过氧化氢（H2O（运行）2)是生物体内生理、衰老和疾病的一种越来越被认可的小分子介质。1–6在这方面，H的异常产生或积累2O（运行）2随着时间的推移，由于环境压力和/或基因突变，细胞线粒体内的线粒体与严重疾病有关，其中年龄是一个危险因素，包括癌症7以及神经变性阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病。8,9实际上，过氧化氢酶（一种过氧化物解毒酶）的过度表达和线粒体靶向性可以延长小鼠模型的寿命。10另一方面，新的数据表明，线粒体H的爆发受到控制2O（运行）2还可以对细胞生存、生长、分化和维持起到有益的作用。三–6
允许可视化线粒体H的局部生成和积累的新成像方法2O（运行）2活性氧（ROS）对健康和疾病状态的复杂贡献，在活体样本中可能有用。合成荧光H2O（运行）2可以精确定位亚细胞位置的指标为实现这一目标提供了一种方法，并且不需要像蛋白对应物那样进行转染，11–12但传统的活性氧指示剂，如二氢罗丹明（DHR）是不带电的，因此在氧化前不会优先定位在细胞中。13此外，DHR和相关染料对H没有特异性2O（运行）2超过其他ROS。因此，以线粒体为靶点的小分子检测特定活性氧的情况仍然很少13,14迄今为止报告的所有探针都没有对H有选择性2O（运行）2我们现在报道了线粒体过氧黄1（MitoPY1）的合成和应用，这是一种用于线粒体H成像的新型荧光团2O（运行）2在活性氧和空间特异性的活细胞中。
线粒体H荧光成像的总体策略2O（运行）2在生命系统中，是要创造包含过氧化物反应元件和线粒体靶向部分的双功能染料。出于后一个目的，我们受到了墨菲等人使用鏻头基团向线粒体输送抗氧化剂、电泳物、EPR和光学探针的启发，因为这些和相关的亲脂阳离子由于质子梯度的考虑而选择性地积聚在这个细胞器中。14–16此外，我们寻求一种模块化合成路线，该路线将允许在安装硼酸盐开关后容易地引入鏻或任何其他期望的靶向基团，它避免了敏感功能引起的潜在并发症，这些功能与通常用于引入H的钯催化的Miyaura-Suzuki反应不兼容2O（运行）2-可劈开的硼酸盐笼。这两个设计标准都可以通过用于合成MitoPY1。硼化后添加额外基团的能力为生成新的多功能H提供了大量机会2O（运行）2成像探头。
MitoPY1具有两个主要的可见区吸收（λ防抱死制动系统=489 nm，ε=14300 M−1厘米−1; 510 nm，ε=14200 M−1厘米−1)和弱发射（λ相对长度单位=540 nm，Φ=0.019，图S1)在20 mM HEPES中，pH值为7。MitoPY1与H的反应2O（运行）2通过转化为MitoPY1ox引发荧光增加，MitoPY1ox在510 nm处具有一个主要吸收带（ε=22300 M−1厘米−1)和增强发射（λ相对长度单位=528纳米，Φ=0.405）。氢的动力学测量2O（运行）2-在假一级条件下（5µM染料，10 mM H2O（运行）2)，给出观察到的速率常数k个= 2.0(1) × 10−3秒−1.显示了MitoPY1对一组生物相关活性氧的相对开启荧光反应。由于其化学特异性的硼酸盐开关，17,18探针对H有选择性2O（运行）2活性氧类超氧物、一氧化氮和羟基自由基。
5µM MitoPY1对各种活性氧物种（ROS）的荧光响应。条形图表示添加每个活性氧后0、5、15、30、45和60分钟的相对反应。所示数据适用于10 mM O2−、200µM NO和100µM用于所有其他ROS。在25°C下，在pH为7的20 mM HEPES中采集数据，激发λ=503 nm，发射收集在510至750 nm之间。
然后测试MitoPY1靶向线粒体和对H反应的能力2O（运行）2在活的生物系统中。根据共焦显微镜的测定，宫颈癌HeLa细胞在37°C下负载5µM MitoPY1 1 1小时，在离散亚细胞位置显示微弱但可测量的荧光水平(). 50 nM MitoTracker Deep Red（一种商用线粒体指示剂）的协同训练实验()，或500 nM LysoTracker Red，溶酶体指示剂(图S4–S7)，确定从MitoPY1观察到的荧光定位于这些活细胞的线粒体。添加100µM H2O（运行）2与对照细胞相比，负载有MitoPY1的HeLa细胞显示出明显的局部荧光增强(). 再次，与MitoTracker的联合染色证实了染料保留在线粒体中，并检测到H的局部升高2O（运行）2浓度。Brightfield测量和Hoechst 33342核染色表明，这些细胞在整个成像实验中是可行的(). 此外，使用缺少鏻靶向部分（ContPY1，图S9-S12)或氧化探针（MitoPY1ox，图S13–S18)确认只有MitoPY1以线粒体为靶点，并进行补充流式细胞术实验(图S8)在较大的细胞群上提供支持数据。最后，在Cos-7、HEK293和CHO中进行类似实验。K1细胞株给出了类似的结果，并扩大了探针的范围(图S5–S7). 综上所述，这些数据证实了MitoPY1是针对细胞线粒体的，在那里它可以对H的局部变化作出反应2O（运行）2活样本中的水平。
线粒体H增加的活HeLa细胞的共焦荧光图像2O（运行）2使用MitoPY1可视化的级别。显示的图像表示MitoPY1在510 nm激发时在527-601 nm光学窗口中收集的发射强度。HeLa细胞在37°C下用5µM MitoPY1培养60分钟，并用MitoPY1（a）、MitoTracker Red和Hoechst（叠加，b）和MitoPJ1用MitoTracher Red（叠加，C）成像。HeLa细胞与5µM MitoPY1在37°C和100µM H下孵育60分钟2O（运行）2在最后40分钟内添加，并使用MitoPY1（d）、MitoTracker Red和Hoechst（叠加，e）、Mito PY1和MitoTracher Red（叠加，f）以及带有20µm比例尺的亮场（g）进行成像。HeLa细胞在37°C下用5µM MitoPY1孵育60分钟，并用MitoPY1（h）、MitoTracker Red和Hoechst（叠加，i）和MitoPJ1用MitoTracher Red（叠加，j）成像。HeLa细胞用1 mM百草枯孵育24小时，然后用5µM MitoPY1清洗并在37°C孵育60分钟，并用MitoPY1（k）、MitoTracker Red和Hoechst（overlay，l）、Mito PY1和MitoTracher Red（overly，M）和brightfield（n）用20µM标尺成像。
最后，我们试图利用MitoPY1来可视化H的内源性生成2O（运行）2在活细胞的线粒体中。为此，我们用百草枯处理HeLa细胞，百草枯是一种小分子氧化应激诱导剂，可产生类似帕金森氏症的表型。19中的图像线粒体定位H明显增加2O（运行）2与对照细胞（IC）相比，暴露于1 mM百草枯的细胞内MitoPY1检测到的水平50百草枯在HeLa细胞中的含量为1.02 mM）。20这些数据表明MitoPY1足够灵敏，可以检测局部线粒体H2O（运行）2帕金森模型中与氧化应激相关的升高。
最后，我们介绍了MitoPY1的合成、性质和生物应用，这是一种新的靶向荧光探针，可以选择性检测H2O（运行）2在活细胞的线粒体中。我们的数据表明，MitoPY1能够成像H水平的变化2O（运行）2在多种哺乳动物细胞系的线粒体内，以及H2O（运行）2帕金森氏病氧化应激模型引起的血压升高。除了将MitoPY1和相关化学工具应用于线粒体氧化还原生物学研究之外，我们预计这种模块化探针支架将被证明有助于创建新的多功能探针，用于生命系统中的靶向、激活和检测，并正在积极探索这些可能性。
