美国国家科学院院刊。1998年12月22日；95(26): 15665–15670.
人MCF-7乳腺癌细胞的多药耐药转运体
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L.奥斯汀·道尔
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州大学巴尔的摩医学院病理学系，马里兰州21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
杨卫东
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院病理学系，邮编21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
林恩·V·阿布鲁佐
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州大学巴尔的摩医学院病理学系，马里兰州21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
塔米·克罗格曼
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院血液学/肿瘤学系，邮编21201；‡马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院病理学系，邮编21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
高永明
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州大学巴尔的摩医学院病理学系，马里兰州21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
阿伦·K·里希
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州大学巴尔的摩医学院病理学系，马里兰州21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
道格拉斯·D·罗斯
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州大学巴尔的摩医学院病理学系，马里兰州21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
*马里兰州大学格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩21201；†马里兰州大学巴尔的摩医学院血液学/肿瘤学系医学部，马里兰州21201；‡马里兰州大学巴尔的摩医学院病理学系，马里兰州21201；和§巴尔的摩退伍军人医疗中心，退伍军人事务部，马里兰州巴尔的摩，21201
由马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院David E.Housman传达
收稿日期：1998年3月17日；1998年10月12日接受。
摘要
MCF-7/AdrVp是一种多药耐药人类乳腺癌亚系，在缺乏已知多药耐药转运体（如P糖蛋白或多药耐药蛋白）过度表达的情况下，蒽环类抗癌药物的细胞内积累表现出ATP依赖性减少。RNA指纹鉴定出一个2.4kb mRNA，该mRNA在MCF-7/AdrVp细胞中相对于亲代MCF-7细胞过度表达。mRNA编码ATP-结合盒转运蛋白超家族的663-aa成员，我们称之为乳腺癌抵抗蛋白（BCRP）。在MCF-7乳腺癌细胞中强制表达全长BCRP cDNA，可以抵抗米托蒽醌、阿霉素和柔红霉素，减少柔红霉素的积累和滞留，并导致克隆转染细胞中罗丹明123的流出依赖于ATP的增强。BCRP是一种外源性转运蛋白，似乎在MCF-7/AdrVp人乳腺癌细胞的多药耐药性表型中发挥主要作用。
关键词：米托蒽醌、蒽环类、转运蛋白
在晚期乳腺癌的治疗过程中，多种化疗药物的耐药性经常发生。两种跨膜外源性转运蛋白，P糖蛋白（Pgp）和多药耐药蛋白（MRP），在转染到培养的药物敏感细胞时会引起多药耐药(1–5). 尽管有这些发现，但这些转运蛋白在人类乳腺癌临床耐药中的作用尚不清楚；因此，人们寻求了在这种疾病中起作用的替代或附加耐药机制。为了解决这个问题，陈等。(6)在Pgp抑制剂维拉帕米的存在下，筛选出对蒽环类阿霉素耐药的人乳腺癌MCF-7细胞。由此产生的多药耐药亚系MCF-7/AdrVp对某些其他蒽环类药物[柔红霉素和3′-脱氨基-3′-（3-氰基-4-吗啉基）阿霉素]和蒽二酮-米托蒽醌表现出明显的交叉耐药性，但对长春碱、紫杉醇仍然敏感(6,7)、和顺式-铂。尽管与MCF-7细胞相比，蒽环类柔红霉素和荧光染料罗丹明123的细胞内积累显著减少，但MCF-7/AdrVp细胞并不过度表达Pgp或MRP(6,7). MCF-7/AdrVp细胞未显示药物亚细胞分布的改变(7)在某些过度表达MRP的细胞中可见。虽然经典的Pgp拮抗剂环孢霉素A不能逆转柔红霉素积累的减少，但ATP的耗竭会完全消除柔红霉素和罗丹明增强的外排作用(7). 这些发现导致了一种假设，即依赖ATP的外源性转运体可能对MCF-7/AdrVp细胞的多药耐药表型有显著贡献。为了验证这一假设，我们使用RNA指纹技术寻找了在MCF-7/AdrVp细胞中与MCF-7细胞相比差异性过度表达的mRNA物种。
材料和方法
细胞系。
MCF-7人乳腺癌细胞、其耐药亚系MCF-7/AdrVp和在不含阿霉素的情况下培养的部分回复子系（MCF-7/AdrVpPR）均来自Antonio Fojo（美国国家癌症研究所医学分所）。细胞按规定保存在培养基中(8). MCF-7/AdrVp亚系在1μg/ml阿霉素（Pharmacia&Upjohn）和2.5μg/ml维拉帕米（Sigma）的存在下持续维持。
RNA指纹。
使用Delta RNA指纹试剂盒（CLONTECH）中的协议进行RNA指纹分析，该试剂盒是对差异显示技术的改进(9,10). P6任意引物的序列为5′-ATTAACCCTCACTAAAATGCTGGGTG-3′；T9寡核苷酸（dT）引物的序列为5′-CATTATGCTAGTGATCTTTTTGG-3′。从差异显示凝胶中提取代表差异表达cDNA的PCR产物，在40μl蒸馏去离子H中煮沸洗脱2O作用5分钟，使用原始引物通过PCR扩增20个周期，并在2%琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分离，以确认扩增产物的大小。根据制造商的方案，将再扩增的PCR产物连接到TA克隆载体pCR2.1（Invitrogen）的多克隆位点；结扎后，将载体转染到TOP10F菌株大肠杆菌提取单个菌落，分离质粒DNA（Wizard miniprep；Promega）。为了确认通过TA克隆分离的克隆PCR产物在耐药细胞的RNA指纹反应混合物中过度表达，进行了“反向”Northern分析。从12个不同的转染菌落中分离出质粒DNA大肠杆菌在插槽印迹仪中，将Zeta Probe-GT（加州里士满Bio-Rad）膜固定两次。用33使用RNA指纹试剂盒中的原始“P”和“T”引物扩增MCF-7 cDNA的P标记PCR混合物。另一层膜用原始膜探测33P标记的平行PCR反应混合物，使用标准的Northern杂交条件扩增MCF-7/AdrVp细胞产生的cDNA，然后通过放射自显影术评估探针的结合。
cDNA文库的构建。
根据制造商的方案，使用CapFinder PCR cDNA文库构建试剂盒（CLONTECH）从MCF-7/AdrVp RNA构建cDNA文库。CapFinder技术是专门为生产全长双链cDNA而设计的。使用制造商推荐的方案，用感兴趣的RNA指纹PCR产物筛选文库。分离阳性克隆并进行二级和三级筛选，并使用从MCF-7、MCF-7/AdrVp和MCF-7/AdrVpPR细胞获得的RNA通过Northern杂交进行额外测试。多个克隆有2.4kb的插入物，与Northern印迹显示的BCRP mRNA大小大致相同。将四个2.4-kb插入物连接到pCR2.1质粒中（见上文）；使用自动DNA测序仪（Perkin–Elmer）对2.4kb cDNA插入物进行测序。所有DNA序列均通过反向测序得到确认。
数据分析。
cDNA和推导出的蛋白质序列的分析是使用蛋白质和核苷酸序列数据库完成的，这些数据库是通过威斯康星序列分析软件包第8版（威斯康星遗传学计算机组，威斯康星州麦迪逊）访问的，可通过弗雷德里克癌症研究中心的超级计算设施（弗雷德里克，马里兰州）获得。统计分析使用回归分析统计软件(回归分析释放8延长；Minitab，宾夕法尼亚州州立学院）。
逆转录-PCR（RT-PCR）。
程序寡聚物（5.0版；美国明尼苏达州普利茅斯国家生物科学院）用于帮助确定合适的引物，用于检测果蝇属白色基因(w个)通过RT-PCR。上引物起始于人类2136的5′位w个mRNA，序列为5′-CGACCAGACAA-3′；下部引物起始于3′2590位，序列为5′-CTTAAAAATGAATGCGATTGAT-3′。预期PCR产物长度为475 bp。使用随机六聚体启动逆转录反应，然后进行25个PCR循环。还进行了β-肌动蛋白的RT-PCR分析；已经报道了这种测定的反应条件(11).
BCRP在MCF-7细胞中的转染和增强表达。
将全长乳腺癌耐药蛋白（BCRP）cDNA插入表达载体pcDNA3（Invitrogen）的多克隆位点。在将pcDNA3–BCRP构建子克隆化后，进行DNA序列分析，以确认所选克隆的插入物与pcDNA A3载体的巨细胞病毒（CMV）启动子有方向性。用磷酸钙沉淀法将pcDNA3–BCRP转染MCF-7细胞(12)通过使用基因素（G418，1 mg/ml）培养选择，并通过限制96周平底培养板（Sarstedt，Newton，NC）中的稀释进行亚克隆。使用Northern blot分析检测亚克隆BCRP mRNA的表达。作为对照，MCF-7细胞也转染空的pcDNA3载体，并在含有1 mg/ml G418的培养基中生长。
细胞内药物的药代动力学和ATP消耗的影响。
如前所述，采用流式细胞术测定柔红霉素在MCF-7细胞内的细胞内积累和保留(8). 25cm培养细胞2将烧瓶（Corning Costar）暴露于1μg/ml柔红霉素达180分钟（积累期）或暴露于柔红霉素达180分钟，用冰冷的盐水溶液洗涤无药物，并在无药物的情况下重悬于预热的培养基中（保留期）。在图中所示的时间间隔内，将等分细胞从平板上用胰蛋白酶消化，并测量细胞内柔红霉素的含量(8). 将细胞与柔红霉素在冰上孵育一段适当的时间，以控制蒽环素与质膜的结合，然后使用流式细胞术测定细胞柔红霉素的含量。从37°C下与药物孵育的细胞内药物含量的值中减去膜结合值。细胞内药物含量以每个细胞的荧光单位（FU）表示。荧光单位是介于1和10000之间的任意数字。如前所述，使用Coulter Channelyzer测量细胞体积(8).
MCF-7细胞通过在含有50 mM 2-脱氧葡萄糖的无葡萄糖DMEM中培养而耗尽ATP-d日-葡萄糖和15 mM叠氮化钠作用20分钟（37°C）。添加罗丹明123（最终浓度为0.5μg/ml）额外30 min。将细胞置于冰上，洗去罗丹明，并在ATP消耗条件下再培养30 min，通过流式细胞仪测定罗丹明保留量（激发488 nm，发射520 nm）。
结果
为了验证引言中概述的假设，我们使用了RNA指纹技术，这是一种改进的差异显示方法，使用PCR和简并前体对来扩增细胞mRNA。对于PCR反应，cDNA是从MCF-7、MCF-7/AdrVp和MCF-7/AdrVpPR细胞中制备的，后者在没有选择药物的情况下通过培养部分恢复了药物敏感性。当使用引物P6和T9进行RNA指纹分析时，与使用来自MCF-7或MCF-7/AdrVpPR细胞的cDNA作为模板的反应相比，发现PCR产物的重复性过剩（图。A类). 将MCF-7/AdrVp细胞中过度表达的PCR产物从干凝胶中切下，纯化并连接到TA克隆载体中。通过反向Northern印迹法筛选TA载体克隆导致分离出一个克隆，其PCR产物插入通过标准Northern分析鉴定出2.4kb mRNA物种，与MCF-7相比，该物种在MCF-7/AdrVp细胞中显著过度表达（图。B类,顶部). 部分回复的MCF-7/AdrVpPR亚系具有2.4-kb mRNA物种的中间表达（图。B类).
(A类)MCF-7细胞的RNA指纹图谱。用DNA酶处理细胞总RNA，反转录成cDNA，并用上游和下游引物和放射标记PCR扩增[33P] dATP。该图描述了使用引物对P6和T9对PCR混合物进行5%聚丙烯酰胺凝胶电泳的部分自动射线照相。通道1、3和5是反应混合物，其中添加了稀释为1:10的cDNA；通道2、4和6表示反应混合物，其中添加了稀释为1:40的cDNA。第7和第8车道为H2O对照组，将无菌水添加到PCR混合物中以代替cDNA。通道9、10和11是RNA对照，其中添加了0.02μg来自MCF-7/W、MCF-7/AdrVp或MCF-7/AdvVpPR细胞的细胞RNA，而不是cDNA。这些RNA控制用于指示RNA与基因组DNA的污染。箭头指示代表与MCF-7/W或MCF-7/AdrVpPR细胞相比在MCF-7/AdrVp细胞中过表达的mRNA种类的PCR产物。将该产物从凝胶中切下，通过PCR进一步扩增。(B类)Northern杂交(上部)通过使用RNA指纹研究获得的795-bp PCR产物，并在标记后通过TA克隆作为探针，从MCF-7/W、MCF-7/AdrVp或MCF-7/AdrVpPR细胞中提取mRNA[32P] dCTP（Prime-a-Gene标签试剂盒，Promega）。为了控制样品装载的等效性，去除印迹并用18S RNA的放射性标记探针重新杂交(下部).
对TA克隆中差异表达的PCR产物进行测序，发现其为795-bp的cDNA。对推导氨基酸序列的蛋白质数据库搜索显示，与转运蛋白的ATP-结合盒（ABC）家族成员具有高度同源性。用放射标记的795-bp cDNA片段作为探针筛选MCF-7/AdrVp细胞制备的cDNA文库。鉴定并分离出一个含有2.4kb cDNA片段的λ噬菌体克隆。cDNA插入物已完全测序，长度为2418 bp。使用该程序分析ORF的cDNA框架包含在GCG软件包中的表明存在一个长ORF，该ORF始于239位，终止于2204–2206位的终止密码子TAA。该ORF的推导氨基酸序列如图所示。A类该序列编码的蛋白质被命名为乳腺癌抵抗蛋白（BCRP）。用GCG软件比较BCRP氨基酸序列法斯塔显示了与至少50个ABC转运蛋白的高度同源性。最匹配的是PIR2：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“G02068”，“term_id”：“632471”，“term_text”：“G02068”}}G02068号，与人类同源的果蝇属白色(w个)该基因含有638个氨基酸，与BCRP的同源性为29.3%。这个w个中的基因果蝇属鸟嘌呤和色氨酸（视网膜色素前体）在细胞运输中的作用(13–16). 人类同源物w个(17)与RT-PCR检测到的MCF-7细胞相比，MCF-7/AdrVp细胞中未过度表达（数据未显示）。
(A类)通过显示基序推导BCRP的氨基酸序列。应用该程序从全长BCRP cDNA的核苷酸序列中获得推导序列翻译，它是GCG软件包的一部分。TM 1、TM 2和TM 3是指潜在的跨膜区域；Glyc是指N-糖基化的潜在位点。(B类)BCRP氨基酸序列相对于运输蛋白ABC家族某些其他成员的进化谱系图。谱系图是使用多序列比对程序创建的堆积，它是GCG软件包的一部分，使用间隙权重3.0和间隙长度权重0.1。GCG计划距离然后应用Kimura蛋白质距离校正方法，在对齐序列之间创建成对进化距离。然后用GCG程序从距离矩阵创建一个图形系统发育树生长树.
用GCG程序分析BCRP肽序列图案显示了单个Walker“a”ATP/GTP结合区域(18)在氨基酸88–95处和氨基酸221–236处的磷酸泛烷连接位点（图。A类). 作为一些多酶复合物中酰基载体蛋白的辅基，磷酸泛乙烯起到连接活性脂肪酸和氨基酸基团的作用(19).
用GCG程序检查BCRP结构胃蛋白酶图和情节结构揭示了一个相对亲水的氨基末端结构域（氨基酸1-400），其包含ATP结合序列和一个相对疏水的羧基末端结构域（氨基酸401–663），其包含至少三个假定的跨膜结构域和四个潜在的N-糖基化位点（图。A类). 跨膜结构域是用预测整合膜蛋白中螺旋的程序估计的(20). 用GCG程序分析BCRP序列圆点图证明该肽与复制的Pgp或MRP分子的一半同源，但Pgp和MRP的构型为NH2-[跨膜域]-[ATP结合1]-[跨膜区]-[ATP-结合2]-COOH，而BCRP是NH2-[ATP结合]-[跨膜结构域]-COOH。使用GCG程序确定了BCRP与ABC转运蛋白超家族其他成员的系统发育关系堆积,距离、和生长树该分析表明，BCRP仅与Pgp或MRP有较远的关系（图。B类).
BCRP cDNA被用作Northern blots中的探针，以检测所选正常人体组织中BCRP mRNA的表达（图。). 胎盘组织中的表达最高，而大脑、前列腺、小肠、睾丸、卵巢、结肠和肝脏中的表达水平相对较低。心脏、肺、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺和外周血白细胞中的BCRP转录物低于检测水平。
BCRP mRNA的组织分布。该分析使用商业化制备的人类多组织Northern印迹（MTN Blot和MTN BlotII，CLONTECH）和制造商推荐的程序进行。RNA指纹图谱获得的795-bp PCR产物经标记后用作探针[32P] 数字CTP。受试组织包括：心脏（1区）、大脑（2区）、胎盘（3区）、肺（4区）、肝脏（5区）、骨骼肌（6区）、肾脏（7区）、胰腺（8区）、脾脏（9区）、胸腺（10区）、前列腺（11区）、睾丸（12区）、卵巢（13区）、小肠（14区）、结肠（15区）和外周血白细胞（16区）。
评估BCRP功能在体外，将全长cDNA插入表达载体pcDNA3的多克隆位点。将含有全长BCRP cDNA（pcDNA3–BCRP）的载体或空载体转染MCF-7细胞作为对照。用基因素（G418）筛选后，用限制稀释法克隆pcDNA3–BCRP转染细胞；使用Northern杂交检测多个克隆的BCRP表达（图。A类). 选择两个BCRP过表达克隆（克隆6和8）和一个没有过表达BCRP的克隆（克隆19），与仅转染空载体的细胞和亲代MCF-7细胞进行BCRP功能研究。克隆6中BCRP mRNA的表达低于克隆8（图。A类).
(A类)Northern分析BCRP mRNA在含有G418的培养基中选择后，在稳定转染表达载体pcDNA3-BCRP的MCF-7/W细胞亚克隆或转染空载体pcDNA4（未连接载体控制）的MCF-7/W细胞亚克隆中的表达。通过在96个平底培养瓶中限制稀释，将转染细胞电镀，分离出亚克隆。最初从差异显示研究中获得的795 bp PCR产物被放射性标记并用作探针。用于Northern印迹的总细胞RNA的1%琼脂糖凝胶电泳的溴化乙锭染色显示样品装载的近似等效性（结果未显示）。(B类)用空pcDNA3载体（载体对照）转染的MCF-7细胞或转染pcDNA3-BCRP后从MCF-7/W细胞分离的克隆6或克隆8转染的细胞中柔红霉素（DNR）的积累和保留。数据点是重复测定的平均值；垂直条表示该数据点的上限或下限。Coulter Channelyzer测量的细胞体积为2515±56、3074±112和2459±56μm三分别用于MCF-7/BCRP克隆6、MCF-7/BCRP克隆8和MCF-7/pcDNA3载体控制细胞。这些值与我们之前测量的MCF-7细胞体积相当(8). (C类)ATP耗竭对转染MCF-7/pcDNA3（空载体对照）或MCF-7/BCRP克隆8细胞保留罗丹明123的影响。细胞在完全培养基中或在ATP消耗条件下孵育（参见材料和方法)持续20分钟，再添加罗丹明123（最终浓度0.5μg/ml）30分钟。将细胞洗去罗丹明，然后在完全培养基中或在耗尽ATP的条件下再次培养30分钟。罗丹明保留，表示为每个细胞的任意荧光单位（FU），用流式细胞仪测定（激发488nm，发射520nm）。每个柱上的垂直线表示四次重复测定的标准偏差。研究完成时，每个治疗组的细胞存活率（台盼蓝染料除外）>90%。(D类)典型的磺胺基B细胞毒性(21)米托蒽醌、柔红霉素、阿霉素、，顺式-铂、紫杉醇或长春新碱对抗MCF-7/W（*）或MCF-7/pcDNA3-BCRP克隆8（■）细胞。这些数据是用于获得LC的典型数据50构成表中所示数据的值.每个数据点的垂直条代表六次重复测定的±SD。
用流式细胞术检测转染细胞中柔红霉素的积累和保留。与转染载体的对照组相比，BCRP过表达克隆6和8可重复显示柔红霉素的积累和保留减少（图。第4页). 克隆8和克隆6中柔红霉素的细胞内稳态浓度分别约为载体控制细胞的30%或50%。这不是细胞体积差异的结果，因为所测试的BCRP过表达亚系的体积不低于空载体转染的对照细胞。在以前的研究中(8)，柔红霉素在MCF-7/AdrVp细胞中的细胞内稳态积累约为MCF-7/W细胞的25%，这与我们在当前研究中观察到的转染克隆8中柔红霉素的积累相当。
BCRP的运输功能似乎取决于ATP（图。C类). 罗丹明123在BCRP过表达克隆-8细胞中的胞内滞留减少至载体对照细胞的45%。ATP的消耗增加了克隆8细胞中罗丹明的保留，使其水平与在完全培养基中培养的载体控制细胞相当，但对载体控制细胞中的罗丹明保留没有影响（图。C类).
通过硫罗丹明B细胞毒性试验检测不同转染亚系对化疗药物的敏感性(21). 与非BCRP过度表达的克隆19细胞、MCF-7细胞或空载体转染对照组相比，BCRP过表达克隆6和8对米托蒽醌、柔红霉素和阿霉素表现出耐药性（表; 图。D类). 与MCF-7/AdrVp细胞一样，MCF-7/BCRP转染克隆6和8对米托蒽醌表现出最大程度的耐药性。BCRP过表达转染细胞显示的交叉耐药模式与MCF-7/AdrVp细胞显示的模式非常相似；然而，MCF-7/AdrVp细胞对表型内的所有细胞毒药物具有更大的相对耐药性。BCRP过表达克隆6和8对顺式-铂、紫杉醇和长春新碱以及MCF-7/AdrVp细胞（表). BCRP转染克隆19未过度表达BCRP，符合最低统计标准(P（P）=0.0497）对于低阻力的显著性顺式-与MCF-7/W相比，但与用空载体转染的细胞（MCF-7/pcDNA3；见表). 除此之外，克隆19对受试药物的敏感性与MCF-7/W或MCF-7/pcDNA3无统计学差异。
表1
| 药物 | 单元格类型
|
|---|
MCF-7/W型
| MCF-7/pcDNA3
| MCF-7/BCRP克隆19
| MCF-7/BCRP克隆6
| MCF-7/BCRP克隆8
| MCF-7/AdrVp
|
|---|
| LC中值50，nM[范围，nM] | N个 | 射频 | LC中值50，nM[范围，nM] | N个 | 射频 | LC中值50，nM[范围，nM] | N个 | 射频 | LC中值50，nM[范围，nM] | N个 | 射频 | LC中值50，nM[范围，nM] | N个 | 射频 | LC中值50，nM[范围，nM] | N个 | 射频 |
|---|
| 米托蒽醌 | 41 | 7 | 1 | 40 | 6 | 1 | 54 | 1 | 1.3 | 370*† | 4 | 9 | 1,300*† | 5 | 32 | 160,000 | 2 | 3,902 |
| [20–105] | | | [15–115] | | | [—] | | | [130–700] | | | [280–3,600] | | | [120,000–200,000] |
| 柔红霉素 | 42 | 7 | 1 | 68 | 5 | 1.6 | 54 | 1 | 1.6 | 180*† | 4 | 4.3 | 350*† | 5 | 8.3 | 1,700 | 三 | 41 |
| [8–105] | | | [21-110] | | | [—] | | | [150–380] | | | [110–600] | | | [1,500–1,800] |
| 阿霉素 | 56 | 5 | 1 | 49 | 4 | 0.9 | 70 | 4 | 1.3 | 168* | 4 | 3 | 1,050*† | 4 | 19 | 8,650 | 2 | 155 |
| [14–110] | | | [16–150] | | | [25–102] | | | [81–600] | | | [205–5300] | | | [6,800–10,500] |
| 顺铂 | 2,600 | 4 | 1 | 3,900 | 三 | 1.5 | 6,900 | 三 | 2.7 | 7,000 | 三 | 27 | 3,700 | 三 | 1.5 | 2,875 | 2 | 1.1 |
| [1,600–4,000] | | | [3,000–4,050] | | | [4,700–6,900] | | | [3,080–13,000] | | | [3,500–13,000] | | | [1,050–4,700] |
| 紫杉醇 | 1.9 | 4 | 1 | 5.1 | 2 | 2.7 | 0.9 | 三 | 0.5 | 1.9 | 三 | 1 | 3 | 三 | 1.6 | 1.9 | 4 | 1 |
| [0.9–33] | | | [3–7.1] | | | [0.8–28] | | | [1.4–21] | | | [1.8–36] | | | [1.3–3.6] |
| 长春新碱 | 0.26 | 三 | 1 | 0.39 | 2 | 1.5 | 0.63 | 三 | 2.4 | 0.37 | 三 | 1.4 | 0.28 | 三 | 1.1 | 0.9 | 三 | 3.5 |
| [0.08–0.65] | | | [0.28–0.51] | | | [0.09–0.76] | | | [0.35–0.91] | | | [0.25–0.59] | | | [0.19–1.3] |
讨论
这里的数据有力地支持了这样的结论，即新的ABC转运蛋白家族成员BCRP是一种依赖ATP的外源性转运蛋白，在MCF-7/AdrVp细胞的耐药表型中起主要作用。BCRP mRNA在MCF-7/AdrVp细胞中的过度表达（在MCF-7/AdrVpPR中减少）表明BCRP在细胞毒性药物抵抗中起着重要作用。此外，BCRP在MCF-7细胞中的强制过表达减少了柔红霉素细胞的积累，并使转染细胞产生了与MCF-7/AdrVp细胞几乎相同的药物交叉耐药模式。转染克隆6和8中BCRP过度表达的程度与柔红霉素细胞内稳态水平的改变及其对米托蒽醌、柔红霉素和阿霉素的耐药程度相关。
BCRP过表达转染克隆与原始MCF-7/AdrVp亚系的主要区别在于后者的耐药程度大于转染细胞；然而，转染子中的稳态BCRP mRNA水平与MCF-7/AdrVp细胞的水平相当（图。A类). 许多可能性可能会导致这种差异。蛋白质稳定性、定位或两者的改变可能有助于形成完整的耐药表型，或者可能需要其他蛋白质的表达。最近，我们报道了癌胚抗原（CEA）家族成员，主要是非特异性交叉反应抗原和CEA本身，与药物敏感的MCF-7细胞相比，在MCF-7/AdrVp和MCF-7/AdrVpPR细胞表面显著过度表达(22). 细胞表面高密度的酸性糖蛋白可能使药物如米托蒽醌、柔红霉素或阿霉素等质子化，从而阻止其进入细胞。的确，川原等。(23)据报道，CEA在转染NIH 3T3细胞中的强制表达导致转染细胞中阿霉素的积累和耐药性降低。因此，CEA家族成员在MCF-7/AdrVp细胞表面的相对过表达可能与BCRP协同作用，导致对米托蒽醌、阿霉素和柔红霉素的耐药性高于单独BCRP。通过将MCF-7/BCRP克隆8亚系与含有非特异性交叉反应抗原或CEA的表达载体共转染，可以验证这一假设。
与转染剂相比，MCF-7/AdrVp细胞的耐药性更高，另一种可能的解释是，BCRP可能参与多蛋白转运复合物。典型ABC转运体的转位途径由两个ATP结合域和两个含有跨膜区的高度疏水域组成。这种配置可以在单个大分子中完成（例如，MRP或Pgp）。或者，某些ABC转运体的活性复合物可以由两个不相同的蛋白质异源二聚体形成，每个蛋白质都包含一个ATP结合和疏水区域。这个w个和棕色(b条)蛋白质果蝇属运输主要组织相容性I类肽的Tap-1和Tap-2蛋白是表现出这种合作相互作用的ABC-运输蛋白家族成员的例子。在BCRP上存在磷酸泛酸附着位点表明BCRP可能是多蛋白复合物的一部分。BCRP可能有一个或多个蛋白辅因子，在异体状态下作为一种更有效的转运蛋白发挥作用。与MCF-7细胞相关的MCF-7/AdrVp中该辅因子的激活或过度表达可以解释MCF-7/AdvVp亚系相对于BCRP转染体的更大耐药性。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所医学分所的Susan Bates博士和Antonio Fojo博士赠送MCF-7/AdrVp亚系。我们还感谢弗雷德里克癌症研究中心、国家癌症研究所、国家卫生研究院超级计算设施的加里·斯迈瑟斯博士在GCG软件和BCRP潜在跨膜域识别方面的帮助。我们感谢徐德琪博士帮助我们从MCF-7/AdrVp细胞中制备cDNA文库。我们感谢Raji Sridhara博士和Julie Eiseman博士在数据统计分析方面的帮助。这项工作得到了国家癌症研究所、国家卫生研究院、卫生与公共服务部向D.D.R.提供的公共卫生服务拨款CA52178以及向D.D.R提供的退伍军人事务绩效审查拨款的部分支持。
缩写
| 逆转录聚合酶链反应 | 逆转录-PCR |
| Pgp公司 | P-糖蛋白 |
| MRP公司 | 多药耐药蛋白 |
| 基础知识 | ATP装订盒 |
| BCRP公司 | 乳腺癌抵抗蛋白 |
| w个 | 果蝇属白色基因 |
脚注
数据存储：本文中报告的序列已存储在GenBank数据库中（登录号AF09895）。
参考文献
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