神经元特异性Rab4效应器GRASP-1协调膜专一化和再循环内分体成熟

GRASP-1定位于神经元中Rab4阳性早期再循环内切体的一个亚区

我们检测了GRASP-1在小鼠组织和细胞系中的表达，并通过Western blot显示，GRASP-1高表达于整个中枢神经系统，包括皮层、小脑、中脑和脊髓，在原代培养的海马神经元中存在，但在非神经元组织和细胞类型中不存在，神经内分泌胰岛素瘤细胞除外(图3A). 这些结果与以前的免疫印迹和免疫组织化学分析一致[28]表明GRASP-1在整个CNS的神经元中表达，在海马中表达水平最高。小鼠脑和脊髓切片的双标记共聚焦免疫荧光显示，GRASP-1免疫反应与神经元体-树突状室的点状结构有关(图S1和未发表的数据）。这些点状结构通常对Rab4具有免疫反应性，尽管各种GRASP-1阳性结构没有标记Rab4，反之亦然(图S1).

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图3

海马神经元中GRASP-1和Rab4的克隆化。

（A） Western blot显示Rab4和GRASP-1在小鼠组织和培养细胞中的表达模式。（B–F）用抗GRASP-1抗体和内源性标记物双重标记的海马神经元的代表性图像。（B） MAP2和GRASP-1，箭头表示轴突和箭头树突。（C） MAP2和GRASP-1，箭头标记树状轴以外的GRASP-1信号。（D） PSD-95和GRASP-1。（E） Bassoon和GRASP-1，箭头表示GRASP-1在突触部位的定位15%的突触与GRASP-1共定位，而旋转红色通道图像确定的“随机”共定位为～5%。（F） 细胞体（左）和树突（右）中的Rab4和GRASP-1。箭头表示同位化区域，插图显示放大区域。B中的棒材为10µm；钢筋（C–F）为1µm。（G） 在DIV13转染GFP-Rab4并染色GRASP-1的海马神经元的细胞体图像。放大区域如插图所示；注意GRASP-1在GFP-Rab4内体的远端区域的部分定位。棒材为1µm。（H） 转染海马神经元中GFP-Rab4（绿色）和mRFP-GRASP-1（红色）的同步成像。将显示连续帧，并在合并面板中指示时间（秒）。

成熟海马神经元（体外17天以上；DIV 17）的免疫荧光标记显示，内源性GRASP-1虽然存在于轴突中，但主要定位于体干细胞隔，其标记模式以及与树突状标记物MAP2的共分布证明了这一点(图3B). GRASP-1与点状结构有关，偶尔延伸到树状轴以外（中的箭头图3C)，与突触标记PSD-95重叠（箭头位于图3D)和巴松管（箭头在图3E)并定位于β-半乳糖苷酶（β-gal）填充神经元中可见的树突棘内（未发表数据）。与免疫组化数据一致(图S1)[28]，在初级海马神经元中观察到内源性Rab4和GRASP-1的共定位(图3F). 免疫电子显微镜显示，内源性GRASP-1和Rab4定位于一个广泛的管状网络，该网络似乎来自具有再循环小管特征的内胚体(图4A). 同时对mRFP-GRASP-1和GFP-Rab4进行双色实时成像，进一步证实了GRASP-1与Rab4阳性内体相关的能力：GRASP-1在与较大GRASP-1/Rab4内体结构域对接和融合的可移动Rab4阴性囊泡和管状结构上观察到(图3H;视频S1和S2系列). 海马神经元中GFP-Rab4的过度表达增加了GRASP-1和Rab4相吻合的内胚结构的大小(图3G). 对这些结构的仔细检查表明，内源性GRASP-1定位于大Rab4阳性内体的一个亚结构域(图3G，插图），表明GRASP-1可能调节内体循环途径中的一个特定步骤。为了测试内体GRASP-1定位是否依赖于Rab4活性，用显性阴性Rab4（Rab4S22N）转染神经元。Rab4S22N的表达使GRASP-1从点状内体中重新分布，而其他内体蛋白则不受影响(图S2). 虽然Rab4S22N可能抑制其效应物GRASP-1的膜定位，但我们不能排除GRASP1的整体水平也受到Rab4S22N的影响。这些数据共同表明GRASP-2在神经元中选择性表达，其中部分定位于树突中Rab4阳性内体，并存在于突触后结构附近的脊椎中。

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图4

内源性GRASP-1、Rab4和突触合蛋白13在回收内体小管上一致。

海马神经元的免疫金EM用10 nm蛋白A金标记Rab4，用15 nm蛋白A黄金标记GRASP-1（A），用10 nm蛋白质A金标记syntaxin 13，用15纳米蛋白A金标识GRASP-1（B），用10nm蛋白A金色标记syntasin 13，并用15 nm蛋白质A黄金标记Rab四（C），5 nm蛋白金用于合成蛋白13，10 nm蛋白A金用于rab4（D）。箭头表示GRASP-1、syntaxin 13和Rab4定位的管状内体膜。EE表示早期内体，标尺为100 nm。

树突状脊柱形态需要GRASP-1

为了探讨GRASP-1的功能，我们使用RNA干扰来敲低成熟海马神经元中GRASP-1表达。我们发现两个独立的GRASP-1-shRNA序列（#2和#5）特异性抑制海马神经元中GRASP-1的表达(图S3). GRASP-1抗体检测到GRASP-1转染神经元的细胞体和树突中GRASP-1染色强度降低了约80%(图S3B)而其他抗体染色，如MAP2，则不受影响（未公布的数据）。两种GRASP-1-shRNAs结构都产生了类似的表型效应。

鉴于先前的观察结果，Rab4和Rab11的显性阴性形式抑制了内体再循环，从而改变了树突棘的形态[2]，我们首先研究了GRASP-1敲除对树突棘的影响。在共同表达GRASP-1-shRNA和β-gal的神经元中，我们观察到突起总数显著减少(图5A). 剩余的树突状突起根据脊柱头部宽度与突起长度的比值分为丝状突起和蘑菇状棘。定量分析表明，GRASP-1的敲除降低了蘑菇头棘的数量(图5B、C). 表达GRASP-1*（对GRASP-1-shRNA#2敲除有抵抗力）的神经元在很大程度上逆转了脊柱表型(图5A-C). 通过表达显性阴性形式的Rab11（Rab11S25N）和Rab4（Rab4S22N），观察到类似的脊椎表型(图5B、C). 接下来，我们测试了GRASP-1敲除是否可以通过甘氨酸刺激抑制LTP诱导的脊柱生长，甘氨酸刺激是一种用于诱导培养海马神经元化学LTP的方案[2]在对照神经元中，甘氨酸治疗诱导了新的脊椎形成和先前存在的脊椎生长，而在缺乏GRASP-1的情况下，脊椎生长受阻(图5D、E). 总之，这些数据表明，GRASP-1在再循环内体途径中发挥着重要作用，以维持树突棘形态并调节LTP诱导的棘生长。

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图5

维护树突棘需要GRASP-1。

（A） 用β-半乳糖苷酶（标记树突）、pSuper、pSuper-GRASP1-shRNA#2、GRASP-1-shRNA#2和GFP-GRASP-1*、Rab4S22N或Rab11S25N在DIV13共转染海马神经元树突4 d的代表性高倍图像，并用抗β-半乳糖苷酶标记。（B） 定量转染海马神经元每10µm树突突起的数量，如（A）所示。（C） 转染海马神经元的脊髓百分比如（A）所示。（D） 用甘氨酸刺激表达GFP（标记树突）和pSuper或pSuper-GRASP1-shRNA#2的神经元（200 mM，3分钟），然后在甘氨酸刺激后30分钟以上成像。箭头表示脊柱形成。闭合箭头和开放箭头分别表示脊椎生长和稳定突出。（E） 甘氨酸刺激后突起形成（顶部）和脊柱生长（底部）的定量。N、 在指定时间内，每10µm的树枝状突起数量；N个₀，施用甘氨酸前每10µm树突状突起的平均数量。脊椎生长被探测为每10µm脊椎宽度总和的变化，包括新脊椎的添加和已有脊椎的生长。GRASP-1-shRNA#2（底部）阻止了甘氨酸刺激的脊椎生长。（F） 用myc-GRASP-1（红色）和GFP-TfR在DIV13共转染4d的海马神经元树突的高倍图像。（G，H）在指定位置含有TfR-GFP阳性内体的棘的百分比。如（H）所示，在DIV13处用β-半乳糖苷酶（标记树突）和GFP-TfR（标记内体）以及pSuper控制载体或pSuper-GRASP-1-shRNA#2共同转染海马神经元4天。闭合箭头和开放箭头分别表示脊柱头部带有和不带有GFP-TfR标记的内体的突出物。误差条指示S.E.M**第页<0.005. ***第页<0.0005. 棒材为1µm。

GRASP-1调节循环内泌体分布

为了直接检测GRASP-1基因敲除对脊椎中再循环内体分布的影响，我们分析了其与GFP标记转铁蛋白受体（GFP-TfR）的定位，GFP-Tf R是一种稳定存在于再循环内体中的原型再循环货物[2]如预期，GRASP-1和GFP-TfR在树枝晶内显示出强烈的共定位(图5F). TfR-GFP标记的内体存在于脊椎基底部的树突状轴（a）、脊柱颈（b）和脊柱头部（c）(图5G). 在转染GRASP-1-shRNA的神经元中，GFP-TfR标记的内体大量存在于脊椎底部的树突状轴中，但从脊椎中耗尽(图5H). 定量分析显示，在对照神经元中，约50%的脊髓在其颈部和头部（b、c和b+c）有TfR-GFP标记的内体，而在缺乏GRASP-1的情况下，仅有约10%的脊髓含有再循环内体(图5G). 这些数据表明，GRASP-1调节再循环内体定位到树突棘，很可能解释了观察到的GRASP-1敲除棘表型。

GRASP-1规范AMPAR回收

为了进一步探讨GRASP-1在内胚体再循环中的功能重要性，我们研究了GRASP-1敲除对AMPAR胞内转运的影响。首先，我们使用基于荧光的抗体喂养试验分析了GRASP-1与内化AMPAR的共定位[10]表达细胞外HA标记的GluR1或GluR2亚单位的活海马神经元用HA抗体进行表面标记，用AMPA（100µM，在50µM APV（一种选择性n-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂）的存在下刺激，固定，渗透，并对内化的GluR亚单位和内源性GRASP-1进行染色。AMPA刺激后2分钟，仅有～5%的内源性HA-GluR1或HA-GluR2与GRASP-1共定位(图S4A，B）。刺激10分钟后，内化GluR亚基与GRASP-1的共定位增加到～30%(图6A,图S4A，B），这与内化AMPAR与Rab4共定位的动力学一致[9].

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图6

GRASP-1的敲除减少了AMPAR的回收。

（A） AMPA刺激10分钟后，海马神经元胞体和树突中标记为GRASP-1（红色）的表面HA-GluR2（蓝色）和内化HA-GluR2（绿色）的代表性融合图像。棒材为10µm。（B，C）定量对照pSuper载体或GRASP-1-shRNA#2转染神经元中内源性GluR1（B）和GluR2（C）的表面荧光强度。细胞未经处理（0分钟）或用AMPA刺激指定时间。直方图显示表面GluR亚单位染色的荧光强度相对于GFP转染的对照神经元在基础水平的荧光强度。n个 = 每组20个细胞。（D，E）内源性表面GluR1（D）和GluR2（E）染色海马神经元的代表性图像。DIV13的海马神经元与GFP和pSuper控制载体或GRASP-1-shRNA#2共转染。在DIV17，神经元被固定（0分钟，无处理）或在50µM APV存在下用100µM AMPA刺激2分钟，并在固定前进一步孵育总共10或60分钟。免疫荧光标记显示内源性表面GluR1（D）或GluR2（E），而不使用特异性细胞外AMPAR抗体渗透。棒材为20µm。（F） 转染GFP、HA-GluR2和pSuper控制载体或GRASP-1-shRNA#2的神经元用抗HA抗体进行活染色，用AMPA/APV刺激2分钟，脱酸，并在条件培养基中培养45分钟。依次标记回收的HA-GluR2（蓝色）和内化的HA-G卢R2（红色）。棒材为1µm。（G） 量化回收与内化HA-GluR2的比率，并将其归一化为未刺激的野生型控制神经元（HA-GluR2回收指数），如（F）所示。误差条表示S.E.M*第页<0.05. **第页<0.005. ***第页<0.0005.

接下来，我们用GFP和对照载体转染海马神经元，或用GRASP-1-shRNA转染GFP，并通过表面GluR1和GluR2的免疫标记分析AMPA刺激后内源性AMPAR的内化和再循环。在稳定状态下，GRASP-1击倒神经元显示GluR1的表面标记轻度但显著减少（～15%）(图6B、D)和GluR2(图6C、E)与对照组相比。刺激10分钟后，在对照组和表达GRASP-1 shRNA的神经元中，GluR1和GluR2在神经元表面减少，反映了受体内部化(图6B、C). 在60分钟时，与对照组相比，GRASP-1 shRNA对GluR1和GluR2的重现性造成了严重损害（约50%）(图6B-E). 一贯地，在一项方案中，表面HA-GluR2受体在标记后被剥离[33]与对照神经元相比，表达GRASP-1-shRNA的神经元中HA-GluR2返回表面的循环显著减少(图6F). AMPA刺激8分钟后，细胞内HA-GluR2水平无差异(图S4C，D）。然而，我们观察到，在GRASP-1击倒神经元中，AMPA治疗后LAMP-1阳性溶酶体隔室中存在更多的细胞内HA-GluR2(图S4E，F）。这些数据表明，GRASP-1对活性诱导的AMPAR回收很重要。

GRASP-1调节突触可塑性

接下来，我们研究了GRASP-1在兴奋性传递和LTP中的作用，并记录了海马脑片器官型培养中CA1锥体神经元的兴奋性突触反应。同时从转染的神经元（通过共转染GFP鉴定）和相邻的未转染神经元获得记录。控制荧光素酶-shRNA和GRASP-1-shRNA表达细胞对基础AMPAR介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）（GRASP-1 shRNA#5:0.93±0.09倍，相对于未转染细胞，荧光素素酶shRNA:1.21±0.18）和NMDAR-EPCs（GRASP-1 shRNA#5:0.86±0.09，荧光素酶shRNA1.03±0.32）均无影响(图7A、B). 通过对突触可塑性的测试，GRASP-1介导的AMPAR在切片中循环的重要性变得更加明显。诱导LTP后，表达GRASP-1 shRNA的细胞在LTP诱导方案实施后20分钟内诱导了与相邻未转染细胞相当的增强水平。然而，随后，GRASP-1 shRNA转染细胞的反应开始下降，最终在LTP诱导后30分钟恢复到基线水平(图7C，未转染神经元：LTP诱导后29–30分钟EPSC增强1.75±0.18倍，转染神经元1.17±0.10）。相反，对照荧光素酶shRNA转染，邻近未转染神经元表达稳定的LTP，持续至少30分钟(图7D，未转染神经元：EPSC增强2.04±0.16倍，转染神经元2.45±0.44）。这些数据表明，GRASP-1对突触可塑性很重要，尤其是对前20分钟后的LTP阶段很重要。结果表明，从循环内体递送AMPAR可能对LTP的后期阶段很重要。

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图7

GRASP-1基因敲除对海马脑片突触传递和可塑性的影响。

从转染荧光素酶-shRNA（A，对照）和GRASP-1-shRNA#5（B）的神经元中测量（A，B）AMPA和NMDA受体介导的兴奋性突触反应。顶部，样本迹线由AMPAR（向下）和NMDAR（向上）介导，来自成对shRNA转染（荧光素酶或GRASP-1-shRNA#5）和相邻未转染（Untrans）神经元。痕迹中的刺激物被截断。底部，shRNA转染和相邻未转染细胞的EPSC振幅（AMPA-R-EPSC和NMDA-R-EPSC）的汇总图。细胞对数：荧光素酶-shRNA，18和10；AMPA和NMDAR-EPSC的GRASP-1-shRNA#5、15和8。NS，不显著。误差条表明，通过将去极化与0 mV配对，2 Hz刺激100秒，在表达shRNAs的细胞和相邻未转染细胞中诱导S.E.M.（C，D）LTP。左，来自未转染和荧光素酶或GRASP-1 shRNA转染神经元的样本AMPAR-EPSC痕迹。之前（黑色）和之后（灰色）的电流叠加。没错，在LTP诱导后AMPA-EPSCs的时间进程（LTP诱导于t吨 = 0）。获得样品轨迹的时间点由1和2表示。细胞对数：荧光素酶-shRNA，6；GRASP-1-shRNA#5、8*第页<0.05.

GRASP-1从EEA1/Neep21内膜分离Rab4

为了更准确地定义GRASP-1在内胚体系统中的功能，我们首先检查了外源性GRASP-1相对于Hela细胞早期内胚体标记蛋白的定位。我们发现几乎没有与GFP-Rab5共分布，但与GFP-Rab4广泛共定位(图S5). 转染的海马神经元也获得了同样的结果，其中80%以上的Rab4结构在树突和细胞体中都含有GRASP-1，而Rab5几乎没有重叠(图8A、B,6). 与该观察结果一致，Rab5结构域标记EEA1和内源性GRASP-1显示出互斥分布(图8D)而细胞体和树突中约40%的EEA1结构与GFP-Rab4共定位(图8C、E，顶行）。这些结果表明，神经元中的Rab4位于近端EEA1和远端GRASP-1内体结构域之间。

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图8

GRASP-1将Rab4从EEA1阳性的内胚体膜中分离出来。

（A） 用myc-GRASP-1（红色）和GFP-Rab4（上排）或GFP-Rap5（下排）在DIV13共转染4天的海马神经元树突的代表性图像。（B） 如（A）所示，神经元中myc-GRASP-1和Rab蛋白的共定位百分比。（C） 如（E）所示，细胞体和树突中Rab4和EEA1共定位的百分比。误差条指示S.E.M***第页<0.0005. （D） 抗GRASP-1（红色）和抗EEA1（绿色）抗体双重标记的海马神经元树突的代表性图像。（E） 用GFP-Rab4和pSuper控制载体myc-GRASP-1或pSuper-GRASP1-shRNA#2在DIV13共转染4天的海马神经元树突的代表性图像，并用抗EEA1（红色）和抗myc（蓝色）抗体标记。棒材为1µm。

为了确定内体结构域组织是否受GRASP-1的调控，我们敲除了GRASP-1表达，然后分析了EEA1和GFP-Rab4的共同分布。与对照神经元相比，转染GRASP-1-shRNA的海马神经元共定位EEA1和GFP-Rab4（～80%）显著增加（～40%）(图8C、E). 相反，在转染myc-GRASP-1的神经元中，EEA1和GFP-Rab4之间的重叠显著减少（～20%）(图8C、E). 在Hela细胞中也得到了类似的结果，其中myc-GRASP-1强烈减少了GFP-Rab4和EEA1之间的共定位，而GFP-Rap5和EEA1的共分布不受影响(图S7). 为了证实我们的结果，我们测试了GRASP-1对其他早期内体标记定位的影响，如Neep21[13]内源性Neep21染色与Rab5和EEA1（～80%）强一致，与Rab4（～40%）弱一致(图S8和未发表的数据）。然而，在转染myc-GRASP-1的神经元中，Neep21和GFP-Rab4之间的重叠显著减少（～20%），这与EEA1分布的影响一致(图S8D). 相反，GRASP-1-shRNA增强Neep21/Rab4共定位(图S8D). 这些结果表明，GRASP-1能够将Rab4从EEA1/Neep21内体结构域中分离出来。

GRASP-1调节Rab4和Rab11结构域之间的耦合

接下来，我们确定了GRASP-1在Hela细胞中相对于晚期和再循环内体标记物的定位(图S6)和海马神经元(图9A). 我们发现GRASP-1与Rab7内体结构域几乎没有共定位，而GRASP-1标记与Rab11阳性区室广泛一致（～70%）(图9A、C,S6系列). 这些数据强烈表明，GRASP-1定位于内体再循环途径的远端，可能用于耦合Rab4和Rab11结构域。mRFP-GRASP-1和GFP-Rab11的同时双色实时成像证实了这一观察结果：GRASP-1与Rab11在更大的内吞体结构域上共定位，而动态Rab11阳性结构分离为不同的管状或囊泡结构(图9B;视频S3和S4系列). 大多数活动的Rab11阳性小管仅与GRASP-1阳性内体短暂重叠(视频S3和S4系列). Rab4、Rab11和GRASP-1主要定位于神经元细胞体和树突中这些大的内胚体结构上的重叠区域(图9E). 我们通过在GRASP-1被敲除以及myc-GRASP-1过度表达后确定Rab4/Rab11共分布，进一步探讨了GRASP-1在偶联Rab4和Rab11结构域中的可能作用。在没有GRASP-1的情况下，我们观察到与对照神经元（30%的Rab4/Rab11共定位）相比，Rab4/Rab11的共定位显著降低（15%），而转染myc-GRASP-1显著增强了Rab4和Rab11结构域的结合（80%的Rab4/Rab11共同定位）(图9D、F). 重要的是，在myc-GRASP-1转染后观察到EEA1/Rab4和Neep21/Rab4结构域偶联减少(图8C、E)与Rab4/Rab11结构域耦合增加相一致，而GRASP-1基因敲除后则相反。因此，这些数据表明，GRASP-1是通过Rab4-和Rab11-阳性内胚体结构域的偶联，对内胚体循环膜成熟的正向调节。

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图9

GRASP-1将Rab4和Rab11域配对。

（A） 用myc-GRASP-1和GFP标记的Rab7或Rab11在DIV13共转染4天的海马神经元树突的代表性图像，并用抗myc（红色）标记。棒材为1µm。（B） 转染海马神经元中GFP-Rab11（绿色）和mRFP-GRASP-1（红色）的同步成像。将显示连续帧，并在合并面板中指示时间（秒）。（C） 如（A）所示，神经元中myc-GRASP-1和Rab蛋白的共定位百分比。误差条指示S.E.M***第页<0.0005. （D） 如（F）所示，在用GFP-Rab4和HA-Rab11与myc-GRASP-1、pSuper-GRASP-shRNA#2或pSuper-GRASP-shRNA#2和GFP-GRASP-1*共转染的神经元中，Rab4和Rab11结构域之间的共定位百分比。（E） 在DIV13三重转染GFP-Rab4、HA-Rab11和myc-GRASP-1并用抗HA（红色）或抗myc（蓝色）抗体标记4天的海马神经元细胞体图像。棒材为10µm。（F） 用GFP-Rab4、HA-Rab11和pSuper控制载体myc-GRASP-1或pSuper-GRASP1-shRNA#2在DIV13共转染4天的海马神经元树突的代表性图像，并用抗HA（红色）或抗myc（插入）抗体标记。棒材为1µm。

GRASP-1对循环内泌体成熟的调控

每个细胞器都携带自己的Rabs，以确保细胞内膜转运的特异性。大量实例表明，Rab GTPases及其效应器可以赋予膜交通方向性，并耦合不同的交通步骤[37]在这里，我们表明GRASP-1是分子机制的一个新组成部分，它调节神经元内体贩运的方向性。首先，GRASP-1是一种新的Rab4效应器，并与其活性GTP结合状态特异性结合。其次，GRASP-1的敲除分离了Rab4和Rab11结构域，并将Rab4移动到EEA1/Neep21阳性的早期内体结构中。因此，GRASP-1的敲除模拟了显性负性Rab4和Rab11对树突状棘形态的影响。第三，GRASP-1过度表达强烈增加了神经元和Hela细胞中Rab4/Rab11的共定位。我们提出了一个模型，其中GRASP-1协调再循环内体成熟(图12). 术语再循环内体成熟用于将其与其他内胚体出口途径区分开来，例如降解性多泡体/内胚体成熟途径、甘露糖6-磷酸受体到反式高尔基体网络的检索途径或黑色素生成酶到黑色素小体的途径[38].

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图12

GRASP-1在内体再循环中的作用模型。

内切体可被视为Rab4、Rab5和Rab11结构域的镶嵌分布，通过效应蛋白和SNARE动态相互作用。Rab5结构域允许进入早期/分选内体，而Rab4和Rab11结构域包含分选和再循环膜和受体回到质膜所必需的机械。（A） GRASP-1与Rab4和syntaxin 13结合，并将Rab4与Rab11循环内体偶联。GRASP-1和t-SNARE syntaxin 13之间形成的复合物可能介导Rab4和Rab11内体之间的融合。（B） GRASP-1的缺失会干扰再循环步骤中复合物的形成，导致早期内体中的货物堆积，受体表达受损，脊椎形态改变。（C） GRASP-1的过度表达导致syntaxin 13的招募，并强烈耦合Rab4和Rab11结构域，导致再循环内体中内化受体的积累。与观察到的AMPAR簇减少一致[28]，GRASP-1的Caspase-3裂解可能会将N端Rab4结构域从C端突触蛋白13结合位点分离出来，并破坏Rab4和Rab11结构域之间的偶联。

GRASP-1如何结合特定Rab域？沿着内体通路，发现了连接早期内体上近端Rab5和Rab4结构域的双价效应器[25]。由于GRASP-1直接与Rab4结合，但不与Rab11结合，因此需要额外的因素。我们发现GRASP-1与内胚体SNARE蛋白syntaxin 13结合。GRASP-1的过表达将突触结合蛋白13从Neep21阳性结构中分离出来，并将突触结合蛋白13强募集到Rab4阳性膜中。先前的研究表明，syntaxin 13参与了内体结构域的再循环[13],[35]富含Rab11内体组分[34]Syntaxin 13还与Syntaxin 6一起在体外融合早期内体中发挥作用[39],[40]我们发现突变体syntaxin 13分离出Rab4/GRASP-1和Rab11阳性内体结构域，表明syntaxin13在GRASP-1偶联Rab4和Rab11-结构域中具有新的功能。因为syntaxin 13是SNARE核心复合物的组成部分[35]并参与膜融合[36]很容易推测GRASP-1和syntaxin 13之间的结合激活了与Rab11阳性膜连接所需的融合机制。还需要进一步研究来确定GRASP-1与syntaxin 13的结合与syntasin 13的SNARE功能之间的精确功能关系。

通过GRASP-1的N末端结合Rab4和通过C末端结合syntaxin 13的特性支持了膜结合活性Rab4在内体上保留或招募GRASP-1并与syntaxin13形成复合物的模型。然后，这种相互作用序列可以在结构和功能上将Rab4连接到Rab11膜域(图12). 随后在Rab4定义的膜域上招募其他因子可以加强与Rab11的相互作用。据推测，作用于上游Rab的GTPase激活蛋白（GAP）可能是下游Rab的效应器[41]这些Rab级联和转化可能作为正反馈回路，将活化的Rab4特异性地浓缩在Rab11阳性内体上。半胱氨酸蛋白酶-3裂解对GRASP-1的额外调节[28]能够将N端Rab4结合域与C端突触蛋白13结合位点分离，可能破坏Rab4和Rab11内体之间的相互作用(图12).

组织提取物的制备

对P30小鼠的大脑皮层、小脑、中脑、脊髓、肾脏、肝脏和脾脏进行组织Western blots分析。冷冻组织样品和培养细胞在PBS/1%Triton-×100中均质，然后添加等体积的2×SDS样品缓冲液，并煮沸样品。使用BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce）测量蛋白质浓度，并在每条通道中加载20µg蛋白质，以进行后续的Western blot分析。

GST-Rab下拉试验

猪脑细胞液的制备，GST-Rab融合蛋白的纯化，拉下试验中Rab4GTP相互作用蛋白的分离以及与³⁵S标记的GRASP-1按说明进行[52],[61]为了确定GRASP-1上的Rab4结合区域，我们在COS-7细胞中表达pRK5-myc GRASP-1或pGW1-GFP-GRASP-1截断。细胞在冰镇PBS中清洗，并在20 mM Hepes中溶解，pH 7.4，100 mM NaCl，5 mM MgCl₂（裂解缓冲液），含有0.5%NP-40、5µg/ml亮氨酸蛋白酶、10µg/ml抑肽酶、1µg/m1胃蛋白酶抑制素、1 mM PMSF、20µM GMP-PNP和1 mM DTT。将洗涤剂裂解物在4℃下摇晃20 min，在冷却的Eppendorf离心机中以最大速度离心10 min，用裂解缓冲液稀释至0.2%NP-40，并用Rab4-GMP-PNP珠在4℃培养2 h。用含有0.2%NP-40、20µM GMP-PNP和1 mM DTT的裂解缓冲液洗涤珠子四次。结合蛋白在莱姆利样品缓冲液中洗脱，并通过蛋白质印迹和抗myc抗体检测进行分析。为了确定Rab4、GRASP-1和syntaxin 13能否形成三元复合物，我们用pGW1-myc-syntaxin13转染COS-7细胞，转染时分别加入和不加入pGW1-GFP-GRASP-1。在20 mM Na Hepes（pH 7.5）、100 mM NaCl、1%TX-100中溶解细胞，并用GST-Rab4或GST珠培养清洁剂裂解液。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，用抗GFP和myc表位标签的单克隆抗体通过Western blot检测结合蛋白。

GST-Syntaxins结合分析

缺乏跨膜结构域的GST-syntaxin融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3），固定在GSH珠上，用于与用GFP-GRASP-1（594–837）转染的COS-7细胞的裂解物的结合测定。GST-syntaxin13ΔTM与³⁵如前所述，在耦合的体外转录-翻译反应中产生S标记的GRASP-1[61]为了在GRASP-1上定位syntaxin 13结合域，我们在COS-7细胞中表达了C末端pGW1-GFP-GRASP-1结构。用0.5 mCi/ml对细胞进行代谢标记30分钟³⁵然后对S-蛋氨酸/Pro-Mix（Perkin Elmer）和洗涤剂裂解物进行GST-syntaxin13ΔTM上的GST下拉分析，如上所述。将小球在0.1 ml 1%SDS/PBS中煮沸8 min，释放结合蛋白，用兔GFP抗体免疫沉淀GFP标记的GRASP-1截短片段，并像以前一样通过磷光成像分析[62].

质谱法

将洗脱液在莱姆利样品缓冲液中煮沸，在7.5%的SDS-PAA凝胶上分离，并进行银染。用改良胰蛋白酶（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）在50 mM碳酸氢铵中切除感兴趣的条带并在凝胶内消化。使用配备Z喷雾源并与毛细管色谱系统在线耦合的Q-ToF混合质谱仪（Micromass，Waters）通过LC/MS/MS分析肽混合物。使用Famos自动采样器（LC包装）以3µl/min的速度将肽混合物输送至系统，并将其捕获在AquaTM C18RP柱上（Phenomenex；柱尺寸1 cm×100µm i.d.，内部包装）。然后将样品分馏成C₁₈反相毛细管柱（PepMap，LC填料；柱尺寸25 cm×75µm i.d.），流速150–200 nl/min，使用乙腈线性梯度。质谱仪以数据相关的MS/MS模式设置，其中全扫描光谱(米/z（z）采集范围为400至1600 Da/e），随后是串联质谱(米/z（z）采集范围为100至1800 Da/e）。前体离子被选为前一次扫描的最强峰值。根据前体离子的质量和电荷施加合适的碰撞能量。制造商提供的ProteinLynx软件用于分析原始MS和MS/MS光谱，并生成峰值列表，该列表被引入MASCOT MS/MS离子搜索软件，用于蛋白质鉴定。

免疫沉淀

将COS-7细胞与pEF-FLAG-Rab4或pEF-FLA G-Rab5和GRASP-1构建物共转染，并按所述进行联合免疫沉淀[47]用FLAG肽洗脱免疫复合物，并用抗GFP的小鼠单克隆抗体和抗FLAG的兔抗体进行Western blot分析。为了研究GRASP-1和syntaxin 13之间的相互作用，COS-7细胞被pGW1-GFP-GRASP-1、pGW1-myc-syntaxin1、pGW1-myc-synstaxin2或pGW1-myc-syntasin13转染。为了确定GRASP-1与syntaxin13结合的区域，我们用pGW1-myc-GRASP-1、pGW1-myc-GRASP-1（1-695）或pGW1-ymc-GRASP-1（695-837）和pGW1-GFP-syntaxin-13转染COS-7细胞。在20 mM Hepes（pH 7.4）、200 mM NaCl、1%NP-40和蛋白酶抑制剂中溶解细胞。将洗涤剂裂解物通过20×27号针头，并在冷却的Eppendorf离心机中以最大速度离心。上清液与兔GFP抗体涂层珠在4°C下孵育2 h。用20 mM Hepes（pH 7.4）、200 mM NaCl、1%NP-40洗涤四次珠子，并通过加热5分钟以还原Laemmli样品缓冲液洗脱免疫复合物。洗脱液用SDS-PAGE分离，用抗myc单克隆抗体进行Western blot分析。

体外GEF分析

GST-Rab4、H-ras（1-166）、GST-GRASP-1（1-594）和GST-cdc25（974-1260）在大肠杆菌CK600K型。细菌在37°C下培养至OD₆₀₀为0.8。将IPTG加入1mM中，并将细菌在室温下孵育过夜。将细胞重新悬浮在50 mM Tris HCl（pH 7.5）、50 mM NaCl、5%甘油、5 mM DTE和5 mM MgCl中₂并通过超声波溶解。通过30000 g离心去除不溶物质，如果是GST融合蛋白，则将上清液装载在20 ml GSH柱上（法玛西亚）。用5体积50 mM Tris HCl（pH 7.5）、400 mM NaCl、5%甘油、5 mM MgCl清洗柱₂，5 mM DTE和2体积50 mM Tris HCl pH 7.5，50 mM NaCl，2.5%甘油10 mM CaCl₂，5 mM氯化镁₂和5 mM DTE（缓冲器T）。在柱上的缓冲液T中用80单位凝血酶（Serva）裂解蛋白质，并用缓冲液T洗脱。使用Millipore浓缩装置浓缩含蛋白质的部分。通过在Superdex 75（16/60）柱（Pharmacia）上进行凝胶过滤实现进一步纯化，并与50 mM Tris HCl pH 7.5、50 mM NaCl、2.5%甘油、5 mM MgCl平衡₂和5 mM DTE。如rap所述，GTPase被2′-（3′）-O-（N-甲基蒽酰）-鸟苷二磷酸（mantGDP）负载[55]按照说明进行核苷酸交换反应[55]简言之，将200 nM mantGDP负载的GTPase在25°C下在50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、50 mM NaCl、5 mM MgCl中孵育₂、5 mM DTE和5%甘油，前提是存在100倍的GDP摩尔过剩。如图所示，添加了交换因子。在Cary Eclipse荧光光谱仪（Varian）中测量荧光强度随时间变化，激发波长为340 nm，发射波长为460 nm。

体内GEF分析

用pMT2HA-Hras和pMT2HA rasGRP、pGW1-myc GRASP-1或pGW1-myc转染COS-7细胞。将表达HA-ras的细胞与10 ng/ml EGF孵育，并将表达HA-ras和HA-rasGRP的细胞与或不表达10µM Phorbol 12-Myristate 13-Aceate（PMA）孵育。5分钟后，在100 mM NaCl、1%NP40和20 mM Hepes pH 7.5中溶解细胞。用含有Raf-1 ras结合域的GSH珠培养清除的裂解产物3小时[63].在裂解缓冲液中清洗珠。用单克隆HA和myc抗体通过Western blot分别测定结合HAras-GTP和HA-Hras、HA-rasGRP和myc-GRASP-1的表达水平。

培养细胞和转染

Hela细胞和COS-7细胞在含有10%胎牛血清、抗生素和2 mM谷氨酰胺的DMEM中生长。如前所述，在Hela细胞中进行了转铁蛋白（Tf）摄取实验[52]INS1细胞在RPMI 1640中生长，添加相同的添加剂以及0.2µM丙酮酸钠和50µMβ-巯基乙醇。使用FuGENE6（Roche）或Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞，并在16–24小时后用于实验。将siRNAs（最终浓度100 nM）转染INS1细胞中的Lipofectamine 2000。3d后，裂解细胞，用Western blot检测内源性GRASP-1的表达水平。

初级海马神经元培养、转染和免疫组织化学

从胚胎第18天（E18）大鼠大脑中制备初级海马培养物[64]细胞被镀在涂有聚赖氨酸（30µg/ml）和层粘连蛋白（2µg/ml）的盖玻片上，密度为75000/孔。海马培养物在补充有B27、0.5 mM谷氨酰胺、12.5µM谷氨酸和青霉素/链霉素的神经基底培养基（NB）中生长。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染海马神经元。简单地说，将DNA（3.6µg/孔）与3µl Lipofectamine 2000混合在200µl NB中，孵育30分钟，然后将其添加到37°C、5%CO的NB中的神经元中₂持续45分钟。然后，用NB清洗神经元，并将其转移到37°C、5%CO的原始培养基中₂持续2-4天。

对于免疫组织化学，神经元在−20°C下用冰冷的100%甲醇/1mM EGTA固定5分钟，然后在室温下用4%甲醛/4%蔗糖的磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定5分钟。固定后，在PBS中在室温下清洗细胞三次30分钟，并在4°C的GDB缓冲液（0.2%BSA，0.8 M NaCl，0.5%Triton X-100，30 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）中与一级抗体孵育过夜。然后在室温下在PBS中清洗神经元三次，持续30分钟，并在室温下与GDB中Alexa-conjugated二级抗体孵育2小时，在PBS内清洗三次，保持30分钟。使用Vectashide安装介质安装载玻片（载体实验室）。共聚焦图像是使用蔡司LSM 510共聚焦激光扫描显微镜（40×或63×油物镜）获得的。

AMPA受体的表面和细胞内染色

内源性AMPAR的表面染色如所述[10],[43]将海马神经元与10µg/ml兔抗GluR1（Calbiochem（1∶8））和小鼠抗GluR2（Zymed（1∶80））N端抗体在37°C下“活”孵育15分钟。在预热的DMEM中短暂洗涤后，将神经元返回条件培养基（用于对照孵育）或用100μM AMPA和50μM APV或50μM NMDA刺激2分钟，在DMEM中洗涤，返回条件培养基并培养给定时间。用4%甲醛/4%蔗糖将神经元固定在PBS中5min，然后在PBS内三次洗涤（室温下30min），并在无洗涤剂（0.2%BSA，0.8M NaCl，30mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）的GDB缓冲液中与Alexa488（1∶400）或Alexa568（1比400）结合的二级抗体孵育在4°C下过夜，然后在PBS中再清洗三次（室温下30分钟）。

按照所述进行基于荧光的AMPAR内化分析[10]将盖玻片在37°C条件培养基中培养10分钟，用10µg/ml小鼠抗HA抗体（12CA5，Roche）“活”标记转染HA标记的GluR2亚单位的海马神经元。在预加热的DMEM中进行短暂清洗后，将神经元返回条件培养基（用于对照培养）或用100µM AMPA和50µM APV（选择性NMDA受体拮抗剂)或50µM NMDA，返回条件培养基并培养给定时间。在室温下，将神经元固定在4%甲醛/4%蔗糖中8分钟，并用Alexa633偶联二级抗体观察表面剩余受体。在甲醇（−20°C）中渗透细胞2分钟后，用Alexa488-结合二级抗体检测内部受体。为了确定共定位，在4°C的温度下，用不含洗涤剂的GDB中的抗GRASP-1抗体对神经元进行过夜免疫染色，并在室温下用Alexa568-共轭二级抗体孵育2小时。

AMPAR回收分析按所述进行[33]如上文所示，对表面HA-GluR2进行活染色后，清洗神经元并将其返回条件培养基（用于对照培养）或用100µM AMPA和50µM APV刺激2分钟。剩余的表面抗-HA抗体通过冰上剥离缓冲液（0.5 M NaCl/0.2 M乙酸）剥离4 min，并用冷TBS（Tris-buffered生理盐水）进行广泛清洗，然后在37°C下返回调节介质中45 min进行循环。回收后，将神经元固定在4%甲醛/4%蔗糖中，并用Alexa633结合二级抗体检测回收到表面的HA-GluR2。神经元被渗透，内部HA-GluR2用Alexa568-共轭二级抗体检测。

免疫组织化学和共聚焦免疫荧光

用冷冻切片机在40µm处切割小鼠脊髓。采用双标记免疫荧光技术对切片进行游离漂浮处理[65]抗体在含有1%正常马血清和0.2%Triton X-100的Tris-Buffered-Saline（TBS，pH7.6）中稀释。免疫荧光染色切片用Zeiss LSM 510共焦激光扫描显微镜进行分析。

时间间隔活细胞成像

在成像过程中，神经元被保存在37°C的标准培养基中，并置于含有5%CO2的密闭室中（Tokai Hit；INUG2-ZILCS-H2）。为了可视化神经元中的mRFP-GRASP-1和GFP-Rab4或mRFP-GRASP-1和GFP-Rab11，在配备尼康TIRF臂、CFI Apo TIRF 100×1.49 N.a.油标（尼康）、，Coolsnap相机（Roper Scientific），由MetaMorph 7.1软件（Molecular Devices）控制。为了激发，氩激光器（光谱物理激光器）的488 nm激光线和561 nm激光（光谱物理）与ETGFP/mCherry滤光片立方体（Chroma）结合使用。带有GFP和Cherry发射滤光片（均为Chroma）并与激光发射同步的滤光片轮（Sutter仪器）交替将相机暴露在GFP或Cherry辐射下。对于甘氨酸处理，同样的显微镜使用水银灯进行常规广角照明。甘氨酸治疗按照[2]使用MetaMorph、Adobe Photoshop或LabVIEW（National Instruments）软件对活细胞图像进行处理和分析。

图像分析和量化

在显微镜的最大分辨率（1024×1024像素）下，通过顺序采集设置获得转染神经元的共聚焦图像。每个图像是一个由6-8个图像组成的z系列，每个图像平均2次，从上到下覆盖整个感兴趣区域。使用最大投影将生成的z堆栈“展平”为单个图像。图像没有进一步处理，质量与原始单个平面类似。比较荧光强度时，所有扫描的共焦设置保持不变。使用MetaMorph软件（Universal Imaging Corporation）进行形态分析、量化和共定位。

免疫电镜

将海马神经元（DIV>21）固定在多聚甲醛或多聚甲醛/戊二醛混合物中，并在超薄冰冻切片上进行免疫电镜检查[67]用鼠抗rab4单克隆抗体和兔抗syntaxin 13抗体标记切片[35]或GRASP-1（#5285）。

我们感谢Richard Huganir博士提供的GRASP-1抗体和构建物，Harald Hirling博士提供的Neep21抗体和Neep21及syntaxin 13构建物，Gary Banker博士提供的TfR构建物，Mitsunori Fukuda博士提供的Flag-Rab4和Flag-Rab 5，Samantha Spangler和Nanda Keijzer博士准备的海马神经元原代培养物，Mathijs Vleugel和Bianka Martini负责技术援助，RenéScriwanek和Marc van Peski负责准备EM数字。