临床投资杂志。2010年2月1日;120(2): 433–445.
脑缺血小血管病小鼠遗传模型中脑血管功能障碍和微循环稀疏先于白质损伤
,1,2,三 ,1,2 ,4 ,1,2 ,4 ,4 ,1,2 ,1,2 ,5,6 ,1,2和4
安妮·朱特尔
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
玛丽·莫内特·利佩雷
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,LARIBOISERE-FERNAND-WIDAL住院组,法国巴黎Génétique实验室北部大学住院组。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
克劳迪娅·戈塞勒
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
塞琳·门古伊男爵
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯,法国尼斯。
安妮特·哈姆斯
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4马克斯·德尔布鲁克分子医学中心,德国柏林。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
萨宾·施密特
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
芭芭拉·莱迈尔·卡雷特
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4马克斯·德尔布鲁克分子医学中心,德国柏林。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
瓦莱里·多明加
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
安德烈亚斯·舍德尔
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
皮埃尔·拉科姆
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎,Site Villemin,医学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
诺伯特·哈布纳
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,法国巴黎盖尼蒂克实验室Groupe hospitalier LARIBOISIER-FERNAND-WIDAL,Groupement hospitalie-universitaire Nord。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
1INSERM U740,法国巴黎。2巴黎大学7-Denis Diderot,法国巴黎维尔曼校区梅德西学院。三AP-HP,LARIBOISERE-FERNAND-WIDAL住院组,法国巴黎Génétique实验室北部大学住院组。4德国柏林Max-Delbruck分子医学中心(MDC)。5INSERM U636,法国尼斯。6法国尼斯大学/索菲亚·安蒂波利斯分校。
通信地址:Anne Joutel,Facultéde Médecine Paris7,site Villemin,10 av de Verdun,75010 Paris,France。电话:331-5727-8593;传真:331-5727-8594;电子邮件:rf.toredid-sirap-vinu@letuoj.enna或发送至:Norbert Hubner,MDC,Robert-Rossle-Str.10,13125 Berlin,Germany。电话:4930-9406-3512;传真:4930-9406-3147;电子邮件:ed.nilleb-cdm@renbeuhn公司。 作者注释:玛丽·莫内特·利佩雷(Marie Monet-Leprítre)和克劳迪娅·戈塞莱(Claudia Gosele)对这项工作做出了同样的贡献。
2009年5月4日收到;2009年11月18日接受。
引言
缺血性脑小血管病(SVD)是血管性痴呆的主要病因,也是人类中风的主要病因。大多数缺血性脑SVD涉及较小穿透动脉的弥漫性动脉病,导致多发性皮质下腔隙性梗死和影像学上称为白质疏松症的更弥漫性白质病变(1). 然而,尽管SVD很重要,但没有特殊的治疗方法。这主要是由于对疾病发病机制了解不足,尽管高血压已被确定为主要危险因素,并且缺乏合适的动物模型(2).
Dominant mutations in the槽口3基因导致伴有皮质下梗死和白质脑病(CADASIL)的常染色体显性脑动脉病,这是非高血压缺血性脑SVD的遗传原型,也是成人中风和血管性痴呆最常见的遗传原因(三–5). 临床特征与非遗传性SVD相似,只是发病年龄较早,先兆偏头痛的发病率增加。总的来说,缺血性事件发生在60%-85%的患者中,发生在40~60岁之间,认知障碍导致50-60岁之间的皮质下痴呆,患者在65-70岁左右卧床不起并死亡(6,7). 白质疏松症是缺血性和认知症状出现前10至15年内最早、持续的MRI改变(8). 对CADASIL患者的尸检研究表明,该动脉病主要影响大脑小穿透动脉和软脑膜动脉,其特征是动脉壁增厚和纤维化,平滑肌细胞显著改变,最终消失。与SVD的其他病因不同,血管显示出未知成分的颗粒嗜锇物质(GOM)的病理沉积(9–11).
Notch3编码一个跨膜受体,其出生后的表达主要局限于血管平滑肌细胞和周细胞(12). Notch3最初合成为约280-kDa的前体,然后进行与其他Notch受体类似的蛋白水解过程。这导致形成由210-kDa胞外结构域(Notch3)组成的成熟异二聚体受体电子海图)非共价连接到97-kDa跨膜/细胞内片段(Notch3TMIC公司). CADASIL患者携带高度定型的突变,从而改变Notch3细胞外结构域中半胱氨酸残基的数量(13–15). 这些突变与NOTCH3的血管积聚有关电子海图无相关NOTCH3TMIC公司在靠近GOM沉积物或GOM沉积物内的平滑肌细胞和周细胞的质膜上积聚(12,16,17). 连接分子途径槽口3血管细胞变性的突变目前尚不完全清楚。然而,值得注意的是,小鼠中Notch3的完全丢失虽然会导致小动脉的结构和功能改变,但不会导致CADASIL病理学改变(18,19). 然而,体外试验以及人类和小鼠的遗传研究支持一种模型,该模型激发突变NOTCH3蛋白的新致病作用,而不是削弱NOTCH4作为CADASIL病主要决定因素的功能(20–23).
我们和其他人试图在小鼠中建立CADASIL模型,但收效甚微。Lundkvist及其同事建立了p.Arg141>Cys突变的小鼠敲除模型,但这些小鼠既没有出现血管改变,也没有出现CADASIL特有的脑损伤(24). 我们使用平滑肌细胞特异性SM22α启动子元件,生产了在平滑肌细胞中表达人类NOTCH3 cDNA的转基因小鼠,其p.Arg90>Cys或p.Cys428>Ser突变水平约为这些细胞中正常NOTCH3水平的1至2倍。随着年龄的增长,这些小鼠产生了Notch3的微观聚集体电子海图GOM沉积在动脉中,但它们仍然没有发生脑损伤(23,25).
晚发性神经退行性疾病的常见挑战是,小鼠的短寿命通常是有限的,因为长期暴露于突变蛋白被认为是触发细胞功能障碍或变性所必需的。传统的转基因常常受到低水平转基因表达和广泛位置效应的阻碍,因为对于转基因的高水平、组织特异性和整合位点独立表达至关重要的元素,例如增强子、位点控制区和绝缘体,可能离基因本身很远(26). 在这里,我们使用了基于P1衍生人工染色体(基于PAC)的转基因方法,以内源性样表达模式过度表达Notch3。我们的报告显示,携带CADASIL-causing Notch3突变的大基因组片段转基因小鼠出现了该疾病的大多数主要病理特征,包括血管和脑实质损伤。对这些小鼠的分析使我们能够探索CADASIL发病机制的重要方面,例如突变蛋白对脑血管系统的结构和功能后果。我们的研究结果为脑血管功能障碍和微循环衰竭提供了证据,这是缺血性脑SVD新的遗传模型中疾病发生的关键因素。
结果
野生型和CADASIL-linked Notch3-PAC转基因小鼠的产生。
为了生成PAC转基因小鼠,大鼠PAC文库(27)之所以被选中是因为老鼠和老鼠之间的巨大身份槽口3基因(93%),与鼠与人的身份比较槽口384%和外源性之间的良好分化槽口3(大鼠)和内源性缺口3(鼠标)。我们使用172-kb PAC克隆RPCI31.78K09,其中包含大鼠基因组槽口3基因座加上约60kb的5′侧翼序列和45kb的3′侧翼顺序(图A) ●●●●。我们采用了先前描述的策略(28)在中使用同源重组大肠杆菌将CADASIL氨基酸替代p.Arg169>Cys引入该PAC(图B) 。随后,我们将野生型和经修饰的完整大基因组DNA片段导入小鼠生殖系,建立了3个表达野生型Notch3(TgNotch3)的杂合转基因小鼠系重量,第129行)或CADASIL-causing Notch3突变体(TgNotch3169C兰特,第88和92行)。PCR和Southern印迹的结果支持完整全长突变体和野生型Notch3 PAC在所有3个已建立的品系(品系88、92和129)的单个插入位点整合(图、C和D以及未显示的数据)。
表达野生型或CADASIL连接的R169C大鼠Notch3。(A类)大鼠PAC克隆及载体图谱(27,52). (B类)根据参考文献,有针对性的PAC修改策略。28此面板改编自参考。28经允许自然生物技术插入穿梭载体中的修饰盒包含侧翼大鼠槽口3外显子4中工程化CADASIL突变两侧的外显子3和6的基因组序列。图中显示了两个PAC修改步骤:穿梭载体与PAC(第一和第二)的共整合,以及通过第二个同源重组事件解析共整合子,以消除穿梭载体和其他外源序列,使修改后的PAC携带点突变。(C类)野生型和修饰型PAC在转基因小鼠中的全长整合。所示为与大鼠对应的PCR产物槽口3PAC克隆的外显子1(顶部)、SP6位点(中部)和T7位点(底部)。(D类)大鼠PCR产物的序列分析槽口3TgNotch3中的转基因重量(TgN3重量)和TgNotch3169C兰特(TgN3169C兰特)老鼠。(E类)非转基因TgNotch3脑组织的RT-PCR检测重量和TgNotch3169C兰特(第88和92行)小鼠。PCR产物用RsaI裂解并在琼脂糖凝胶上分离,从内源性小鼠中获得未分离的206-bp片段槽口3大鼠mRNA和108和98-bp裂解片段槽口3mRNA。(F类)非转基因TgNotch3脑组织的Northern印迹分析重量和TgNotch3169C兰特老鼠。(G公司)1个月龄TgNotch3脑裂解物的代表性免疫印迹169C兰特(第88和92行),TgNotch3重量和用5E1抗Notch3探针探测的非转基因小鼠电子海图识别内源性小鼠和外源性大鼠Notch3蛋白的抗体,以及抗SMMHC抗体。白线表示车道在同一凝胶上行驶,但不相邻。
RT-PCR扩增来自槽口3mRNA随后被RsaI切割,这使得小鼠和大鼠能够区分槽口3,证明了缺口3mRNA转录自内源性和外源性槽口3所有3个转基因株系的基因座(图E) 。Northern blot和Western blot对1月龄小鼠大脑的分析表明,反映内源性和转基因表达的Notch3总转录物和蛋白质在TgNotch3系中增加了约4倍重量(第129行)和TgNotch3169C兰特(第88行)和TgNotch3行中约2倍大169C兰特(第92行)(图、F和G)。
重要的是,原位杂交显示槽口3Notch3转基因和非转基因大脑之间的mRNA。具体而言,在血管系统中检测到主要表达,在动脉和毛细血管中检测到强大的信号。在小脑中也观察到与Bergmann星形胶质细胞一致的低表达模式,而在所有其他类型的细胞中的表达可以忽略不计(图),如前所述(12,29). 与northern blot数据一致,槽口3与非转基因大脑相比,转基因大脑中的表达水平更强,并且在TgNotch3之间具有可比性重量(第129行)和TgNotch3169C兰特(第88行)小鼠。因此,除非另有规定,否则高表达突变系(第88行)用于进一步实验。
转基因小鼠过度表达槽口3以内源性样表达模式。原位杂交槽口3皮层切片上的反义核糖探针(A类–F类),胼胝体(G公司–L(左))和小脑(M(M)–R(右))来自1个月大的非转基因TgNotch3重量(第129行)和TgNotch1969年(第88行)小鼠。明亮和暗场图像分别显示在每个结构的上下面板上。在皮层和胼胝体,槽口3基本上在毛细血管(黑箭头)中检测到表达,转基因小鼠的信号较强,而非转基因小鼠信号较弱。在非转基因和转基因小鼠小脑的Bergmann胶质细胞(白箭头)中也检测到较弱的表达,在后者中表达较高。注意,在没有事先对小鼠进行经心灌注的情况下,大脑通过浸泡进行福尔马林固定。比例尺:60μm。
TgNotch3中的GOM存款169C兰特老鼠。
在TgNotch3的大脑中评估了GOM沉积,即CADASIL的血管特征169C兰特,Tg缺口3重量以及1至20个月龄的非转基因小鼠。在5个月大时,首次在突变小鼠的软脑膜动脉中检测到GOM沉积;它们位于平滑肌细胞的基底膜内,与CADASIL患者的发现相似(图A) ●●●●。随着年龄的增长,GOM沉积物的数量进一步增加,并在10-12个月大时广泛分布于脑动脉和毛细血管。重要的是,它们从未在非转基因对照和TgNotch3中检测到重量20个月大的小鼠(数据未显示)。
槽口3电子海图TgNotch3脑动脉和毛细血管中的聚集物和GOM沉积169C兰特老鼠。(A类)5个月大的TgNotch3软脑膜动脉的电子显微照片169C兰特小鼠平滑肌细胞基膜内有大量GOM沉积(红色箭头)。(B类–G公司)2个月大的TgNotch3脑动脉169C兰特和TgNotch3重量用细胞内(Bc4,绿色)或细胞外(5E1,红色)域特异性Notch3抗体对小鼠进行染色。缺口3的微观聚集体电子海图显示在变异动脉中。(H(H),我,K(K)、和L(左))2个月大的TgNotch3脑切片重量和TgNotch31969年用Notch3胞外区(5E1,红色)和IV型胶原(ColIV,绿色)抗体双重标记(H(H)和K(K))或用Bc4(绿色)和5E1(红色)Notch3抗体双重标记(我和L(左)). 细胞核用DAPI(蓝色)染色。野生型和突变型毛细血管(白色箭头)中可见核周包涵体,由Notch3细胞内和细胞外抗体强烈标记。(J型和M(M))12个月大的TgNotch3的脑切片重量(J型)和TgNotch3169C兰特(M(M))用Bc4(绿色)和5E1(红色)Notch3抗体双重标记。图中显示的是圆点状凹口3电子海图突变毛细血管中未被Bc4抗体染色的聚集物(红色箭头),而野生型毛细血管显示离散的核周内含物,标记有Notch3细胞内和细胞外抗体(白色箭头)。比例尺:1μm(A类),50微米(B类–G公司)和30微米(H(H)–M(M)).
缺口3的微观聚集体电子海图在TgNotch3中169C兰特老鼠。
我们比较了Notch3多肽在TgNotch3大脑中的分布169C兰特小鼠,TgNotch3重量使用细胞外Notch3(5E1)和细胞内Notch3(Bc4)特异性抗体的小鼠和1到20个月的非转基因同胞。我们还使用基底膜蛋白、珍珠糖和IV型胶原的抗体来标记脑血管,并使用平滑肌α-肌动蛋白抗体来区分动脉和毛细血管。Notch3免疫染色仅限于野生型和突变转基因小鼠的血管系统,在该测定中几乎无法检测到非转基因小鼠的内源性Notch3(补充图1;本文在线提供的补充材料;doi:10.1172/JCI39733DS1).
我们发现了特征性的Notch3电子海图聚集,无相关Notch3积聚TMIC公司,在TgNotch3的脑动脉中169C兰特1-2个月大的小鼠。具体来说,突变动脉显示出强烈的颗粒5E1染色,勾勒出平滑肌细胞,而TgNotch3中的那些重量小鼠表现出弥漫性微弱的5E1染色。值得注意的是,TgNotch3中的平滑肌细胞169C兰特和TgNotch3重量小鼠表现出与Bc4相似的扩散标记(图,B–G)。相反,在1-2个月大时,大脑毛细血管显示出明显的Notch3标记,尽管TgNotch3之间具有可比性169C兰特和TgNotch3重量鼠标(图、H和K)。特别是在两个TgNotch3中169C兰特和TgNotch3重量小鼠周细胞表现出大的核周内含物,5E1和Bc4强烈标记(图,I和L),与负载Notch3蛋白的培养细胞中的细胞非常相似(参考文献。30以及我们未发表的观察结果)。值得注意的是,随着TgNotch3的老化,这些细胞质内含物的数量逐渐减少169C兰特小鼠和较小程度的TgNotch3重量小鼠的毛细血管呈密集的点状5E1染色,伴有微弱的Bc4染色,出现在变异而非野生型毛细血管中,数量进一步增加(图、J和M)。在10-12个月大时,突变脑血管中的细胞质内含物几乎消失,几乎所有毛细血管都显示出显微Notch3电子海图骨料。我们一直注意到Notch3电子海图聚集体严格限制于脉管系统。此外,缺口3电子海图TgNotch3中未检测到聚集物重量20个月大的小鼠(补充图2)。
TgNotch3的进行性白质病变1969年老鼠。
Tg缺口3169C兰特小鼠的寿命可与24个月龄的对照小鼠相媲美,并且不会出现急性或慢性运动障碍。然而,突变小鼠在大约18到20个月时表现出广泛的脑白质损伤。脑切片苏木精和伊红染色显示TgNotch3白质中有大量空泡169C兰特小鼠,尤其是胼胝体、前连合、海马伞、内囊和纹状体白质束,而新皮质在组织学上似乎完好无损(图G和补充图3)。此外,Klüver-Barrera-Luxol固蓝染色显示白质束的Luxol染色减少,致密髓鞘和无组织纤维丢失。相反,控制TgNotch3重量而非转基因小鼠的脑实质几乎完好无损(图、A–G和补充图4)。
老年TgNotch3R169C小鼠的白质损伤和星形胶质细胞增生。(A类–F类)20个月龄TgNotch3的皮层、胼胝体和内囊中的Klüver-Barrera-Luxol固蓝染色重量和TgNotch31969年小鼠白质束出现空泡化,突变小鼠髓鞘苍白、紊乱。(G公司)20个月大的TgNotch3的皮层、胼胝体、海马伞和前连合(Ant.Comm.)中空泡区域的量化169C兰特与TgNotch3相比重量老鼠(n个=每组3-4只小鼠)。(H(H)–M(M))20个月龄TgNotch3的皮层、胼胝体和内囊中的GFAP染色重量和TgNotch3169C兰特显示TgNotch3白质束星形胶质细胞增生的小鼠169C兰特老鼠。(N个)20个月大的TgNotch3指示结构中星形胶质细胞增生的量化169C兰特小鼠与TgNotch3的比较重量老鼠(n个=每组4只小鼠)。比例尺:70μm。
我们用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体探测小鼠大脑。20个月大的TgNotch3脑白质中GFAP染色显著增强169C兰特小鼠,以星形胶质细胞突起增厚和分支为特征,而年龄匹配的TgNotch3重量小鼠表现出最小的染色(图、H–N和补充图4)。星形胶质细胞增生症的分布与空泡和低卢索染色相一致。尽管年轻的TgNotch3的脑实质在组织学上看起来完好无损169C兰特小鼠(补充图5,A和B),与年龄匹配的TgNotch3相比,这些小鼠在12个月大时GFAP染色显著增加,尤其是胼胝体和内囊重量小鼠(补充图5、C和D)。
TgNotch3静息脑血流量减少169C兰特老鼠。
在使用PET的CADASIL患者中,大脑皮层和白质中的脑血流量(CBF)减少(31)、SPECT(32)和MRI丸追踪(33). 我们测量了清醒时TgNotch3的静息CBF169C兰特小鼠和对照组TgNotch3重量和非转基因同窝小鼠通过使用可扩散放射性标记示踪剂的定量放射自显影术,该示踪剂通过脑微血管化测量局部组织灌注(补充图6和补充表1)。在18至20个月大时,我们发现TgNotch3整个脑白质的血流量显著减少16.0%±1.0%169C兰特小鼠与年龄匹配的TgNotch3的比较重量和非转基因小鼠。这些减少范围从内囊的10%到胼胝体的19%。突变小鼠正常灰质的血流也显著减少12.5%±0.4%,从丘脑的11%到皮层的15%不等(图). TgNotch3灰质中的CBF显著降低(5%–8%)169C兰特早在11-12个月大的小鼠,而在这个年龄段,TgNotch3之间的白质血流量值没有显著差异1969年和TgNotch3重量小鼠(补充图7)。
老年人TgNotch3静息CBF降低169C兰特老鼠。18个月大的TgNotch3通过新皮质、前脑(包括纹状体、苍白球和杏仁核)、丘脑、胼胝体、海马伞和内囊定量测量CBF169C兰特与TgNotch3相比重量非转基因小鼠在突变小鼠中表现为弥漫性脑灌注不足。每一个大区域都包括8-10个灰质区域或4-5个白质区域。
在TgNotch3中发现保留的动脉结构,但稀薄的白质毛细血管169C兰特老鼠。
为了研究白质损伤和CBF降低的潜在机制,我们首先检查突变Notch3是否改变了脑血管的结构。尽管Notch3负担沉重电子海图20个月大的TgNotch3软脑膜和较小穿透动脉中的积聚169C兰特小鼠(补充图2),Masson三色染色和半薄切片的高分辨率显微镜检查没有显示血管壁结构的明显变化(图A和数据未显示)。此外,平滑肌肌球蛋白重链免疫标记显示这些动脉中没有平滑肌细胞丢失的证据(图B) ●●●●。
动脉结构得以保留,但TgNotch3白质中的毛细血管密度逐渐减少169C兰特老鼠。(A类)Masson三色染色显示20个月大的TgNotch3的完整软脑膜动脉(上面板)和小动脉(下面板)169C兰特老鼠。(B类)平滑肌肌球蛋白重链标记显示20个月大的TgNotch3软脑膜和小动脉中平滑肌细胞的连续边缘169C兰特老鼠。(C类)槽口3的双重标签电子海图12个月大的TgNotch3皮层和胼胝体毛细血管的(5E1,红色)和IV型胶原(绿色)169C兰特小鼠表现出强大的Notch3聚集电子海图在两个毛细血管中。(D类)平均总毛细管长度(CD31的mm+每毫米结构2)在12个月和20个月大的TgNotch3的皮层中169C兰特小鼠和6、12和20个月大的TgNotch3胼胝体169C兰特小鼠与年龄匹配的TgNotch3的比较重量突变小鼠的白质毛细血管密度随着年龄的增长而逐渐减少(n个=每组4-5只小鼠)。比例尺:25μm。
为了评估突变Notch3是否损害了大脑微循环,我们量化了TgNotch3的平均总毛细血管长度169C兰特和TgNotch3重量大脑。作为TgNotch3中无或有进行性组织学改变的代表性脑区169C兰特我们分别检测了小鼠的新皮质和胼胝体。在5个月大的小鼠中,我们发现TgNotch3胼胝体毛细血管长度有下降的趋势169C兰特小鼠与年龄匹配的TgNotch3的比较重量老鼠。毛细血管长度的减少在12个月大时达到统计学意义,与星形胶质细胞增生症的出现同时,但在白质变性之前。在20个月大的突变小鼠中,这种减少进一步放大(图D) ●●●●。值得注意的是,TgNotch3皮层的平均总毛细血管长度是可比较的1969年和TgNotch3重量小鼠,尽管Notch3的密度电子海图灰质毛细血管和白质毛细血管之间的聚集物相似(图、C和D)。
保持TgNotch3血脑屏障的完整性169C兰特老鼠。
我们接下来检查了血脑屏障(BBB),因为血脑屏障的破坏与缺血性白质改变的发病机制有关(34,35). 我们检查了新皮质、胼胝体和内囊毛细血管的超微结构特征。在12个月大时与星形胶质细胞增生症同时,但在白质变性之前进行电子显微镜分析。补充图8A(未显示数据)显示TgNotch3中毛细血管超微结构完整169C兰特老鼠。具体而言,内皮细胞表现出完整的紧密连接,并被一层薄的基底膜包围,包裹着薄的周细胞轮廓,星形细胞足突紧贴基底膜。
我们还对BBB对大分子的渗透性进行了区域评估。向小鼠注射与白蛋白大小相同的葡聚糖荧光示踪剂,该示踪剂广泛用于BBB泄漏的调查(36). 重要的是,TgNotch3中的灰质和白质血管169C兰特和TgNotch3重量小鼠同样将70kDa荧光示踪剂保留在管腔内(补充图8、B和C,数据未显示)。
TgNotch3脑血管功能受损169C兰特老鼠。
接下来,我们研究了突变Notch3是否改变了脑血管系统的两个主要功能特性,即CBF自身调节和功能性充血(37). 在5-6个月大的时候对小鼠进行了研究,此时脑实质尚未检测到组织学改变。
脑血管自动调节抵消了日常活动中动脉血压正常波动的影响,这可能导致CBF的潜在有害增加或减少。因此,当血压降低时,大脑动脉会扩张,当血压升高时,大脑血管会收缩,范围在60-150毫米汞柱之间,以维持大致稳定的大脑灌注。我们在TgNotch3中发现,面对动脉压力的急性变化,大脑循环的适应性反应受损169C兰特老鼠。特别是,对照组TgNotch3的皮层血流(CoBF)自动调节下限(基线的90%)从60 mmHg改变重量和非转基因小鼠在TgNotch3中血压升高(80 mmHg)169C兰特鼠标(图A) ●●●●。相反,注射苯肾上腺素诱发的急性高血压与TgNotch3中CoBF增加较少相关169C兰特小鼠与对照组年龄匹配的TgNotch3的比较重量鼠标(图B) 。这些发现与突变小鼠的肌源性反应改变或血管阻力增加一致。此外,尽管尚未探索激发性高血压的全部自动调节范围,但数据表明,突变小鼠的压力-流量曲线右移,与慢性高血压小鼠相似。然而值得注意的是,TgNotch31969年小鼠的静息动脉血压正常(补充表2)。
年轻人TgNotch3脑血管自动调节受损和功能性充血减轻169C兰特老鼠。(A类)5个月龄非转基因小鼠TgNotch3的CoBF自身调节曲线重量和TgNotch3169C兰特对激发性低血压作出反应的小鼠表明,在TgNotch3中,CoBF保持在90%以上(较低的虚线,被认为是自动调节的下限),高达60 mmHg重量和非转基因小鼠,但在TgNotch3中仅高达80 mmHg169C兰特老鼠。(B类)在5个月大的非转基因小鼠TgNotch3中,注射苯肾上腺素(40μg/kg)诱导动脉血压升高(ΔMABP,单位mmHg)时,CoBF(百分比变化)的变化重量和TgNotch3169C兰特突变小鼠表现出较小的CoBF增加。(C类)5至6个月大的非转基因TgNotch3受触须刺激后体感皮层的CoBF增加(%)重量和TgNotch31969年突变小鼠功能性充血减弱。
功能性充血与特定脑区突触活动增加引起的血流增加有关。我们研究了胡须刺激引起的体感皮层反应。Tg缺口31969年小鼠对这种生理激活表现出不同的CoBF反应。TgNotch3诱发的体感皮层中35.5%–36.6%的CoBF增加重量或非转基因小鼠在TgNotch3中显著减毒31%–33%169C兰特鼠标(图C) ●●●●。相反,在突变小鼠中,高碳酸血症产生的CoBF的增加没有改变,这表明血管舒张功能的缺乏不是由于该年龄段的全身血管功能障碍所致(补充图9)。
为了探讨突变Notch3引起的血管功能障碍,在显微镜下解剖突变小鼠和对照小鼠的大脑后动脉,将其安装在压力动脉造影仪上,并用血管活性药物或压力变化刺激。TgNotch3对硝普钠的舒张作用和对苯肾上腺素的收缩反应169C兰特动脉与TgNotch3的动脉相似重量和非转基因同窝小鼠(数据未显示)。然而,TgNotch3中的压力诱导收缩显著减弱169C兰特动脉与TgNotch3的比较重量和非转基因动脉(图A) ●●●●。例如,在75 mmHg时,TgNotch3的肌原性张力降低26%-30%169C兰特老鼠(P(P)< 0.01). 此外,与EGTA和硝普钠使平滑肌细胞失活后动脉最大扩张有关的被动内径在TgNotch3脑动脉中显著减少169C兰特小鼠比TgNotch3小鼠重量和非转基因对照小鼠在超过25 mmHg的所有压力下(图B) 。因此,“扩张器储备”(定义为主动和被动直径之间的差异)在TgNotch3中显著减少169C兰特小鼠(在TgNotch3中分别为26.2±2.3μm和38.6±2.5μm重量非转基因小鼠在75 mmHg时为44.1±2.1μm;P(P)< 0.01). 值得注意的是,TgNotch3脑动脉的壁厚没有显著差异169C兰特小鼠比对照组TgNotch3重量和非转基因小鼠(数据未显示)。总之,这些数据提供了证据,表明突变的Notch3改变了脑动脉的机械特性和肌源性反应,脑血管功能障碍是疾病过程中的早期事件。
幼年TgNotch3力学性能和肌源性反应的改变169C兰特老鼠。(A类)6个月大的非转基因TgNotch3大鼠大脑动脉对压力(肌源性张力)逐步升高的反应重量,和TgNotch3169C兰特小鼠显示TgNotch3的肌原性张力显著减弱169C兰特老鼠。(B类)6个月大的非转基因TgNotch3大鼠在EGTA和硝普钠(被动直径)最大扩张期间脑动脉内径/压力的关系重量和TgNotch3169C兰特老鼠。TgNotch3的被动直径明显较小169C兰特小鼠与非转基因和TgNotch3的比较重量老鼠。
讨论
CADASIL小鼠脑损伤模型。
尽管槽口3导致CADASIL的突变早在十多年前就被发现了,由于缺乏显示脑实质损伤的动物模型,在理解脑损伤的潜在机制方面的进展受到了阻碍(24,25). 在这里,我们报告了将导致CADASIL的Notch3突变引入PAC,并开发了转基因小鼠模型,该模型显示了这种大DNA构建物的精确细胞类型特异性表达,模拟了CADASIL的几个基本病理学方面。具体而言,突变小鼠发展为早发型病理学Notch3电子海图聚集物和GOM沉积在脑血管中,白质缓慢进行性变性,脑灌注不足,这与CADASIL患者的性质和进展相类似。槽口3电子海图据报道,在出现临床症状和MRI变化之前,人类CADASIL患者在疾病早期就出现了聚集物和GOM沉积(参考文献。38以及我们未发表的观察结果)。转基因突变小鼠中的孤立白质病变与人类数据相关,因为孤立白质疏松症(推测与人类白质损伤相关的MRI)发生在人类CADASIL患者的腔隙性梗死和临床症状出现之前多年。此外,我们发现正常的新皮质和受损的白质灌注不足,这与人类研究一致(33).
Notch3转基因表达。
该转基因小鼠模型与之前未发生脑损伤的小鼠模型之间的主要差异(22–24)是突变型Notch3的高过表达水平。因此,我们发现高表达(第88行)而非低表达的突变基因第92行发生脑损伤(数据未显示)。然而,突变型Notch3的强过表达是否会产生更稳健的CADASIL小鼠模型尚不确定。我们的数据表明,野生型和突变型PAC转基因小鼠均发育出Notch3细胞质内含物,这与在负载Notch蛋白的转染细胞中看到的那些细胞质内含体非常相似(参考文献。30以及我们未发表的观察结果)。因此,92号线的细胞质内含物频率低于88号线和129号线,并且在88号线与129号线上具有可比性,它们表达了类似水平的转基因,支持了这样的观点,即这些内含物的形成与转基因的过表达水平有关。此外,野生型PAC转基因小鼠的大脑和血管在组织学和功能上均正常的发现,与这些内含物的致病作用相矛盾。重要的是,我们发现存在Notch3细胞质内含物和Notch3电子海图突变小鼠的聚集物在给定细胞内是相互排斥的,Notch3的出现电子海图毛细血管中的聚集延迟,与偶尔出现包裹体的动脉相比,毛细血管中包裹体的频率较高。总之,这些发现使我们提出,在临界阈值以上过度表达Notch3可能有助于隔离Notch3前体,缩短接触致病性Notch3多肽的时间,从而延迟疾病进程的开始。目前的转基因小鼠和我们以前的转基因小鼠之间的另一个重要区别是Notch3转基因的分布模式。虽然两种转基因小鼠都以脑动脉为靶点,但前者以毛细血管为靶点而非后者,因为SM22α启动子元件在平滑肌细胞中驱动转基因表达,而在周细胞中不驱动转基因表达(39). 这可能与我们支持微循环参与脑损伤机制的数据特别相关(见下文)。
白质损伤和脑灌注不足。
有令人信服的证据表明,慢性低灌注在脑白质疏松症的发病机制中很重要(40). CBF对人类患者的研究表明,白质疏松区域内的白质灌注不足,在较小程度上,正常白质灌注不足(41). 啮齿动物的实验研究表明,永久性结扎或双侧颈总动脉狭窄导致的慢性脑灌注不足,主要导致白质损伤,伴有空泡化、星形胶质细胞增生和脱髓鞘(2,42,43). 重要的是,对小鼠进行的研究表明,低灌注的程度决定了白质与灰质损伤的比例,而低灌注水平是通过调整颈动脉周围微弹簧的内径来控制的。具体来说,轻度低灌注导致白质的选择性损伤,而更严重的低灌注则导致白质和灰质损伤(43,44). 在此,我们表明,老龄突变转基因小鼠表现出静息期CBF的中度普遍降低,白质束中CBF的降低趋势更强。值得注意的是,由于示踪剂在死后从高血流量的大灰质区扩散到周围半流值的薄白质束,白质灌注不足可能被低估了(45). 以下2个观察结果支持低灌注在该小鼠模型白质损伤发病机制中的因果作用,而不是由于受损组织需求减少导致的二次灌注减少。首先,在20个月大时,CBF不仅在受损的白质中下降,而且在未受损的区域,如新皮质中也下降。第二,我们发现在大脑损伤出现之前的12个月大时已经检测到CBF降低。突变转基因小鼠白质损伤与低灌注相关的其他证据来自于我们在这里观察到的损伤与这些慢性中度低灌注啮齿类动物模型中报告的损伤之间惊人的相似性(43). 最后,我们的发现是,突变型Notch3的过度表达在血管细胞中占主导地位,在除小脑Bergmann胶质细胞外的其他细胞类型中可以忽略不计,这进一步支持了这样的观点,即该小鼠模型中的白质损伤是由血管功能不全引起的,而不是通过少突胶质细胞或其他类型白质细胞的原发性缺陷。明确的证据可能需要产生和分析在非血管细胞中特异表达突变Notch3的小鼠。
脑损伤和低灌注的机制。
虽然已经提出了许多机制来解释缺血性脑SVD中的脑实质损伤和低灌注,包括CADASIL,但引发病变的最早病理事件尚不清楚。目前的研究提供了令人信服的证据,表明除了微循环稀疏外,脑血管功能障碍也是致病性突变Notch3表达的最早结果。首先,我们在突变小鼠中发现了脑血管自动调节受损,这种情况早在5-6个月大时就很明显,因此在白质首次组织学改变前几个月就很明显了。这一结果与我们之前对表达R90C NOTCH3突变体的转基因小鼠的研究一致(46). 其次,我们记录下年轻的TgNotch3169C兰特小鼠功能性充血减轻。第三,我们对孤立动脉的实验表明,突变Notch3在早期影响(a)大脑动脉的功能特性,导致肌源性反应减弱,以及(b)这些动脉的机械特性,导致血管直径减小。这两种改变都导致扩张器储备减少。此外,根据泊肃伊勒定律,如果动脉段的阻力与血管半径的四次方成反比,则动脉管径的减小将导致血管阻力显著增加,血流量减少。第四,我们发现脑白质毛细血管逐渐稀疏,并提供了令人信服的证据,证明这也是早期表现。特别是,我们表明白质中的毛细血管减少发生在该区域CBF减少之前,反对由于血流减少而通过修剪进行二次减少。相反,该观察结果支持相反的因果顺序,即毛细血管稀疏有助于CBF减少。因此,我们的总体研究结果支持这样一种假设,即大脑动脉的机械和功能改变与毛细血管床的减少相一致,从而降低基线脑灌注并损害白质,而白质极易受到灌注下降的影响。此外,当动脉血压下降时,脑血管自动调节的改变预计会加剧CBF的降低,尤其是白质,白质由侧支血流量有限的终末血管供应(37). 重要的是,我们证明了这种小鼠模型的神经病理学改变发生在脑动脉结构没有组织学上可检测到的改变的情况下。因此,与人们的普遍看法相反,我们的数据表明,动脉壁的平滑肌细胞丢失和纤维化不会导致疾病的发生,但这并不是说,一旦出现这些结构性病变,就不会加重脑血管功能障碍,加重已经在进行中的脑损伤。
目前尚不清楚为什么白质中毛细血管密度主要降低,因为这与突变型Notch3的更广泛表达和Notch3沉积形成对比电子海图沿着脑毛细血管床聚集。未来的研究应旨在确定毛细管减少的机制。
值得一提的是,TgNotch3169C兰特小鼠没有完全重现CADASIL病,因为它们没有发展成腔隙性梗死。这可能是由于人类和小鼠在大脑大小、血管构筑以及小鼠白质/灰质比率较低方面的差异造成的。因此,与人类相比,小鼠大脑中明显易受灌注下降影响的区域可能更离散。
总之,我们的数据表明,当在精确的时空模式中过度表达适量的突变Notch3时,CADASIL的主要病理特征可以在小鼠中重现。我们的发现为脑血管功能障碍和微循环衰竭提供了令人信服的证据,这是致病性突变Notch3的最早后果,最终导致这一新型缺血性脑SVD遗传模型中的进行性低灌注和白质损伤。这些小鼠将有助于探索CADASIL和非遗传性缺血性SVD的治疗干预机制和疗效。
方法
转基因小鼠的产生
包含大鼠基因组的172-kb PAC克隆RPCI31.78K09槽口3通过大鼠PAC文库的PCR池筛选鉴定该位点(27). 我们操纵了槽口3中的PAC克隆大肠杆菌使用Yang等人描述的基于温度敏感穿梭载体的同源重组系统(28)这是一种只留下所需突变的方法,用于创建R169C CADASIL氨基酸替代物。通过限制性内切酶片段定位和脉冲场凝胶电泳分析、PCR和DNA测序确定最终产物的保真度。使用标准方案纯化PAC DNA并制备用于微量注射(47,48).AscI公司线性化凹口3重量和槽口3169C兰特将170kb PAC构建物注入FVB/N小鼠卵母细胞。每个构建物的阳性转基因创始小鼠鉴定如下:(a)一只FVB/N-TgNotch3(第129行)/Bbb小鼠表达含有170-kb PAC克隆的大鼠野生型(未修改)Notch3,(b)两只FVB/N-TgNotch2(第88行)/Bbb和FVB/N-TgNotch 3(第92行)/Bbsb小鼠表达CADASIL引起的R169C Notch3。应变称为TgNotch3重量(第129行),TgNotch3169C兰特(第88行)和TgNotch3169C兰特(第92行)。170-kb突变体和野生型全长基因组整合的完整性槽口3通过Southern印迹和PCR分析评估所有3个已建立品系(品系88、92和129)中的PACs。小鼠在FVB/N背景下回交至少10次,并保持在该菌株中。所有被分析的转基因小鼠都以杂合状态携带转基因。本研究中描述的所有实验均完全按照马克斯·德布鲁克分子医学中心动物护理和使用委员会(Landesamt für Gesundheit und Soziales G0034/98)和INSERM(法国巴黎;法国伊利委员会4)的指导方针进行,尽一切努力将使用的动物数量降至最低。
Northern印迹和RT-PCR
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从大脑中提取总RNA。20微克RNA在6.8%甲醛、1%琼脂糖凝胶上电泳,转移到Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences)上,并用5′大鼠Notch3 cDNA片段(gi:9966774;nt 1199-2005)进行探测。
我们使用M-MLV逆转录酶(Invitrogen)将3μg DNaseI处理的RNA逆转录成cDNA。从每种基因型的3种不同动物身上制备脑cDNA,并对每个样本进行一式两份的分析。RT-PCR引物设计用于识别内源性小鼠槽口3和外源大鼠槽口3(5′-GCAGGTGATGGCCTATAGTC-3′,5′-GGTCAGCCCTACCATTAT-3′)。
蛋白质印迹
脑样品在添加了蛋白酶抑制剂(1×完整蛋白酶抑制剂混合物;罗氏诊断公司)的冰镇RIPA缓冲液(150 mM NaCl,50 mM Tris-HCL,1%NP-40,0.1%SDS,0.5%脱氧胆酸钠)中均质。在6%SDS-PAGE中分离每个样品的蛋白提取物(40μg),转移到硝化纤维素膜上,与小鼠单克隆抗Notch3孵育电子海图抗体(12)(克隆5E1,1:500稀释),然后是过氧化物酶结合的山羊抗小鼠。使用小鼠抗α-微管蛋白(克隆DM 1A,1:15000稀释度)(Sigma-Aldrich)和兔抗平滑肌肌球蛋白重链(1:5000稀释率)(Biomedical Technologies Inc.)检查是否装载了等量的蛋白提取物。
原位杂交
我们使用807-bp的大鼠PCR产物槽口3mRNA(gi:9966774;nt 1199-2005)克隆到pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen)中,作为模板合成反义cRNA探针。质粒用Sac-I线性化,并用T7 RNA聚合酶在[35S] -UTP。按照补充方法进行原位杂交。切片在Leica DMR显微镜上用暗场和明场照明进行检查。
组织学、免疫组织化学和GOM沉积分析
通过分析1月龄、6月龄、12月龄和20月龄非转基因和转基因小鼠,研究转基因小鼠的组织病理学特征。按照补充方法中的描述,对组织进行组织学、免疫组织化学和电子显微镜分析。
液泡和GFAP面积的定量
苏木精和伊红染色的矢状面切片(n个=每个区域每只老鼠9节)或GFAP(n个=每只小鼠每区域8–22个切片),根据小鼠脑图谱选择在距中线0.5至2.0 mm的外侧(49). 从CCD彩色摄像机收集到覆盖所有感兴趣区域最多的图像,并使用NIS-Element BR 3.0(尼康)软件进行分析。对同时处理的突变和野生型动物的切片进行定量比较,每个年龄组同时使用相同设置获得数字图像。液泡的面积表示为每个区域总表面的百分比,每个感兴趣区域的血管面积从空白区域中手动减去。GFAP-免疫阳性面积表示为总图像面积的百分比。
毛细管长度测量
用戊巴比妥钠对小鼠进行深度麻醉,并经心灌注50 ml 1×PBS,然后在磷酸盐缓冲液中灌注200 ml 4%多聚甲醛。取脑,半切,在4°C的4%多聚甲醛中固定24小时,在4℃的15%–30%蔗糖中冷冻,并包埋在OCT中(Tissue-Tek)。用5%的山羊血清和0.4%的Triton X-100在室温下封闭自由漂浮的弓形虫切片(20μm;每只小鼠6个切片)2小时,并在4°C下与大鼠单克隆抗鼠CD31(1:50;BD Biosciences-Pharmingen)在5%山羊血清和0.4%的Trion X-100中孵育过夜。然后清洗切片,并在室温下用Alexa Fluor 594抗鼠IgG(1:500;Invitrogen)孵育2小时。图像是使用尼康eclipse 80i荧光显微镜拍摄的。从CCD彩色摄像机收集覆盖研究区域最多的图像(×40物镜),并使用NIS-Element BR 3.0(尼康)软件进行分析。CD31的总长度+血管表示为CD31的总长度(mm)+单位面积的容器(mm2). 对来自突变型和野生型动物的切片进行平行处理。
BBB分析
电子显微镜。
用戊巴比妥钠对小鼠进行深度麻醉,并经心灌注20 ml 0.5%多聚甲醛和0.05%戊二醛,然后在磷酸盐缓冲液中灌注500 ml 2%多聚甲醛和和2%戊二醛。在显微镜下解剖感兴趣区域内的脑样本(0.5–1 mm),并在4°C下固定12小时。样品在4°C的1%四氧化锇中进一步固定2小时,用分级浓度的酒精脱水,并嵌入Epon中。按照上述方法处理超薄切片,并用飞利浦CM100电子显微镜观察。
生物素化70-kDa葡聚糖荧光分析。
通过尾静脉向小鼠注射2 mg生物素化70-kDa葡聚糖(Sigma-Aldrich),让葡聚糖循环2小时,然后用氟烷和断头处死小鼠。大脑在4°C的4%多聚甲醛中固定24小时,然后在15%–30%蔗糖中培养以进行冷冻保护。如上文所述,进一步处理游离切片(20μm)进行FITC-链霉亲和素和CD31联合免疫染色。突变体和野生型动物被并行处理。使用激光扫描共焦成像系统(Leica TCS SP5 AOBS串联共振扫描仪)观察右旋糖酐和CD31荧光。使用LAS AF Lite成像软件(Leica)处理光学切片,并评估重建图像中CD31划定的腔内空间外是否存在右旋糖酐。
CBF分析
静止CBF的放射自显影测量。
用定量放射自显影技术测量清醒小鼠的CBF[14C] 碘安替比林(IAP)作为一种可扩散示踪剂,遵循适用于小鼠的方案(50,51). 异氟醚麻醉下(25%氧气中通过面罩吸入2%逐渐减少至1.7%2和75%N2),对股骨血管进行插管,以进行示踪剂输注、持续动脉压监测和动脉血样采集。将Tygon导管肝素化,以提供1000 IU/kg。仔细缝合皮肤切口,并用2%利多卡因凝胶覆盖。将小鼠置于最低限度的束缚下,并允许其从麻醉中恢复2小时。连续监测心率和动脉血压(PowerLab/8SP)。使用直肠探头监测体温,并将其保持在37.0°C至37.7°C之间。在测量CBF之前不久测量动脉血气、pH值和红细胞压积(Ciba-Corning 248)。IAP(ARC,54 mCi/mmol,生理盐水,100μCi/kg,0.2 ml)使用可编程输液泵(哈佛44)以恒定速率静脉注射,以产生示踪剂的斜动脉浓度曲线。同时,在30秒内连续采集8-10份动脉血样。为了避免低血压,采集少量样品(10–20μl),同时注入类似体积的示踪液。注射结束后,将小鼠斩首,并将其整个头部快速冷冻在-30°C的异戊烷中。矢状脑切片(20μm)在冷冻器上切割,安装在玻璃载玻片上,用于放射自显影或甲酚紫染色用于组织学检查。[14C] -脑内示踪剂浓度通过使用校准的自动射线图密度分析(MCID;成像研究)进行评估14电影的C标准。使用脑组织中累积的局部示踪剂浓度和动脉血浆样品中通过液体闪烁计数的动脉示踪剂浓度的时间过程来计算区域CBF(ml/100g脑组织/min)。我们还应用了Jay和同事在血流计算中引入的冲刷系数校正,以提高低血流量值的准确性(50). 我们使用小鼠脑图谱在甲酚紫染色切片上识别出25个白色和58个灰质感兴趣区域(49). 将各大区域合并在一起进行统计分析。
激光多普勒流速测定CoBF。
如上所述,在异氟烷麻醉下进行手术准备。然后将头部放置在Kopf立体定向框架中,左侧和右侧顶骨(约2.5 mm2区域)用牙钻稀释至半透明。然后小心地将两个激光多普勒流量计探头(摩尔仪器MBF3-Dual)放置在皮层上方,以避免大血管。持续监测心率、血压和CoBF(PowerLab/8SP)。实验结束时,过量戊巴比妥停循环后,CoBF值为零。如前所述,在清醒动物中测量脑血管的自动调节和对高碳酸血症的反应(46)和补充方法。在异氟醚麻醉的动物上测量对触须刺激的反应。激光多普勒流量计探头以立体定向方式放置在桶野(S1bf)左右体感区的上方,坐标为bregma 0.0至-1.2,横向2.8至3.5mm。手术准备后,异氟醚降至1.2%至1.5%,当高碳酸血症反应恢复时开始测量。将弧菌夹在5毫米处,用棉头敷贴器轻轻刺激30秒,交替刺激左右胡须。单侧触须刺激使对侧躯体感觉皮层的CoBF增加,达到稳定状态。CoBF反应表示为刺激前高于基线的百分比增加。每只小鼠保留四个反应。与双侧CoBF变化或动脉血压或心率变化相关的反应被丢弃。
血管功能分析
选择大脑后动脉的第一段进行分析,因为与其他脑动脉相比,大脑后动脉具有较少的侧支。在光学显微镜下解剖3至5毫米长的动脉段,并将其安装在视频监控灌注系统(Living Systems Instrumentation)中,如前所述(19). 简单地说,动脉段在2个玻璃微移液管上插管,使用尼龙单丝固定两端,并在存在侧支时闭合侧支,然后在5 ml的小室中沐浴,小室中含有pH值为7.4、pH值为02160 mmHg和pCO237毫米汞柱。压力由伺服灌注系统控制。使用显微镜和摄像机,将血管图像投影到视频监视器上,并使用电子尺寸分析仪测量内腔直径。准备好后,在开始分析以获得基础色调之前,让动脉在50 mmHg的压力下稳定至少20分钟。使用富钾溶液(80 mmol/l)和苯肾上腺素(10μmol/l)测试动脉存活率。通过将腔内压力从10毫米汞柱逐步增加到100毫米汞柱来确定肌源性张力。生理盐水中测得的直径被视为有效直径。在加压至50 mmHg的血管上检测血管活性;用苯肾上腺素(10–9至10–4mol/l),并用硝普钠(10–10至10–4用苯肾上腺素(10μmol/l)预限制30%~35%的血管。在形成稳定的基线直径后,获得累积剂量-反应曲线。在每个实验结束时,动脉都被过量的钙2+-含有EGTA(2 mmol/l)和硝普钠(10μmol/l)的游离生理盐溶液。重复压力步骤以确定动脉的被动直径。在完成压力步骤后,通过在CARSON固定液中灌注固定最大扩张的血管,而血管内压力保持在50 mmHg。对固定血管进行处理,将其嵌入epon中,并在1μm处进行切片。
压力和直径测量值由Biopac数据采集系统(BiopacMP150)收集并连续记录。使用Acqknowledge软件对数据进行分析。结果以微米为单位给出动脉直径。肌源性张力表示为被动直径的百分比([被动直径-主动直径]/被动直径×100)。硝普钠的舒张作用表示为苯肾上腺素诱导的预狭窄的扩张百分比。从CCD彩色摄像机采集动脉组织学图像,并使用NIS-Element BR 3.0(尼康)软件测定壁厚。
统计
数据表示为平均值±SEM。使用双尾模型分析两组比较吨独立样本测试。采用单因素方差分析和Tukey事后检验(Statview)评估多重比较。采用重复测量方差分析(Statview)比较CoBF自动调节曲线、苯肾上腺素和硝普钠的累积剂量反应曲线、肌原性张力和被动直径。采用双向方差分析法对混合模型(固定因子:直线;随机因子:小鼠)的CoBF变化进行分析,以考虑到来自同一动物的多个测量值。使用SAS软件9.2版的PROC MIXED进行计算。使用Shapiro-Wilk检验检验分布的正态性。在非高斯分布的情况下,在方差分析之前应用对数变换。使用适当的对比度和Tukey的多重性校正进行了两次比较。P(P)小于0.05的值被认为是显著的。