核酸研究。2010年1月；38（数据库问题）：D792–D799。
PrimerBank：用于基因表达检测和量化的人和鼠PCR引物对资源
,1,2 ,1,2 ,1,2和1,2,*
阿萨纳西亚·斯潘迪多斯
1马萨诸塞州总医院计算与集成生物学中心2哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿剑桥街185号，邮编02114-2790
王晓伟
1马萨诸塞州总医院计算与集成生物学中心2哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿剑桥街185号，邮编02114-2790
王华军
1马萨诸塞州总医院计算与集成生物学中心2哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿剑桥街185号，邮编02114-2790
布莱恩·赛德
1马萨诸塞州总医院计算与集成生物学中心2哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿剑桥街185号，邮编02114-2790
1马萨诸塞州总医院计算与集成生物学中心2哈佛医学院遗传学系，美国马萨诸塞州波士顿剑桥街185号，邮编02114-2790
现地址：王晓伟，华盛顿大学医学院放射肿瘤学系生物信息学和结果研究部，4921 Parkview Place，St Louis，MO 63110，USA。
收到日期：2009年7月27日；2009年10月16日接受。
摘要
PrimerBank银行(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)是检索人类和小鼠引物对的公共资源，用于通过PCR和定量PCR（QPCR）进行基因表达分析。从PrimerBank数据库中可以访问涵盖大多数已知人类和小鼠基因的306800个引物，以及这些引物的信息，如T型米，在转录物上的位置和扩增子大小。对于每个基因，至少设计了一对引物，在许多情况下，存在替代引物对。引物设计为在相同PCR条件下工作，从而促进高通量QPCR。有几种方法可以搜索感兴趣基因的引物，例如：GenBank登录号、NCBI蛋白登录号、NSBI基因ID、PrimerBank ID、NCBI-基因符号或基因描述（关键字）。通过QPCR、琼脂糖凝胶分析、测序和BLAST，总共对覆盖大多数已知小鼠基因的26855个引物对进行了实验验证，所有验证数据都可以从PrimerBank网站上免费访问。
简介
定量聚合酶链反应（QPCR）已成为精确测定基因表达和评估DNA微阵列数据的常用方法(1,2). 该技术的主要优点是其无与伦比的动态范围，能够检测>107-将表达差异和扩增极少量DNA模板的潜力折叠成单个拷贝(3–5). QPCR产品可以通过两种通用方法检测：一种是利用各种类型的荧光杂交探针(6–20)另一种是利用SYBR Green I染料荧光(21–23). 杂交探针被设计为靶向特异性探针，因此可以最小化非特异性扩增，但可能难以设计且成本高昂(5). SYBR Green I方法是最简单、最便宜的QPCR方法，已成为基因表达分析中最常用的方法(21,22). SYBR Green I染料嵌入到双链DNA中，如PCR产物，产生可检测的荧光，对应于每个循环中PCR产物的生成量(23). QPCR扩增图为样品之间的相对定量和初始DNA模板的数量提供信息(24–26). QPCR步骤后生成的解离曲线可以提供反应特异性的信息(27).
我们开发了一个名为PrimerBank的数据库(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)，用于检索人类和小鼠引物对，以通过PCR和QPCR进行基因表达分析。PrimerBank引物可以与SYBR Green I检测方法一起使用，并且引物的设计基于以前用于DNA微阵列寡核苷酸探针设计的算法(28). 非靶序列的非特异性扩增是PCR和QPCR实验中常见的问题。因此，在PrimerBank引物设计中，使用了各种交叉反应性过滤器来减少非特异性扩增(29). 此外，所有底漆都设计为在60°C的高温退火条件下工作。至少有一对引物代表每个基因，在许多情况下设计了替代引物对。请参阅有关PrimerBank中包含的引物的信息。此外，我们之前已经通过实验验证了26 855对引物，它们涵盖了大多数已知的小鼠基因(30). 我们发现，PrimerBank引物可以特异性地扩增所设计的基因（通过琼脂糖凝胶分析显示预期大小的一条带，成功率为82.6%）。还分析了QPCR技术的再现性和使用PrimerBank引物扩增的均匀性(30). 此外，使用PrimerBank引物测定了QPCR的扩增效率，使用分析方法发现，13对引物的扩增效率在79%到96%之间。使用与上述相同的13个PrimerBank引物对，并使用模板DNA的一系列滴定QPCR中的每个引物对进行单向ANOVA（方差分析）分析，以确定不同PrimerBank引物对之间的扩增效率是否相似。发现这些引物对之间的效率相似(P（P）=0.7338，即。P（P）> 0.05) (30). 由于PrimerBank引物被设计为在相同的退火温度下使用，因此作为DNA微阵列的替代方法，高通量QPCR并行被促进(31,32)用于基因表达研究。
表1。
| 引物数量 | 覆盖的基因数量 | 有机体 | 实验验证的引物对数量 |
|---|
| 306 800 | 61 425 | 所有生物体 | 26 855 |
| 138 918 | 27 684 | 小家鼠 | 26 855 |
| 167 882 | 33 741 | 智人 | |
底漆设计
DNA微阵列的寡核苷酸探针序列设计已成为许多使用多种算法的研究主题(33–46). 大多数算法使用BLAST(47)确定可从中选择寡核苷酸序列的基因区域(48). PCR引物设计可以基于这些算法，因为BLAST用于DNA微阵列探针和PCR引物的设计。PrimerBank引物设计基于一种成功的方法，该方法以前用于预测DNA微阵列的寡核苷酸探针(28). 然而，PrimerBank引物的设计因添加了被认为对引物特异性很重要的过滤器而有所不同(29).
所有基因序列信息均来自NCBI蛋白质数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) (49). 检索DNA编码序列，并使用DeRedund程序对冗余序列进行聚类(28). 低复杂性区域，可能有助于引物交叉反应(50)，使用程序DUST排除(51). 如果引物包含六个或更多相同的相邻碱基，则会被拒绝，以便选择更复杂的序列。此外，没有从序列的低质量区域中选择引物(29). 引物被设计成至少代表每个基因一次，并且覆盖了大多数已知的人类和小鼠基因。请参阅用于基因表达方面引物对设计的统计。
表2。
| 小鼠引物对或基因 | 验证的小鼠基因/引物对数量 | 总引物对的百分比（%） |
|---|
| 引物对总数 | 26 855 | 100 |
| 代表的基因总数 | 27 684 | – |
| 未表示的基因总数 | 1165 | – |
| 无冗余的引物对 | 23 700 | 88.2 |
| 具有两个靶基因的引物对 | 2534 | 9.4 |
| 含有2个以上靶基因的引物对 | 621 | 2.3 |
| 基于所有验证标准的成功引物对总数 | 17 483 | 65.1 |
| 基于琼脂糖凝胶电泳的成功引物对总数 | 22 189 | 82.6 |
| 基于BLAST分析的成功引物对总数 | 19 453 | 72.4 |
| QPCR失败的引物对总数（由于没有扩增） | 1745 | 6.5 |
在许多情况下，编码区从5′端扫描到3′端，直到找到三对合适的引物（在这些情况下，引物的PrimerBank ID包含“a1”、“a2”或“a3”，“a1“引物对最多为5′，“a3“最多为3′）。cDNA文库制备有两种常用方法：寡核苷酸（dT）法和随机启动法。cDNA制备过程中的寡核苷酸（dT）启动可能导致序列5′端覆盖率降低，因为一些3′UTR可能很长(三). 随机引物可以使5′末端的覆盖率达到最高，这种方法用于我们的cDNA制备(三,30). 由于5′端的覆盖率较高，大多数5′引物都经过了实验验证（见下文“数据库生成和内容”一节）。此外，设计的引物与它们在外显子上的位置无关。为了防止任何污染基因组DNA的非特异性扩增，可以将引物设计为位于外显子边界；然而，在许多情况下，不可能设计出位于外显子边界的符合所有设计标准的引物，因为一些转录物由单个外显子组成。请参阅用于统计引物相对于外显子的位置。
表3。
| F底漆 | R底漆 | PrimerBank小鼠引物对的数量 |
|---|
| BLAST分析 | BLAST分析 | 26 854 |
| 与基因组序列匹配 | 与基因组序列匹配 | 19 668 |
| 位于外显子-外显子边界 | 位于外显子-外显子边界 | 311 |
| 位于外显子上 | 位于外显子-外显子边界 | 1576 |
| 位于外显子-外显子边界 | 位于外显子上 | 1425 |
| 位于外显子 | 位于外显子 | 16 356 |
| 位于同一外显子上 | 位于同一外显子上 | 11 235 |
PrimerBank底漆的设计具有均匀的长度和GC%特性(29). 所有PrimerBank引物均为19–23 nt，首选长度为21 nt。该长度最适合基因特异性序列，并将交叉反应性降至最低。此外，如果大规模合成引物，则优化该长度以降低成本。底漆的GC%为35%至65%，以确保均匀涂底漆。用于引物设计的算法还评估了引物3′末端最后五个残基的ΔG值，并采用−9 kcal/mol的阈值作为引物排斥。这样做是为了最小化非特异性扩增，因为引物的3′部分对非特异性引物延伸的贡献最大，特别是当这些残基的结合相对稳定时(52).
熔化温度(T型米)确定最佳退火温度。存在各种方法来确定T型米(53–55). 我们使用了最近邻法(55)基于此所有底漆T型米s介于60°C和63°C之间。因此，这些引物可以使用较高的退火温度，从而减少非特异性扩增，这是PCR实验中经常出现的问题。所有引物均设计用于扩增150-350 bp的短扩增子，如果由于其他设计限制无法满足此要求，则偶尔可接受100-800 bp的扩增子。短扩增子更容易扩增，这些反应的PCR效率更高。
我们对交叉反应性的主要过滤是对包含在其他序列中也发现的连续残基的引物的排斥。我们发现，拒绝完美15-mer匹配的过滤器截止是最严格的可行过滤器(28). 因此，如果引物中存在重复的15-mer，则被拒绝（通过将引物序列中的每一个可能15-mer与设计空间中所有已知序列的两条链进行比较）。为了确定是否存在交叉反应性，对设计空间中的所有已知序列进行BLAST序列相似性搜索，要求接受的引物BLAST得分<30(28). 使用额外的过滤器来补偿来自非编码RNA的模板，当使用随机启动时，这些模板非常丰富(29).
为了减少自互补性，引物与其互补序列之间不允许任何连续的5聚体匹配(29). 对互补链上的引物序列进行BLAST相似性搜索，要求得分<18。为了防止引物二聚体，如果引物3′末端的四个残基在其互补序列中被发现，则引物被拒绝。还评估了一对正向引物和反向引物的互补性，以防止异二聚体的形成。
用于引物选择的过滤器非常严格，这反映在99.5%的引物被拒绝这一事实上。在被拒绝的引物中，50.7%的引物过高或过低T型米值，28.7%的杂交到非目标序列，19.8%因序列自互补性而被拒绝，0.5%来自低复杂度区域，0.3%因其他特性（GC含量和末端稳定性）而被拒绝。
数据库生成和内容
我们已将引物序列存储在PrimerBank数据库中(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)以及有关引物的其他信息，如T型米、转录本上的位置和预期的扩增子大小。此外，我们通过QPCR、琼脂糖凝胶电泳、测序和BLAST分析实验验证了26 855对引物，对应27 684个小鼠转录本(30). 使用随机引物从商业通用小鼠复合总RNA制备中制备cDNA文库，其中包含来自11种不同小鼠细胞类型的一组RNA，以很好地代表大多数小鼠基因。制备的cDNA文库用作高通量验证的所有QPCR中的模板，所有反应均使用相同的PCR条件。分析QPCR扩增图和解离曲线，并通过琼脂糖凝胶分析确定是否存在预期大小的单一条带。将从这些PCR产物中获得的序列作为批次集与NCBI数据库进行BLAST分析(47). 对于成功样本的鉴定，考虑的主要参数是PCR产物序列与预期序列的比对长度、预期序列与NCBI BLASTn返回序列的匹配位置以及两个序列的一致性百分比。从琼脂糖凝胶和BLAST分析中观察到，高通量PrimerBank引物验证实验的成功率很高，根据所有验证标准，共发现17483对引物成功。参见用于从高通量实验验证过程中获得的数据。
由于没有扩增，1745个样本（6.5%）失败。其中一些被发现属于嗅觉受体、犁鼻受体、转录因子和低丰度转录物，而另一些则功能未知或为RIKEN序列。为了确定失败引物对的模板是否存在于使用的cDNA样本中，我们使用基因组DNA模板测试了这些引物(30). 从这些实验中，我们发现，这些引物对最初在大多数情况下都失败了，因为它们各自的模板在使用的DNA模板源中不存在或数量非常少，而不是因为引物设计不当。特定组织可用作已知感兴趣基因表达的cDNA模板的来源，以提高扩增成功率。此外，我们使用经过充分验证的PrimerBank引物对，即在验证程序的所有步骤中都成功的引物对来确定扩增的均匀性，并发现使用PrimerBank引物的扩增相对均匀(30).
WEB界面
搜索工具
PrimerBank数据库可以使用以下任一搜索词搜索感兴趣基因的引物：GenBank登录号、NCBI蛋白登录号、NSBI基因ID、PrimerBank-ID、NCBI-基因符号或关键字（基因描述）。搜索结果显示了引物序列和有关引物的一些信息，例如预期的扩增子大小和T型米。通过单击相应的链接，可以从PrimerBank搜索结果网页查看cDNA和扩增子序列以及实验验证数据。所有验证数据都可以从PrimerBank网站上检索，因为用户的成功或失败标准可能与我们的验证标准不同。此外，用户可以使用PrimerBank主页上的BLAST工具，找到PrimerBank数据库中包含的任何引物，以扩增其感兴趣的序列。用户还可以使用BLAST工具查询NCBI数据库，对高通量实验验证过程中产生的PCR产物的序列进行BLAST分析，该数据库可以在验证数据网页上找到。
示例搜索结果
从引物对搜索中获得的结果（小鼠β-actin引物对；PrimerBank ID:6671509a1）可以在–例如。小鼠β-actin的引物序列可以与引物信息一起查看T型米s和预期放大器大小(). 用户可以点击引物信息网页上显示的cDNA和扩增子序列链接，查看完整的cDNA序列和在此页面上突出显示的引物位置(). 为了查看实验验证数据，用户可以单击引物信息网页和cDNA和扩增子序列网页上显示的验证结果链接。在实验验证网页上，可以看到QPCR扩增图、解离曲线和琼脂糖凝胶数据(). 下面是获得的序列，用户可以滚动查看它的全部内容。测序结果下方显示了获得的BLAST结果摘要，包括获得的序列与预期序列的一致性百分比（%）、两个序列的匹配长度以及预期序列在查询序列匹配的序列总数中的匹配位置().
PrimerBank对β-actin引物的搜索结果。引物搜索功能可以在PrimerBank主页上找到。通过PrimerBank ID（6671509a1）在数据库中搜索小鼠β-actin引物对，获得的搜索结果如下所示。引物序列、长度、，T型米s、 可以看到引物在扩增子上的位置和预期的扩增子大小。
β-肌动蛋白引物的cDNA和扩增子序列。此处显示完整的cDNA和扩增子序列以及扩增子上引物的突出显示位置，可以通过点击引物信息网页上的cDNA与扩增子序列链接从PrimerBank查看（参见).
β-肌动蛋白引物的实验验证数据。所有实验验证数据都显示在这里，可以通过点击primer信息网页上的验证结果链接从PrimerBank查看（参见)以及在cDNA和扩增子序列网页上（参见). 可以看到QPCR扩增图、解离曲线和琼脂糖凝胶数据，然后是获得的序列，用户可以滚动浏览。测序结果下方可以看到获得的BLAST结果摘要。BLAST结果下方有一个BLAST工具，可用于直接BLAST根据NCBI数据库获得的序列。此外，还可以看到一个反馈表，用户可以在其中使用引物提供有关其实验数据的信息。
初级统计
用户可以单击PrimerBank主页上的“Primer Statistics”选项卡，查看数据库中当前包含的引物的一些统计信息。
协议
用于高通量引物验证程序的QPCR和逆转录协议可以在PrimerBank网站上找到，也可以在“PCR协议”选项卡下找到故障排除指南。除非需要特定协议，否则这些协议可以用于所有PrimerBank-引物对。
评论
用户可以通过点击主页上的“评论”选项卡并填写“评论”框，在PrimerBank网站或初级设计上提供评论。此外，用户可以输入有关他们对验证引物对的实验使用的信息，并在验证数据网页上的反馈表中添加任何注释。
底漆提交
用户可以点击主页上的“primer submission”标签，为人类和小鼠基因推荐自己的引物对。为了做到这一点，用户必须在第一次提交引文时提供他们的姓名、机构名称、电子邮件地址和密码（可选）。如果提交的引物符合PrimerBank标准，则将其添加到数据库中。
讨论
有大量工具和资源可用于设计各种应用的PCR引物(56–67). 此外，研究人员已经提交了包含PCR和QPCR引物的数据库，但这些引物对中只有几千对经过了实验验证(68,69). 此外，这些数据库中包含的引物并没有设计成在相同的PCR条件下工作。因此，需要验证感兴趣基因的引物，并优化PCR条件，以便使用这些引物。PrimerBank数据库包含大多数已知小鼠基因的实验验证引物（根据所有验证标准，共有17483对引物成功），所有引物在相同的PCR条件下工作。因此，PrimerBank为有兴趣验证DNA微阵列数据或高通量QPCR的研究人员提供了资源。
基金
美国国立卫生研究院基因组应用计划（拨款U01 HL66678). 开放存取收费的资金来源：马萨诸塞州总医院计算与集成生物学中心。
利益冲突声明。未声明。
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