1a二聚化和与包含PxVxL基序的许多HP1靶蛋白相互作用所需要的C末端色影结构域(Smothers和Henikoff 2000；Lechner等人，2005年). 删除分析表明，HP1a色度阴影域本身对于与NT-和FL-PIWI毒饵结合是必要和充分的。

使用两个果蝇属HP1a点突变会破坏色度阴影域调光器与其目标之间的相互作用(Brower-Toland等人，2007年). 在小鼠中，已知两个色影结构域对称地二聚，形成单一靶肽不对称结合的界面(Thiru等人，2004年). W200A突变不影响二聚化，但消除HP1与靶点中PXVXL基序的结合，I191E突变破坏HP1二聚化。PIWI结合在这两个HP1a突变体中都丢失，表明与PIWI的结合需要完整的Chromo Shadow Domain二聚体界面。相反，色素域突变V26M保持PIWI相互作用，从而消除H3K9me结合。因此，PIWI结合不需要HP1a与甲基化H3K9结合。

缺失分析表明，HP1a只需要PIWI的N域进行相互作用。该结构域包含两个已知的脊椎动物HP1结合基序PRVKV，一个以V30为中心，另一个以V130为中心。将V30突变为丙氨酸可消除HP1a的结合。相反，将V130突变为丙氨酸不会影响相互作用(图4B)。

以V30为中心的21聚体PIWI肽与HP1a-CSD二聚体的核磁共振滴定进一步证实了HP1a的色影结构域与V30为核心的PRVKV基序之间的直接相互作用(Brower-Toland等人，2007年). 在核磁共振时间尺度上，交换速率较慢，与HP1a-色素阴影域二聚体和PIWI肽之间的紧密结合一致。通过这些分析，可以构建调光器的结构模型果蝇属HP1a色影结构域，其中单个PIWI肽与HP1a色影结构域的二聚体结合。在核磁共振滴定过程中经历显著共振扰动的色影结构域残基主要分布在靠近PIWI肽的β链、中心螺旋的C末端部分和C末端延伸环。总之，这些数据强烈表明PIWI特异性地与HP1a结合，HP1a代表任何真核生物中RNAi成分和典型表观遗传机制蛋白之间的直接相互作用。

Piwi在体细胞的许多染色体位点与HP1a相互作用

由于Piwi和HP1a都是体细胞中的染色质相关蛋白，因此它们的相互作用可能发生在这些细胞的染色体上。为了测试这种可能性并评估Piwi-HP1a在染色体上的相互作用程度，进行了间接免疫荧光显微镜检查果蝇属唾液腺多线染色体。该实验揭示了PIWI在聚乙烯上的复杂带状分布，这与HP1a部分一致(Brower-Toland等人，2007年). 虽然HP1a染色显著定位于染色中心（中心周围异染色质的聚集）和主要异染色色的第四条染色体，但HP1a也存在于所有端粒和多烯染色体臂上200多条带中。染色体臂上HP1a结合的一个显著位点是细胞学区域31A，其中HP1a定位于八个离散带。PIWI在多类染色质位点以复杂模式与HP1a共定位，但在31A区完全缺失。在染色中心内，虽然HP1a分布均匀，但PIWI在每条染色体的着丝粒间异染色质内有不规则的颗粒分布。在第4染色体中，PIWI仅限于少数与HP1a相关的不同条带，包括端粒处或附近的一条。PIWI沉积也与多烯端粒中的HP1a重叠。这些数据表明，PIWI在许多染色体上与HP1相互作用，但不是在所有基因组位点上。

Piwi-HP1a相互作用是Piwi在体细胞中的表观遗传效应所必需的

Piwi和HP1a之间的直接相互作用可能代表了一种非常直接的方式，Piwi蛋白可以通过这种方式将表观遗传效应物招募到果蝇属基因组。为了测试PIWI-HP1a相互作用在体细胞中的功能意义，进行了两项检测(Brower-Toland等人，2007年). 第一，鼠兔编码野生型或V30A突变型的转基因鼠兔被引入鼠兔没有遗传背景。野生型转基因能够挽救生存能力，而V30A突变型转基因却未能做到这一点鼠兔转基因的表达揭示了在体细胞中作为4号染色体上异色基因沉默的显性抑制因子w个⁺眼睛中的报告基因(Pal-Badra等人，2004年). 这使得可以测量转基因拯救在杂合子中产生的显性沉默缺陷的能力鼠兔²等位基因。在这个不幸的不足鼠兔背景，野生型转基因的存在支持了杂色的更大沉默白色记者比V30A转基因的出现(图6). 这些数据强烈表明Piwi-HP1a相互作用直接参与沉默白色在这些体细胞中嵌入构成异染色质的报告者。此外，他们指出，Piwi对体细胞中基因组的不同位点具有相反的表观遗传效应。

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图6

一种新的表观遗传途径介导的Piwi和piRNAs

有关提案的详细信息，请参阅正文。未显示可能参与该途径的其他因素。

体细胞中许多基因组位点的HP1a结合和H3K9甲基化需要Piwi

然后我们研究了PIWI、HP1a和表观遗传学标记H3K9me之间的关系。长期以来，HP1a在很大程度上（但并非完全）依赖于SUVAR3-9家族组蛋白甲基转移酶（HMT）提供的H3K9me标记与染色体结合。此外，HP1靶向性和多基因染色体许多位点的H3K9me标记都依赖于鼠兔(Pal-Badra等人，2004年). 这表明Piwi作用于H3K9甲基化的上游以及HP1a与这些体细胞中的位点的结合。如果是这样，我们预计H3K9me标记将与Piwi在多基因染色体中共同定位，事实确实如此(Brower-Toland等人，2007年). 结合Piwi与HP1a结合以及HP1a可以与组蛋白甲基化酶结合的事实，这表明Piwi-piRNA可能将HP1a招募到这些位点以启动表观遗传标记。然后以某种方式进一步招募H3K9组蛋白甲基化酶，导致H3K9-甲基化以进一步异染色质化Piwi-piRNA靶位点。

这一机制预示着PIWI在多烯染色体上的定位不应依赖于HP1a的存在，PIWI与染色体的结合是RNA依赖的。这两个预测结果都是正确的。在一个HP1a型HP1a不可检测的突变，Piwi在染色质中的定位没有全球改变(图5B). 然而，当用核糖核酸酶A预处理多线染色体时，染色质上的PIWI染色大大减少(图5C)。

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图5

Piwi的染色质结合与H3K9甲基化重叠，依赖于RNA杂交，但不依赖于HP1a

除B外，所有图像均为野生型（俄勒冈州R）染色体，B显示Su（变量）2-5（HP1a基因）突变染色体。（A）PIWI在染色体中心和第四染色体上与二甲基H3K9有显著重叠，但在31区（箭头）没有重叠。（B）在缺乏HP1a的情况下，多线染色体的PIWI定位不会受到全局干扰。与野生型染色体相比，Su（var）2-5染色体尺寸较小，因此在高倍镜下显示。（C）RNase A的温和处理消除了在未处理的染色体上看到的PIWI结合模式，而不会干扰HP1a。采用日期：Brower-Toland等人，2007年。

Piwi/piRNA介导的表观遗传机制：Piwi-piRNA指导假说

上述结果揭示了由Piwi及其相关的piRNA介导的体细胞中的一种新的表观遗传途径，并使我们能够提出以下“Piwi-piRNA指导假说”(图6)：PIWI-piRNA复合物通过piRNA-DNA碱基配对（通过常规或非常规配对机制）或通过piRNA形成双链与piRNA-对应的基因组序列结合，其中新生的非编码RNA转录物从目标基因组序列转录而来。这导致HP1a分子直接募集到基因组位点，从而引发异染色质化。然后，PIWI-piRNA-HP1a复合物进一步招募HMT，如SU（VAR）3-9来甲基化H3K9，这进一步导致异染色质的稳定和/或增强。

该模型与裂变酵母中提出的RNAi模型不同(Volpe等人，2002年) (Noma等人，2004年). 我们的模型代表了HP1初始定位的H3K9me独立模式，这是一种在特定基因组位点触发异染色质形成的替代但可能有效的方法。在这个模型中，Piwi在基因组中某些位点的表观遗传激活效应可以通过招募表观遗传活化剂或通过使HP1a在特定基因组位点显示表观遗传活性来实现。以前曾报道过这种功能(Hediger和Gasser 2006)。

异染色质的形成可能由不同的机制引导。在这种情况下，HP1a的存在可以使PIWI与异染色质稳定结合，从而实现转录后基因沉默。也可能Piwi-piRNA-介导的机制作用于早期发育阶段，而不是表达的表观遗传表型。此外，有证据表明Piwi蛋白也可以介导其他分子机制，尤其是当它们位于细胞质中时。无论这些可能性如何，体细胞中揭示的Piwi-piRNA介导的表观遗传机制也可能负责生殖系中不同的Piwi功能，因为Piwi和piRNA的定位也位于生殖系的细胞核中。

总结性意见

基因表达的表观遗传编程代表了干细胞研究的一个令人兴奋的新前沿。表观遗传编程中一个关键但本质上尚未探索的问题是，表观遗传调控因子（大多数缺乏DNA序列识别能力）是如何正确引导到基因组中的特定位点以发挥其功能的。最近的研究表明，转录因子可能起到这样的指导作用。即使如此，这也只能解释一小部分基因组的靶向性，因为绝大多数基因组都不是基因编码的。我们的工作果蝇属体细胞表明，Piwi及其相关的piRNAs引导表观遗传调控到特定的基因组位点。事实上，Piwi及其piRNAs的这种功能可能代表了果蝇属体细胞，考虑到Piwi与多线染色体的许多区域的关联，以及Piwi相关的piRNAs在整个基因组中针对不同区域的足够复杂性。然而，仅此机制可能不足以解释整个基因组的表观遗传编程，因为Piwi不与所有HP1a位点结合，而HP1a可能不参与所有基因组位点的表观遗传学编程。其他问题也仍然存在：果蝇属基因组受Piwi-piRNA介导的机制调控？Piwi-piRNA机制在进化过程中被广泛采用了吗？这种机制也存在于生殖系中吗？这些问题的答案应该会对干细胞生物学和发育生物学产生巨大影响。

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