组织工程A部分。2009年3月；15(3): 579–585.
生物分子调控和引导内皮细胞形态发生的聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶的微图案化
德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物工程系。
通讯作者。将转载请求发送至：Jennifer L.West博士，莱斯大学生物工程系，邮政信箱1892，MS 142，休斯顿，德克萨斯州77251-1892。电子邮件：ude.ecir@tsewj 收到日期：2008年4月1日；2008年6月2日接受。
摘要
血管生成是内皮细胞在新生血管形成过程中进行的形态发生，传统上是以天然细胞外基质蛋白为基础进行研究的。在这项工作中，我们旨在调节和引导合成的生物活性聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶的血管生成。PEGDA水凝胶本质上是细胞非粘附性的，对蛋白质吸附具有高度抵抗力，允许对细胞粘附和信号传递的配体的呈现进行高度控制。由于这些材料是光聚合的，各种光刻技术可用于生物活性配体的空间控制呈现。为了操纵EC粘附、迁移和小管生成，PEGDA水凝胶的表面用细胞粘附配体Arg-Gly-Asp-Ser（RGDS）以所需的浓度和几何形状进行微图形化。在这些RGDS模式上培养的内皮细胞将其细胞体重组为50μm宽条纹上的线状结构，但在更宽的条纹上没有，这表明内皮细胞的形态发生可以由几何线索调节。内皮细胞形成的索状结构让人想起毛细血管，细胞参与自组装和重组，形成多细胞结构。此外，中等浓度的RGDS（20μg/cm）刺激内皮索形成2而在较高浓度下则受到抑制。这项工作表明，血管生成反应可以通过生物活性配体的微模式化来严格调控和指导，并且还显示了微模式化PEGDA水凝胶在组织工程中的各种应用的巨大潜力，其中植入前的血管化至关重要。
介绍
T型血管的形成对组织的建立和维护至关重要。血管生成是指通过从原有血管中萌芽形成新的毛细血管的过程，经常被研究在体外通过刺激内皮细胞单层组装成芽或管。1这种新血管形成的复杂过程是由内皮细胞与其相邻壁细胞之间通过各种细胞因子、细胞外基质（ECM）蛋白、整合素和蛋白酶相互作用协调的。2自从引入在体外血管生成模型，三人们对了解血管生成的复杂过程产生了极大的研究兴趣；然而，控制血管生成的条件的细节尚待描述。
天然ECM由于易于制备和操作，在血管生物学研究中得到了广泛应用。为了检查二维（2D）表面上的血管生成，Matrigel经常用于覆盖组织培养板，EC在存在血管生成或抗血管生成分子的情况下进行电镀。4,5在适当的血管生成分子的作用下，内皮细胞组织成细绳状，最终在4-8小时内组装成蜂窝状结构。6然而，由于Matrigel由多种ECM蛋白和生长因子组成，因此很难描述刺激血管生成的特定相互作用。在更明确的研究中，研究了单个ECM蛋白对血管生成的影响。将毛细血管内皮细胞培养在预先涂有不同浓度纤维连接蛋白的培养皿上，在高度粘附（>500 ng/cm）的培养皿中刺激或抑制细胞扩散和生长2)和非粘性（<100 ng/cm2)ECM基板。三,7有趣的是，中等纤连蛋白涂层密度（100–500纳克/厘米2)促进EC管网在1-2天内形成。
利用各种可用的微图形技术，可以更精确地控制ECM涂层基板的密度和几何形状。特别是，一些研究小组利用微接触打印技术研究了ECM蛋白的几何分布对内皮细胞形态发生成管状结构的影响。8,9在这项技术中，10,11通过将预聚物浇铸在浮雕图案上，制备了聚二甲基硅氧烷印章，并将印章浸入含有硫醇的溶液中。然后将印章与金基底保形接触，使硫醇部分留在图案中。在一项研究中，使用烷硫代酯自组装单层的微接触印刷在金上形成具有不同几何形状的纤维连接蛋白岛，而内皮细胞在10微米宽的纤维连接蛋白线上形成管状结构。8,9,12在另一项研究中，通过微接触印刷法对壳聚糖和明胶进行微图案处理，内皮细胞同样在20μm明胶线上进行毛细血管形态发生。12这些研究表明，通过微模式化创建定义明确的底物可以为研究血管生成的进展提供有用的工具。尽管这些研究使用微模式技术成功地分离和研究了ECM的几何线索，但它们的系统仍然与ECM蛋白质中存在的各种生化线索相混淆，ECM蛋白质参与了相当复杂的细胞相互作用，因为这些蛋白质使细胞具有多个细胞结合，生长因子结合以及隐秘结构域。13,14因此，需要一个更可控的系统来从ECM蛋白质的生化线索中分离几何线索。
与上述ECM蛋白或其单个组分的混合物不同，本研究使用了并入聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺（RGDS）作为研究EC血管形成的最基本基质。亲水性和高流动性主干PEG可抵抗非特异性蛋白质吸附和细胞粘附。15在这个非粘附表面上，可以系统地添加特定的生物活性因子，精确控制浓度和几何形状，以诱导良好的细胞相互作用。以前有报道称，用各种细胞粘附配体修饰的PEGDA水凝胶支持多种不同细胞类型的细胞粘附、增殖和迁移。15——18还通过光刻技术在水凝胶中对这些配体进行二维和三维（3D）微图形化，以指导细胞粘附和迁移。19——22
这项工作展示了合成的仿生PEGDA水凝胶作为生物相容性和生物活性基质用于诱导和调节血管形成的新应用。通过光刻技术用不同密度和几何形状的RGDS对PEGDA水凝胶进行微图形化，并在这些材料上诱导和引导EC形态发生为基本的毛细结构。
材料和方法
电池维护
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）取自Cambrex（新泽西州东卢瑟福），并在添加2 mM L-谷氨酰胺、1000 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素（西格玛，圣路易斯，密苏里州）的EC培养基EGM-2（Cambrex）上生长。细胞在37°C的5%二氧化碳环境中培养。所有实验均使用第3代至第8代细胞进行。
聚乙二醇的合成
如前所述合成PEGDA。15简单地说，在氩气中过夜，将12 g干燥PEG（6000 Da；福禄卡，密尔沃基，威斯康星州）置于36 mL无水二氯甲烷中，与0.25 g三乙胺和0.43 g丙烯酰氯（兰开斯特合成，温德姆，NH）反应。用2 M K清洗所得溶液2一氧化碳三并分离成水相和有机相。用无水MgSO干燥有机相4，PEGDA在乙醚中沉淀，过滤，并在真空下干燥。所得产品的分析方法为1H-NMR（Advance 400；德国哈瑙布鲁克），含D2O作为溶剂。
聚乙二醇衍生物的合成
细胞粘附配体RGDS（美国肽，加州桑尼维尔）通过与丙烯酸酯-PEG反应与PEG单丙烯酸酯偶联-N个-室温下，在50 mM碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5）中以1:1摩尔比的羟基琥珀酰亚胺（PEG-NHS，3400 Da；Nektar，Huntsville，AL）中放置2 h。对所得产物PEG-RGDS进行透析、冷冻干燥，并在−80°C下储存。类似地，辣根过氧化物酶（HRP）（Sigma）与PEG-NHS反应，随后与荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）（Invitrogen，Carlsbad，CA）以1:10摩尔比在室温下反应1小时。所得产物PEG-HRP-FITC用于帮助可视化水凝胶上的表面图案区域。使用配备紫外可见和蒸发光散射检测器（GPC；马萨诸塞州阿默斯特市聚合物实验室）的凝胶渗透色谱系统来确认聚乙二醇与RGDS的结合。
聚乙二醇水凝胶的表面图案化
使用光刻技术将单个或多个生物活性分子固定在PEGDA水凝胶表面，具有很高的保真度，并且其结合量被其在预聚物溶液中的初始浓度或光聚合过程中紫外线灯的暴露时间精确控制。20PEGDA水凝胶的表面图案涉及两个连续的光聚合步骤。首先，通过将0.1 g/mL PEGDA倒入10 mM HEPES缓冲盐水（pH 7.4）中，倒入矩形玻璃模具（0.5 mM厚）中，并将聚合物溶液暴露于长波紫外光（365 nm，10 mW/cm）下，制备基细胞非粘附PEGDA水凝胶2)30 s。在用磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）冲洗水凝胶后，用50μL含有不同浓度PEG-RGDS的第二聚合物溶液均匀地覆盖水凝胶表面，该溶液位于10 mM HEPES缓冲盐水（pH 7.4。
使用具有所需图案的透明面罩覆盖预聚物溶液的薄层，该面罩是使用Illustrator和标准激光打印机（LaserWriter 16/600 PS；Apple Computers，加利福尼亚州库比蒂诺）制备的。随后第二次暴露于紫外光下1分钟，允许丙烯酸酯化PEG-RGDS与水凝胶上未反应的丙烯酸酯结合，在PEGDA水凝胶的表面形成共价结合层。本研究中报告的表面PEG-RGDS浓度是根据PEGDA水凝胶表面的PEG-RGD用量计算得出的。
为了可视化水凝胶上的图案区域，使用PEG-HRP-FITC代替PEG-RGDS，并使用外荧光显微镜进行检查（Axiover 135；Carl Zeiss，Thornwood，NY）。所有聚合物溶液中均含有10μL/mL 2,2-二甲基-2-苯基-乙酰丙酮N个-乙烯基吡咯烷酮（300 mg/mL）作为光引发剂。在EGM-2培养基中培养2小时期间，从水凝胶中冲洗未结合肽。最后，将水凝胶切割成直径为2.0-cm的圆盘，并放置在24孔板中。
聚乙二醇水凝胶对HUVEC的粘附
在不同浓度PEG-RGDS的PEGDA水凝胶表面评估细胞粘附。制备的水凝胶样品的PEG-RGDS浓度为2、4、20和100μg/cm2形成50微米宽的条纹。HUVEC（45000个细胞/cm2)在培养1天后，用PBS清洗液去除非粘附细胞。用安装在相差显微镜（Axiover 135；Carl Zeiss）上的数码相机（尼康，梅尔维尔，纽约）拍摄细胞照片。对每个水凝胶上的粘附细胞进行胰蛋白酶处理，并使用Coulter计数器（加利福尼亚州Fullerton Coulter）测量细胞数量。
管子成型和可视化
为了检测图形化RGDS浓度对EC脐带形成的影响，HUVECs（45000个细胞/厘米2)接种在PEGDA水凝胶表面，表面有50μm宽的PEG-RGDS条带，浓度范围为2至100μg/cm2将培养2天的HUVEC固定在3.7%甲醛中15分钟，然后用0.5%Triton X-100在PBS中渗透10分钟。样品用3%牛血清白蛋白（BSA；Sigma）在PBS内封闭30分钟min，肌动蛋白和细胞核用四甲基罗丹明异硫氰酸盐（TRITC）结合的指骨肽（5U/mL；Sigma）1小时和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（300nM；Invitrogen）5分钟。在蔡司LSM 510 META系统（卡尔蔡司）上进行共焦成像。
为了研究图案几何形状对EC索形成的影响，HUVECs（45000个细胞/厘米2)将PEG-RGDS（20μg/cm）接种在PEGDA水凝胶上2)宽度为50至200μm的条纹。在细胞接种后的第1天和第18天，对每个样品中的随机区域进行拍照，以观察EC索形成前后细胞形态的变化。免疫荧光染色观察ECM蛋白的表达模式。如前所述，将标本固定、渗透和封闭，并与抗纤维连接蛋白、层粘连蛋白或I型胶原的一级抗体（PBS中用3%BSA稀释至1:25；Sigma）孵育2小时，与与Alexa fluor 488结合的二级抗体（在PBS中3%BSA中稀释至1:1000；Invitrogen）孵养1小时h.用外荧光显微镜（Axiover 135；卡尔蔡司）观察标本。
统计分析
使用Jmp 5.1（SAS Institute，Cary，NC）进行统计分析。数据集采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，然后采用Tukey诚实显著性差异（HSD）检验进行多重比较。第页-小于0.05的值被认为具有统计学意义。所有值均报告为平均值±标准偏差。
结果
聚乙二醇水凝胶的表面图案化
最近开发了一种利用光刻技术将肽固定在PEGDA水凝胶上的表面图案化技术，并在水凝胶表面上图案化了各种几何形状。20在当前的工作中，使用生物活性分子绘制不同宽度的直线，以促进PEGDA水凝胶上EC索的形成。用激光打印透明胶片，条纹留下50μm和200μm宽的空白线(). 为了有助于可视化，将与FITC偶联的聚乙二醇涂敷在水凝胶表面，通过在透明膜上施加紫外线1分钟，将丙烯酸酯部分选择性固定在特定区域洗涤h后，观察到FITC-结合条纹，宽度与原始图案一致，证实水凝胶表面图案成功().
聚乙二醇水凝胶的表面图案。(A类)宽度为50μm和200μm的条纹被激光打印在透明掩模上。(B类)PEGDA水凝胶表面用FITC-共轭PEG图案的荧光图像证实图案成功。(C类)HUVEC在带有PEG-RGDS图案的水凝胶上的粘附。比例尺=200μm。
为了证明用微图形RGDS引导HUVEC粘附在水凝胶上的可行性，水凝胶表面图形化了足够高浓度的PEG-RGDS，以允许细胞粘附。300μg/cm PEG-RGDS2将其涂敷在细胞非粘附性PEGDA水凝胶上，并通过透明面罩暴露于紫外线源。将得到的PEGDA水凝胶接种于HUVEC中，培养1天后，发现细胞仅粘附在用PEG-RGDS固定的50和200μm宽的条带上并扩散，而不在裸露的PEGDA区域上().
不同浓度RGDS对HUVEC的粘附
为了优化水凝胶培养系统以促进HUVEC粘附和脐带形成，将不同浓度的PEG-RGDS印在50μm宽的条纹上，并在接种1天后评估HUVEC粘附(). 在以2.0μg/cm为图案的50μm宽条纹上2在PEG-RGDS中，由于细胞未能粘附或扩散到水凝胶上，因此细胞粘附力最小。当PEG-RGDS浓度增加到4.0μg/cm时2，沿着条纹的一些区域被HUVEC覆盖。含20和100μg/cm2在PEG-RGDS中，HUVEC附着并覆盖50μm宽条纹的所有区域。通过计算水凝胶上附着细胞的数量来量化HUVEC粘附的逐渐增加。随着PEG-RGDS浓度从2.0μg/cm增加到100μg/cm2，HUVEC附着力相应增加，如所示.
微图案中PEG-RGDS浓度对HUVEC粘附的影响。(A类)HUVEC附着在PEGDA水凝胶表面，以不同浓度的PEG-RGDS形成50微米宽的条纹。(B类)Coulter计数器对细胞粘附的定量显示，随着PEG-RGDS在PEGDA水凝胶上浓度的增加，粘附细胞的数量增加。数据表示平均值±SD(n个 = 5). *第页 < 0.05，采用单因素方差分析，然后进行Tukey HSD检验。
PEG-RGDS浓度对内皮形态发生的调节作用
为了检测RGDS浓度对EC脐带形成的影响，将HUVECs培养在50μm宽的条纹上，条纹上有不同浓度的PEG-RGDS，范围从2.0到100μg/cm2在2.0或4.0μg/cm的低浓度PEG-RGDS下2如上文所述，培养2天后，仍有少量HUVEC附着在基质上。另一方面，在中等PEG-RGDS浓度为20μg/cm的条带上培养HUVEC2经历了形态发生，沿着条纹的长度浓缩成高度有序的线状结构(). 其中一个区域的垂直横截面显示，中心的HUVEC开始向上垂直突出其细胞核和胞体，并且多个细胞相互叠加(). 这种现象导致在PEGDA水凝胶的2D表面上形成由HUVEC单独组装的3D线状结构。相反，在PEG-RGDS浓度较高的条带上培养的HUVEC未能发生形态发生。在40或100μg/cm的条纹上2在PEG-RGDS中，HUVEC保留了其典型的鹅卵石样形态，其中一个区域的垂直横截面显示，细胞以单层形式分布在基底附近（仅100μg/cm2如所示).
PEGDA水凝胶上EC形态发生的可视化。(A类)共焦图像显示HUVEC在50μm宽的条纹上以20μg/cm的PEG-RGDS形成脐带2培养2天后。HUVEC沿着条纹的中心轴合并成致密的线状结构。(B类)相反，在100μg/cm的PEG-RGDS条带上培养的HUVEC2保持单层。TRITC-类球蛋白和DAPI染色的细胞分别显示为红色和蓝色。比例尺=20μm。
花纹条宽度对内皮细胞形态发生的调节
为了指导PEGDA水凝胶上EC索的形成，改变了PEG-RGDS模式的宽度，并研究了其对索形成的影响(). HUVEC接种在宽度为50至200μm的条纹上。这些条纹用20μg/cm制备2PEG-RGDS，这是支持EC形态发生的浓度，如上所述。细胞接种后，对HUVEC形态进行长达18天的监测。培养18天后，在50μm宽的条带上，HUVEC在平行方向上形成高度组织化的连续线状结构(). 另一方面，大多数培养在75、100或200μm宽条纹上的细胞在培养18天内仍保持良好的扩散性（).
接种在PEG-RGDS微图案的PEGDA水凝胶上的HUVEC形成脐带。EC形态发生受PEGDA水凝胶上RGDS条纹宽度的差异调节。HUVEC在50μm宽的条纹上形成线状结构，条纹上有20μg/cm的图案2PEG-RGDS，但不在200μm宽的条纹上。比例尺=100μm。
HUVEC形态发生过程中ECM蛋白的表达
利用免疫荧光染色研究ECM蛋白在形态发生过程中的表达。培养14天后，发现在50μm宽RGDS条带上脐带形成过程中的HUVEC沿脐带长度产生大量纤维连接蛋白和层粘连蛋白，而I型胶原沉积低于检测水平(). 与Alexa fluor 488结合的抗兔和抗鼠二级抗体孵育的样品背景荧光最小。
EC形态发生过程中ECM蛋白的表达。培养14天后，HUVEC产生(A类)纤维连接蛋白(B类)层粘连蛋白，但检测不到(C类)PEG-RGDS 50μm宽条纹上的I型胶原。二级抗体对照(D类)抗兔IgG和(E类)抗鼠IgG的背景信号很小。比例尺=200μm。
讨论
在本研究中，开发了一种表面图案化技术来调节合成PEGDA水凝胶上EC的形态发生过程。具体而言，采用光刻方法改变PEG-RGDS在PEGDA水凝胶上的密度和几何形状，以调节EC血管生成。在RGDS条带上培养的内皮细胞经历了形态发生，并根据RGDS模式的宽度和密度形成了基本的毛细血管样结构。
生长在宽条纹上的内皮细胞保持着正常的静态状态，而将图案区域的几何形状限制在50μm似乎可以向内皮细胞发送血管生成信号，并刺激细胞体重组为索状结构。RGDS浓度也调节EC形态发生；中等浓度的RGDS（20μg/cm）刺激内皮索形成2)足以维持细胞粘附，而较高浓度的RGDS对其有抑制作用，支持牢固的细胞粘附。内皮细胞形成的索状结构让人想起毛细血管，细胞参与自组装和重组，形成多细胞结构。这项工作表明，通过微模式化创建的定义明确的底物可以提供有用的工具来调节毛细血管形态发生和研究血管生成的进展。
只有少数研究报告了微模式ECM底物对EC形态发生的调控。堤防等。利用微接触技术在金表面上打印出纤维连接蛋白条纹。9在10μm宽的条纹上培养3天的内皮细胞脱离生长期，发生毛细血管形态发生。然而，在30μm宽的细胞系上培养的内皮细胞继续增殖并保持其正常形态。在最近的一项研究中，人类微血管内皮细胞培养在20μm微图样明胶底物上，形成管状结构。12在这些研究中值得注意的是，内皮细胞启动小管生成所需的纤维连接蛋白或明胶条的宽度为10–20μm，而较宽条的内皮细胞形态发生受到抑制。相反，在目前采用RGDS的系统中，我们在宽达50μm的PEG-RGDS条纹上观察到内皮管形成，但在宽条纹上没有观察到。多个细胞结合域以及与ECM蛋白结合的任何生长因子似乎以协同方式增强了ECM几何结构限制产生的血管生成线索，这可能解释了本研究与上述研究相比获得的不同结果。
已有几项研究检测了配体浓度对血管生成的影响。一般认为，血管生成线索是由固定化细胞粘附配体的密度调节的细胞形状变化而产生的。已知EC形态发生在中等纤连蛋白涂层密度（100–500纳克/厘米2)而高度粘合（>500 ng/cm2)和非粘性（<100 ng/cm2)涂层密度分别促进细胞生长和凋亡。7,23进一步研究表明，单个EC的生长或凋亡之间的转换受细胞在微图案表面上扩散的程度调节。24根据这些先前的研究，本研究旨在找到细胞粘附配体RGDS的最佳浓度，在该浓度下，EC的形态发生可以在预先设计的几何结构中得到促进和指导。在中等浓度RGDS和窄RGDS条带上促进EC索形成；这两种条件的确定将允许大规模制备具有图案化内皮血管结构的支架材料。
ECM蛋白在血管生成过程中至关重要。胶原I纤维已被建议提供支架，EC在支架上排列并形成毛细管结构，25并且其在毛细血管中的表达似乎与血管生成一致，因为不表达胶原I的内皮细胞在培养中不能形成绳索或管。26在这方面，值得注意的是，内皮细胞产生纤维连接蛋白和层粘连蛋白，但在微模式上不产生I型胶原。EC形态发生过程中I型胶原表达的差异值得进一步研究，因为纤维连接蛋白和层粘连蛋白而非I型胶原在血管形成早期发挥重要作用是可能的。27
本文研究了PEGDA水凝胶作为促进新生血管形成的支架材料的功效。内皮细胞在PEGDA水凝胶上形成脐带的事实表明，PEGDA水凝胶是一种合适的生物材料，可以协调和再现复杂的新生血管形成过程。由于不存在与ECM蛋白的复杂细胞相互作用以及对支架材料成分的精确控制，PEGDA水凝胶成为血管生物学和药理学研究的通用试验台。此外，水凝胶作为血管形成的适宜环境的鉴定表明，这种材料在组织工程的各种应用中具有巨大的潜力，而组织植入物的普及至关重要。
为了构建可用于临床的支架材料，目前的研究必须扩展到可生物降解的PEG水凝胶，使哺乳动物酶能够降解基质，以方便与宿主组织整合。16,17此外，目前的系统可以通过将多层水凝胶与有图案的血管堆积在一起，来构建可缩放的3D结构。20以预先设计的形状组织细胞并促进其形态发生为血管样结构是构建具有复杂结构的工程组织的重要第一步。
致谢
这项工作得到了NIH和NSF的支持。作者感谢梅丽莎·麦克海尔对手稿的批判性审查。
工具书类
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