《公共科学图书馆·生物》。 2010年1月; 8(1):e1000282。
Rho支架整合分泌系统和反馈机制调节生长素分布 , # 1 , # 1 , 1 , 1 , 2 , 三 , 2 , 三 和 1 , *
奥拉·哈扎克 1 以色列特拉维夫特拉维夫大学植物科学系
达里亚·布洛赫 1 以色列特拉维夫特拉维夫大学植物科学系
利莫·波拉蒂 1 以色列特拉维夫特拉维夫大学植物科学系
哈桑娜·斯滕伯格 1 以色列特拉维夫特拉维夫大学植物科学系
张静(音译) 2 比利时根特佛兰德斯生物技术研究所(VIB)植物系统生物学系
三 比利时根特根特大学植物生物技术和遗传学系
基·弗里姆 2 比利时根特佛兰德斯生物技术研究所(VIB)植物系统生物学系
三 比利时根特根特大学植物生物技术和遗传学系
肖尔·雅洛夫斯基 1 以色列特拉维夫特拉维夫大学植物科学系
奥托林·莱瑟, 学术编辑
1 以色列特拉维夫特拉维夫大学植物科学系
2 比利时根特法兰德斯生物技术研究所植物系统生物学系
三 比利时根特根特大学植物生物技术和遗传学系
英国约克大学
# 贡献均等。
作者就他们的贡献发表了以下声明:构思和设计了实验:OH-DB-JF-SY。执行了实验:羟基-DB-LP-HS-JZ。 分析数据:OH DB JF SY。撰写论文:JF SY。
收到日期:2009年6月2日; 2009年12月9日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章,该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
补充资料 图S1:
早期发育异常
集成电路1
胚胎。 (A–F) 第0列 ,(G–L)90% 集成电路1 早期胚胎发育正常的子代,(M–P)10% 集成电路1 具有早期基底缺陷的后代。 (A和G)1-细胞期,(B和H)4-细胞期,,(C、I和M)8-细胞期、(D、J和N)16-细胞期,以及(E、K和O)早期球状期和(F、L和P)晚期球状期。 h、 垂体; lc,透镜状细胞; llc,下部大细胞。 箭头(M和N)表示垂体和胚柄分裂异常; (O和P)中的垂直括号表示未成形的基底区。 条形对应于所有图像的10µm。 (1.88 MB畅通节能法)
GUID:3D6F59C2-D77D-48C4-8BAE-061217E61A27
图S2:
后期异常发展
集成电路1
胚胎。 (A–D)三角台,(A) 第0列 和(B–D) 集成电路1 (B)中的箭头表示胚柄和小柱声母的异常分裂; (C和D)中的箭头表示原皮细胞分裂异常。 (D) (C)中箭头高亮部分的放大。 (E–K)心脏早期/中期,(E和J) 第0列 ,(F–I和K) 集成电路1 (G–I)中的箭头表示原皮层分裂异常。 (J)中的箭头表示WT柱的正常斜周分裂。 (K)中的箭头指向 集成电路1 胚胎。 (L–S)弯曲子叶阶段,(L、N、P和R) 第0列 、和(M、O、Q和S) 集成电路1 (N和O)根分生组织扩大(RM)。 (O)中的箭头表示小柱的异常分裂。 (L和M)中的竖线表示(P和Q)中所示的放大区域。 pd,原皮; pc,原形成层; col,小柱首字母; QC,静止中心; v、 血管组织; 表皮; c、 皮层; 恩,内胚层。 棒材对应于20µm(A–m)、10µm。 (3.72 MB TIF)
GUID:96D6F141-F1C7-4772-BD1E-4C2A882982B4
图S3:
集成电路1
西力克表现出更大的发育变异性。 堆积巴氏图显示了从12个具有代表性的西力克中采集的胚胎的发育阶段。 (A) 第0列 和(B) 集成电路1 不同年龄的西力克。 每种颜色都代表着一个单色。 色彩的高度混合 集成电路1 突变体表明一个单晶硅内胚胎发育的同步性受到损害。 注意胚胎是致命的 集成电路1 胚胎被排除在外。 (0.22 MB畅通节能法)
GUID:C16C92FE-8E1F-464E-A6A0-F135D73FF51A
图S4:
异常
DR5(数字参考5)
中的响应
集成电路1
胚胎。
DR5版本 ::ER-GFP在WT和 集成电路1 胚胎。 (A–E和L) 第0列 ,(F–K) 集成电路1 (A和F)早期球状阶段,(B和G)三角形阶段,(C和H)早期/中期心脏阶段,以及(D、E和I–L)晚期心脏阶段。 面板(K)和(L)分别是(D)和(I)RM的放大。 箭头表示发育中的子叶中存在生长素积累点。 (C、D、H、I、K和L)中的箭头表示QC的位置。 (E和J)中的箭头指向生长素通过前血管组织的向下运动。 (A–J)多个共焦截面的最大投影Z叠加; 整个RM中心的(K和L)单共焦扫描。(A–D、F–I、K、L)为荧光/DIC叠加图像。 (E) 和(J)是荧光图像。 GFP荧光以绿色显示。 棒材相当于20µm。 (2.37 MB畅通节能法)
GUID:71E94A22-B296-44F4-8471-63AE621145EB
图S5:
的异常表达模式
pWOX5::
ER-GFP输入
集成电路1
胚胎。
工作5 首次在球形期胚胎中检测到表达。 在WT胚胎中,可以在晶状体形状和上胚柄细胞中看到表达。 在 集成电路1 球形和心脏期胚胎的表达扩散到透镜状细胞(箭头)附近的细胞。 成人 集成电路1 胚胎结实 WOX5型 表达于下胚轴下部(箭头)和子叶中。 相比之下,成年WT胚胎 WOX5型 在QC和子叶中检测到表达。 然而,子叶中的表达较弱,需要使用高灵敏度的检测器进行检测。 条形对应于10µm球形胚胎、20µm心脏期胚胎和50µm成人胚胎。 (2.19 MB畅通节能法)
GUID:3556A39A-276E-4793-9236-0688EF6BF5EE
图S6:
的表达模式
可控硅
在中更改
集成电路1
胚胎。 的表达式模式 可控硅 由确定 pSCR:: YFP-His2b报告基因为黄色细胞核。 WT球形胚胎 可控硅 在垂体、基底分生组织和血管前细胞中表达。 插图是多个共焦扫描的投影堆栈。 在心脏期,表达扩大到QC细胞。 在成年胚胎中,在QC和胚胎根的未来内胚层以及下胚轴中检测到表达。 注意下胚轴和胚根之间表达模式的明显差异(用矩形和弧形括号表示)。 在弯曲的子叶胚中,表达仅限于胚胎根的QC和内胚层/皮层干细胞。 子叶中检测到低水平表达。 的异常表达模式 可控硅 出现在球状阶段 集成电路1 早期发育异常的胚胎(箭头)。 心脏期 集成电路1 胚胎表达扩散到额外的细胞(箭头)。 与WT类似,成熟 集成电路1 胚胎 可控硅 在胚根和下胚轴中检测到表达。 然而,与WT胚胎不同,胚根和下胚轴之间的表达模式没有明显区别。 在弯曲的子叶中 集成电路1 胚胎 可控硅 表达仅限于胚根,但与WT胚(箭头)相比,表达更广泛。 条形对应于10µm球形胚胎、20µm心脏期胚胎和50µm成人胚胎。 (1.78 MB TIF)
GUID:7F8CCD63-A834-4D18-945F-E2DB02AF23CE
图S7:
叶脉组织的分化
集成电路1
受到损害。 玫瑰花结的横切面离开了中央血管链。 血管链的缩小 集成电路1 很明显。 还要注意叶肉细胞形状的改变和 集成电路1 叶子。 棒材相当于20µm。 (1.82 MB TIF)
GUID:530F198E-48F3-4A1D-9FFA-23598E233A48
图S8:
高分辨率图像显示PIN1和PIN2在
集成电路1
根。 箭头表示PIN定位在单元格中的方向。 棒材厚度为20µm。 (1.72 MB TIF)
GUID:E4EC7BB3-4DD2-40BA-BAB1-54CA1379A9B0
图S9:
pPIN1基因
-在WT和
集成电路1
根。 GFP-PIN1在3 DAG初生根中的表达 第0列 (A至C)和 集成电路1 (D到F)。 (A和D)DIC和GFP荧光之间的重叠,(B和E)GFP和(C和F)PIN1-GFP表达的根部用5µM FM4-64染色。 (C和F)中的插图是RM的特写视图。(G–I) pPIN1码: GFP-PIN1在根毛和表皮中的表达。 (G) 第0列 (H和I) 集成电路1 (H)中的箭头表示表皮和根毛中的异位表达。 (I)中的箭头表示GFP-PIN1在体内的堆积。 (A、B、D和E)多个共焦截面的最大投影Z堆叠。 (C、F和G–I)单次共聚焦扫描。 (A、D、G和H)是荧光/DIC叠加图像。 (B、C、E、F和I)是荧光图像。 (C和F)是GFP/FM4-64覆盖图像。 GFP荧光以绿色显示,FM4-64以红色显示。条形对应于20µm(A到F)和50µm的(G到I)。 (2.42 MB TIF)
GUID:046364AD-9E21-4F02-9CC4-332D8B17C2B5
图S10:
的本地化
pPIN2码
-驱动GFP-PIN2英寸
集成电路1
根。 (A) WT和 集成电路1 表示根 pPIN2码 ::GFP-PIN2,并在4 DAG时用FM4-64染色。 白色方框表示右侧面板上显示的放大区域。 WT中的箭头标记GFP-PIN2在表皮和皮层基底部的顶端定位。 注意GFP-PIN2在表皮和皮层的顶端化 集成电路1 根(箭头)。 (B) BFA处理WT和 集成电路1 幼苗导致FM4-64和GFP-PIN2在BFA隔室(箭头)中共存。 棒材相当于20µm。 (3.97 MB TIF)
GUID:68BD9029-33AF-48F7-A9D8-CBD49EBA0DEC
图S11:
修改后的
pPIN1码
-驱动GFP-PIN1本地化
集成电路1
胚胎。 (A–D、I和J) 第0列 ,(E–H、K和L) 集成电路1 表现出轻微基底缺陷的胚胎(M和N) 集成电路1 具有强烈基础缺陷的胚胎。 (A、B、E和F)中期球状期,(C、D、G、H、M和N)三角形期,(I–L)心脏期。 箭头(B、D、F、H、J和L)表示GFP-PIN1定位的方向,基底位于原形成层细胞,顶端位于原表皮。 (M和N)中的箭头表示PIN1-GFP在基底区的表达缺失 集成电路1 具有强烈基础缺陷的胚胎。 (I和K)中的插图是正在发育的子叶的放大图。 (A、C、E、G、I、K和M)多个共焦截面的最大投影Z堆叠。 (B、D、F、H、J和N)整个胚胎中心的单次共聚焦扫描。 (A、C、E、G、I、M和K)是荧光/DIC叠加图像。 (B、D、F、H、J、L、N以及插入I和K中)是荧光图像。 GFP荧光以绿色显示。 棒材相当于20µm。 (287百万TIF)
GUID:E0F1F564-09A3-415C-B092-1DCA74E4686C
图S12:
总结WT和WT中PIN1定位、生长素分布和模式的模型
集成电路1
胚胎。 WT(A)和 集成电路1 胚胎(B和C)。 (A) PIN1极性膜定位介导发育过程中胚根分生组织和未来子叶顶端生长素的定向流动和生长素最大值的出现。 (B) PIN1极性降低导致生长素通量减弱,并逐渐破坏生长素最大值的形成 集成电路1 具有晚期图案缺陷的胚胎。 (C) 在 集成电路1 早期模式缺陷的胚胎PIN1膜定位和极性受到强烈影响,可能导致生长素非极性分布(交叉箭头)。 (1.24 MB畅通节能法)
GUID:5267E23C-7ED8-4CF8-9207-D791571B064F
图S13:
这个
pICR1::LhG4
和
pOp::ICR1 5′-UTR -绿色荧光蛋白-ICR1 基因组学
构造。 (A) pICR1 驱动效应器/报告器线。 这个 长G4/pOp 系统允许来自同一效应器的不同报告者表达,从而减少对基因表达的位置效应 [35] , [36] 在这项工作中,GFP-ICR1、GFP-rop6 加利福尼亚州 和GUS是使用相同的pICR1效应器系表达的。 (B) 的示意图 pICR1基因 发起人。 (C) GFP-ICR 基因组学 构造。 (0.30 MB畅通节能法)
GUID:627889CD-DED5-4CFF-BF2D-7004AFB4111D
图S14:
生长素诱导ICR1表达。
pICR1 ≫GUS在NPA上生长或NAA诱导6小时后表达。箭头表示NAA处理后周周期细胞中的GUS表达。 棒材相当于50µm。 (2.96 MB TIF)
GUID:C9C31168-E9A3-4202-8C7F-8E5CBB85D5CB
图S15:
根系生长的互补性
集成电路1
GFP-ICR1突变体。 GFP-ICR1的表达由ICR1启动子使用转录/反式激活系统驱动(参见 图S12 ). 棒材相当于100µm。 (0.61百万桶/立方英尺)
GUID:DFCAB6D8-EB2B-4131-985E-6F8A8CD25BC3
图S16:
血浆溶解后检测到GFP-ICR1的质膜定位。 在质壁分离前后,PI染色的GFP-ICR1表达叶表皮铺装细胞。 底部的大面板是等离子分解后覆盖面板的放大。 红色箭头表示细胞壁,白色箭头表示分离的质膜。 质壁分离后检测到的荧光绿色斑块表明,一些GFP-ICR1没有附着在质膜上。 棒材相当于20µm。 (5.46 MB TIF)
指南:7DA6FF5D-17D3-4E07-92A8-844433BFAEBE
图S17:
质外体pH值对secGFP荧光的影响及其在WT和
集成电路1
根。 (A) WT和 集成电路1 将5 DAG的根转移到滴定至pH 5.5或pH 8.5的液体MS培养基中培养3小时。 误差条对应SE, n个 ≥20,**在pH 8.5和5.5之间检测到WT根的荧光存在显著差异( 第页 ≤0.01; 学生的 t吨 测试)。 荧光差异 集成电路1 pH值在8.5和5.5之间不明显( 第页 ≥0.72). (B) 在MS培养基中培养的WT根滴定至pH 8.5,PI染色(红色)。 箭头表示secGFP的质外体定位。 (C) 安 集成电路1 在MS培养基中培养的根滴答作响,pH值为8.5,并用PI染色(红色)。 请注意,GFP荧光仍在细胞内。 棒材相当于10µm。 (0.46 MB畅通节能法)
GUID:E73AF12E-8A42-498D-BD0A-1F2DEADF5830
表S1:
频率
集成电路1
−/− 在指定的发育阶段表现出图案缺陷的胚胎。 *分析中排除了具有强烈基底缺陷的胚胎。 1 在1细胞、2细胞、4细胞、8细胞(辛特)和16细胞(皮肤原)阶段对胚胎进行分析。 (0.04 MB文件)
GUID:269EC792-A775-41DA-B830-3BD0E515F949
视频S1:
的表达式
pICR1
在根尖处的GFP-ICR1。 这部电影强调了在QC及其周围缺乏ICR1表达。 (10.12 MB AVI)
GUID:8D2ACEA4-DFBC-41B9-BC5A-E6F130618A23
在植物中,生长素分布和组织模式通过涉及生长素调节细胞极性因子ICR1和分泌机制的反馈回路进行协调。
摘要 多细胞生物的发展取决于单个细胞通过小信号分子来协调其行为以形成正确图案的组织的能力。 在植物中,信号分子生长素在细胞间定向运输的独特机制连接细胞极性和组织模式,因此对植物发育的许多方面都是必需的。 生长素的流动方向由PIN生长素外排转运体的极性亚细胞定位决定。 动态PIN极性定位是由构成性胞内循环往返于质膜引起的,但尚不清楚该机制如何与细胞极性调节器联系起来。 Rho家族小GTPases ROPs/RACs是细胞极性的主要调节器,但它们在调节极性蛋白运输和极性生长素运输方面的作用尚未确定。 在这里,通过对突变体和转基因植物的分析,我们表明ROP相互作用物和极性调节器支架蛋白ICR1是PIN蛋白向质膜极性结构域募集所必需的。 集成电路1 突变体胚胎和植物表现出一系列严重的发育异常,这些异常是由生长素分布差异受损引起的。 ICR1在胞吐所需的质膜上发挥作用,但不与PIN一起再循环。 ICR1的表达很快被生长素诱导,但在垂体中稳定生长素最大值的位置受到抑制,随后在胚胎和成熟根分生组织中受到抑制。 我们的结果表明,ICR1是生长素调节的正反馈回路的一部分,通过将生长素依赖的转录调节独特地整合到ROP介导的细胞极性调节中来实现。 因此,ICR1在细胞极性、胞吐和依赖于生长素运输的组织模式之间形成生长素调节的联系。
作者摘要 模式形成过程中不同细胞的协调是多细胞生物发展的基本过程。 在植物中,信号分子生长素在细胞间定向运输的独特机制表明了细胞极性对组织模式的重要性。 生长素流动的方向由生长素运输蛋白PINs的极性亚细胞定位决定,PINs促进生长素流出。 同时,生长素介导的正反馈机制加强了PIN的极性分布。 然而,极性PIN定位的分子机制尚不清楚。 在真核细胞中,Rho家族的小GTPase作为细胞极性的中央调节器发挥作用。 我们发现,来自植物的一种Rho相互作用蛋白,称为ICR1,需要通过PIN蛋白的分泌系统向细胞膜的极性结构域募集。 因此,ICR1是生长素定向运输和分布所必需的,因此也是正确模式形成所必需的。 此外,ICR1的表达和亚细胞定位都受到生长素的调节,这表明ICR1可能在增强生长素分布的正反馈回路中发挥作用。 因此,ICR1在细胞极性、蛋白质分泌和依赖于生长素的组织模式之间形成了生长素调节的联系。
介绍 ROP(Rho of Plants),也称为RAC GTPases,被认为是细胞极性的主要调节因子 [1] , [2] 在其GTP结合的活性状态下,ROP与下游效应蛋白相互作用,以调节肌动蛋白和微管(MT)的组织、囊泡运输、磷脂酰肌醇的生成以及活性氧物种(ROS)和钙的梯度 2+
[1] —— [6] ROPs通过翻译后脂质修饰在质膜上发挥作用 S公司 -酰化 [1] , [7] —— [9] ROP与膜相互作用的能力使这些蛋白质能够调节肌动蛋白聚合和胞膜和内膜离散部位的囊泡运输,这对它们在控制细胞极性中的作用至关重要 [10] ROPs是极性定位的,不能水解GTP的激活显性ROP突变体的表达会破坏细胞极化 [1] —— [6] 并抑制内吞囊泡再循环 [3] 由于它们在细胞极性产生中的重要作用,ROPs也可能调节极性货物的分布,包括PIN生长素外排转运蛋白 [11] .
我们之前已经鉴定出ROP相互作用的卷曲螺旋结构域支架蛋白组成活性ROP 1(ICR1)的相互作用因子,并证明它影响细胞极性 [12] 最近,ICR1/RIP1被认为是极性花粉管生长的调节因子 [13] . The primary root meristem of集成电路1 突变体和 RNA干扰 沉默的植物在发芽后很快就会崩溃,类似于PIN蛋白基础定位受影响的突变体和多重突变体 大头针 功能丧失突变体 [14] 这些结果表明,ICR1可能在Rho调节的细胞极性和生长素极性运输之间形成联系。
生长素是植物组织极性和图案形成的主要信号。 生长素的极性运输及其在组织内的不对称分布(生长素最大值和梯度)对于胚胎、根和芽的正常发育、维管组织的分化和再生以及热带反应至关重要 [14] —— [18] 生长素转运的方向性取决于外排转运蛋白PINFORMED(PIN)家族的极性亚细胞分布 [11] , [19] , [20] 动态PIN极性是结构性内吞再循环的结果。 再循环到膜需要布氏菌素A(BFA)敏感的ADP核糖基化因子GDP/GTP交换因子(ARF-GEF)的功能 [21] , [22] .内吞步骤依赖于网格蛋白,并需要内吞Rab5/Ara7的功能 [14] , [23] 然而,关于PIN回收是如何导致其极性分布的,人们知之甚少。
在这项工作中,我们表明ICR1是生长素运输机制的一个重要组成部分,在胞吐中发挥作用,并作为生长素调节反馈回路的一部分。 因此,ICR1在Rho调节的细胞极性和生长素相关模式形成之间存在联系。
结果 生长素分布 集成电路1 根 为了探讨ICR1在生长素运输中的潜在功能,我们检测了野生型(WT)生长素的分布 第0列 和 集成电路1 利用生长素敏感报告基因突变植物 DR5::格斯 和 DR5版本::GFP
[17] , [18] .形成 DR5(数字参考5) -在静止中心(QC)和近端小柱细胞中观察生长素最大值是维持根分生组织和正确组织模式所必需的 [18] .幼体萌发后2天(DAG) 集成电路1 根系生长素最大值向根冠的远端移动,并减少( ). 随着根尖生长素最大值的降低,它开始在维管束中积累( ). 在较老的(14 DAG)根中,生长素积累在维管束中,但没有到达顶端( ). 这些结果表明 集成电路1 植物生长素运输受损,进而导致根尖生长素最大值逐渐消失。
生长素分布受损 集成电路1 根。 (A) DR5:: 野生型和2日龄和14日龄的GUS 集成电路1 幼苗。 (B) DR5版本::ER-GFP WT和2倍 集成电路1 幼苗。 注意生长素最大值向根杯的位移 集成电路1 (B) 以及生长素信号在中柱(A)中的积累。 在14d龄的植物中,生长素没有到达分生组织,而是在中柱(A括号)中积累。 棒材相当于50µm。
Columella规范 集成电路1
根尖小柱的规格与稳定生长素最大值的形成密切相关 [18] 小柱细胞含有淀粉颗粒,可通过卢戈染色法(IKI)对根进行染色来容易识别。 在萎蔫的初生根中未检测到淀粉颗粒 集成电路1
[12] 表明小柱的身份已经丢失。 因为稳定的生长素最大值在 集成电路1 胚胎和根,小柱细胞可能在年轻的根中被指定,但随后会消失,伴随着生长素最大值的近端转移。 为了检查小柱细胞的规格,在WT和 集成电路1 2、4和6 DAG下的根( ). 在2个DAG幼苗中,在WT和 集成电路1 根尖。 在第4天,在WT植物的3个细胞层中检测到淀粉颗粒,但在 集成电路1 根。 此外,在 集成电路1 在6日龄时,WT根有4层小柱细胞,而淀粉粒几乎不存在 集成电路1 根( ). 这些结果表明,小柱的特性最初是在 集成电路1 根尖细胞然后逐渐消失,伴随着局部生长素最大值的减少。
WT和 集成电路1 根。 Lugol’s(IKI)染色用于检测2、4和6 DAG WT和 集成电路1 幼苗。 在WT根中,含有淀粉颗粒的小柱层数随着幼苗年龄的增加而增加(箭头)。 在 集成电路1 根,在2日龄时,可以检测到含有淀粉颗粒的两层细胞(箭头),而在较老的阶段,淀粉颗粒染色减少,在6日龄时几乎完全消失(箭头)。 该条对应于所有图像的50µM。
开发 集成电路1 胚胎 在植物中,极性茎到根轴以及初生茎和根分生组织在胚胎发生过程中发育。 这些发育过程与细胞分裂和基因表达的定型系列有关,并取决于生长素的分布 [17] WT和 集成电路1 对突变胚胎进行分析,以进一步确定ICR1在生长素分布和胚胎发育中的作用。 约10%(27/273) 集成电路1 胚胎在球状期表现出基底胚胎极的定型细胞分裂缺陷,以及胚柄的异常分裂,包括形成垂体的最上层细胞( 和 图S1 ). 大多数突变胚胎(90%,246/273)在球状期发育正常( 图S2 和 表S1 ). 从三角期开始,胚柄、QC和胚柱细胞分裂异常。 此外,在未来子叶位置的原胚层中观察到异常分裂面( , 图S2 ,以及 表S1 ). 变量外显率 集成电路1 突变还导致单个西力克体内胚胎的发育同步性降低。 而在西力克斯野生动物中,胚胎分为两到三个发育阶段 集成电路1 西力克胚胎分布在四到五个阶段( 图S3 )表明发育迟缓 集成电路1 发生在不同的阶段。 数据表明 集成电路1 功能导致表型缺陷的梯度,主要发生在生长素最大值的位置和需要不同生长素分布的过程中。
图案化缺陷 集成电路1 胚胎与生长素分布的改变有关。 (A) 中的早期和晚期图案缺陷 集成电路1 正如Nomarsky DIC所揭示的清除胚胎。 约10% 集成电路1 胚胎在球形期表现出早期发育缺陷。 箭头表示胚柄和垂体细胞分裂异常。 大多数(90%)胚胎正常发育到三角期。 在心脏期,可以看到胚胎根分生组织中异常的细胞分裂(箭头所示)。 注意子叶中原皮层的非固有分裂(箭头)。 (B) 生长素分布 集成电路1 由 DR5版本 ::ER-GFP标记。 箭头表示生长素最大值向低柱层转移。 箭头指向子叶顶端强烈的生长素信号。 插入物是整个胚胎根分生组织中部的单次共聚焦扫描,显示QC层和上部小柱层中生长素积累减少。 (C) QC标记的表达 pWOX5:: ER-GFP公司。 箭头表示心脏和成熟期的累积变化 集成电路1 胚胎。 (D) 内皮细胞标记的表达 pSCR公司 :YFP-H2b。 箭头表示标记向相邻细胞层扩散 集成电路1 条对应于10µm(A)、20µm。 有关其他信息和高分辨率图像,请参阅 图S1 , S2系列 , 第3章 , S4系列 , 第5章 , S6系列 .
生长素分布 集成电路1 胚胎 接下来,我们检查了胚胎中生长素的分布,以确定其与 集成电路1 表型( 和 图S4 ). 与WT相比 集成电路1 胚胎生长素反应的最大值从QC向较低层的未来胚柱细胞转移( ,箭头)。 此外,外胚层很强 DR5(数字参考5) 在子叶顶端检测到活性( 、箭头和 图S4 ). 生长素的异常分布与未来根分生组织的非立体型分裂相吻合,进一步表明生长素在植物体内的发育异常 集成电路1 由于生长素分布受损。
的图案 集成电路1 胚胎和根 根和胚胎模式以及QC的维持取决于转录调控因子的高度特异性表达模式和亚细胞定位,包括WOX5(WUSCHEL相关同源框5)和SCR(SCARECRAW),它们定义了干细胞生态位 [24] —— [26] 在根中,需要形成稳定的生长素最大值,才能正确表达 WOX5型 , 可控硅 和一个附加标记SHORTROOT(SHR) [18] , [27] 为了验证ICR1确实参与生长素分布的调节而不是该基因网络 WOX5型 和 可控硅 在胚胎中进行了检查( 和 图S5 和 S6系列 ). 两者 WOX5型 和 可控硅 表达在 集成电路1 突变胚胎,但其表达模式发生了改变,反映了细胞特性的改变和胚胎极轴的破坏。 胚胎发育和生长素反应进一步表明 集成电路1 突变植株与生长素分布缺陷有关。
为了进一步证明 集成电路1 我们比较了生长素运输受损而非调控根系发育的遗传框架导致的突变体 工作5 , 可控硅 以及WT中的SHR和 集成电路1 根。 该分析表明,与胚胎中一样,所有三个标记都在 集成电路1 根( ). 类似于激光烧蚀根分生组织的实验 [27] ,的表达式 WOX5型 , 可控硅 在年龄较大、14岁、, 集成电路1 与新的生长素最大值的形成有关( 和 ). 异常表达模式 WOX5型 , 可控硅 根中的SHR进一步表明 集成电路1 与生长素分布改变有关。
中模式标记的异常表达 集成电路1 根。 在 集成电路1 根、QC和干细胞标记物的表达 pWOX5:: ER-GFP(A), pSHR:: YFP-SHR(B),以及 pSCR:: YFP-H2b(C)在2-4-d龄幼苗中扩散到邻近细胞,在老(14-d龄)根分生组织中减少,并且恰好出现在生长素积累部位的更多顶端位置(括号)。 注意SHR在表皮(箭头)中的表达和细胞质定位。 (D) 的表达式模式 pPIN1基因 ::WT中的GFP-PIN1和 集成电路1 根。 注意GFP-PIN1在表皮和根毛中的异常表达模式 集成电路1 根(箭头)。 (E) 不规则间距(右插图)和侧根在出苗后不久生长受阻 集成电路1 突变植株。 注意的异常表达模式 WOX5型 在中 集成电路1 侧根原基(插图)。 棒材相当于50µm。
为了进一步研究ICR1在根模式中的功能,我们检测了PIN1在 集成电路1 根。 在根中,PIN1主要在维管柱中表达。 在 集成电路1 然而,变异根, pPIN1码 -表皮和根毛中也检测到PIN1-GFP的驱动表达,在那里形成细胞内聚集物( ). PIN1的错误表达进一步表明 集成电路1 突变体植物是生长素运输受损的结果,不是生长素依赖型模式机制中扰动的间接影响。
侧根发育 集成电路1
侧根的起始和生长是可分离的事件,取决于当地生长素的积累和极性运输 [15] , [28] 考虑到ICR1在初生根发育中的作用,它可能会影响侧根的发育。 的主根 集成电路1 突变体植物在侧根形成之前就崩溃了。 然而,突变体植物会产生不定根,这些不定根会生长一段时间,然后塌陷 [12] 在这些不定根形成之前,先形成局部生长素最大值(未公布的数据)。 侧根在这些不定根上萌生,但出苗后生长受阻( ). 通常可以观察到侧根的多次萌生( ,插图),表明侧根的开始和生长在 集成电路1 。在 集成电路1 侧根阻滞, WOX5型 表达错误( ,比较左右面板),表明新的根分生组织没有正确设置。 综上所述,这些结果表明 集成电路1 突变体植物&调控根系发育的基本遗传框架已经存在,根分生组织的塌陷、器官发育的改变和细胞特性的改变主要归因于生长素分布的受损。
根作为生长素库的功能长期以来被认为在维管分化中起主要作用 [29] “管道化假说”成为解释生长素依赖型模式的标志,它假设血管组织的分化和再生依赖于生长素调节的正反馈回路 [14] , [16] , [30] 也就是说,生长素诱导一个过程,增强其自身从细胞的转运,同时抑制其在邻近细胞中的转运。 这个过程最终导致生长素运输细胞文件的形成,并分化为血管组织。 鉴于ICR1参与生长素运输,我们怀疑血管组织 集成电路1 突变体植物会异常。 通过玫瑰花叶制作横切面,以比较WT和 icr公司 突变植物。 对这些切片的分析表明 集成电路1 与野生型相比,突变体植物数量减少了很多( 图S7 ). 血管组织减少 集成电路1 突变体进一步表明ICR1蛋白参与生长素运输,并且可能是生长素调节反馈回路的一部分。
总之,使用生长素反应标记和多种生长素调节过程中模式形成的主要调节因子进行的详细表型分析显示 集成电路1 可能是生长素分布缺陷导致的突变植株。
中PIN1和PIN2的本地化 集成电路1
为了研究ICR1介导生长素分布的可能机制,我们检测了PIN1和PIN2生长素转运体在WT和 集成电路1 根和胚( 和数字 第8节 , 第9部分 , 第10页 , 第11条 , 第12节 ). 免疫定位分析显示,PIN蛋白的极性定位存在缺陷,在更明显的病例中,导致中柱中的PIN1和皮层中的PIN2从基底向顶端移位 集成电路1 根( ,请参见箭头,以及 图S8 ). 一直以来,在大约90%的细胞中,观察到PIN1-GFP与质膜的结合减少,皮层细胞PIN2-GFP从基底向顶端移动( 图S9 和 S10安 ). 在表皮中,PIN2主要位于细胞的顶端,在这个位置对BFA有抵抗力 [21] , [31] PIN2仍然与 集成电路1 根表皮细胞( 和 S10安 )表明ICR1主要与BFA敏感的PIN传递途径相互作用。 球状的 集成电路1 表现出早期发育缺陷的胚胎,GFP-PIN1在基底极不表达,在细胞内大量聚集,并且在质膜上基本缺失( 、箭头和 图S11 ). 在发育异常晚期的胚胎中,PIN1-GFP定位在心脏早期开始出现明显变化,并与细胞内PIN1-GFP聚集和极膜定位的整体丢失有关( 和 图S11 ). 免疫定位和PIN1-GFP之间的差异可能反映了胚胎和根细胞之间的差异或更高稳定性的GFP-PIN1。 或者,生长素分布的变化影响 pPIN1码 -驱动PIN1-GFP的表达,使其在某些细胞中积累到较高水平。 重要的是,质膜标记物LTi-GFP的定位在 集成电路1 突变体( ),表明ICR1一般不调节膜蛋白的靶向。 中的模型 图S12 总结了ICR1对胚胎模式、PIN1定位和生长素分布的影响。 PIN1的极性降低和膜结合 集成电路1 胚胎可能导致生长素极性运输缺陷,从而导致胚胎根和子叶生长素最大值形成缺陷。 生长素水平的降低与血管外组织中PIN1表达的抑制有关。 这反过来导致生长素最大形成的失败,导致根分生组织的崩溃。
PIN极性和膜定位需要ICR1。 (A) 用α-PIN1/PIN2抗体间接免疫荧光根系。 箭头表示PIN极性的方向。 注意血管外组织中PIN1和皮层中PIN2的极性变化(箭头所示)。 (B) 的定位和表达模式 pPIN1码 ::胚胎中的GFP-PIN1。 多个共焦切片的投影显示,心脏期前血管组织和原皮肤中的PIN1极性 集成电路1 胚胎被改变了。 箭头表示基底侧无表达 集成电路1 具有早期图案缺陷的胚胎。 插图是对未来子叶区域的单次共焦扫描。 注意心脏期PIN1极性降低和细胞内大量聚集 集成电路1 早期模式缺陷的胚胎PIN1膜定位几乎完全丧失。 (C) 质膜标记物LTi-GFP在WT和WT根中的定位相似 集成电路1 幼苗。 棒材相当于20µm。 有关其他信息和高分辨率图像,请参阅 图S8 , 第9部分 , 第10页 , 第11条 .
ICR1表达模式 一种生长素反应元件(GTGCTC),位于 国际资本市场1 ( 图S13 )表明ICR1可能是生长素诱导的正反馈环的一部分,影响生长素运输的极性。 这进一步表明ICR1可能整合核生长素信号 [32] 和ROP调节细胞极性。 为了检验这些假设,我们研究了ICR1的表达模式和亚细胞定位 国际资本市场1 熔合到 GFP公司 ( 和 图S13 ). 在球状和鱼雷期胚胎中,GFP-ICR1在整个胚胎中都有表达,但有趣的是,在垂体和QC中没有表达,因为垂体和QC形成了稳定的生长素最大值( ). 同样,在根中,QC和干细胞(稳定生长素最大值的位置)中也没有ICR1( 和 视频S1 ). 生长素最大值位置ICR1的缺失与发育不全、QC和小柱初始期的非极性PIN4定位相关 [33] .
的表达式 国际资本市场1 由生长素诱导,但在稳定生长素最大值处被抑制。 (A) 胚胎和根中ICR1的表达。 在球形和鱼雷期胚胎中,垂体和QC分别没有GFP-ICR1表达。 通过成熟根的多次共聚焦扫描的投影堆叠显示GFP-ICR1在根杯和表皮中表达,但通过内层的部分投影堆叠仅显示GFP-ICR1在QC和邻近细胞中不存在(箭头)。 (B) ICR1表达的调控涉及ICR基因和/或蛋白质。 pICR1 驱动GFP-rop6 加利福尼亚州 但GFP-ICR1在QC和干细胞(箭头)中不表达。 (C) ICR1在侧根中的表达。 GFP-ICR1在侧根(LR)创始细胞和整个LR发育过程中检测到表达。 注意GFP-ICR1的极化定位(箭头)。 (D) GFP-ICR1的亚细胞定位。 球形胚胎中的质膜和极化GFP-ICR1定位在基底膜和斜周膜(箭头)中。 在根中,GFP-ICR1随着中柱细胞的成熟而逐渐极化。 (E) 国际资本市场1 生长素诱导表达。 条形图Q-PCR分析显示诱导 国际资本市场1 与生长素(10µM NAA)孵育30分钟内表达。 强烈的诱导 pICR1 -局部生长素诱导24小时后,在1mm处检测到GFP-ICR1的驱动表达 2 将含有或不含10µM NAA的固体介质颗粒置于根尖上方5 mm处。 pICR1 -生长素转运抑制剂NPA抑制了GFP-ICR1的表达。 条形对应于球形胚胎(A和D)的10µm,以及所有其他图像中的50µm。 有关其他信息和高分辨率图像,请参阅 图S13 , S14标准 , 第15节 , 第16节 .
进行了几项实验,以检查ICR1的表达是否受到生长素的影响。 定量实时RT-PCR(q-PCR)的表达分析表明,ICR1在生长素(NAA)中孵育30分钟后快速诱导表达( ). 的表达式 pICR公司 ≫ 绿色荧光蛋白-ICR1 和 pICR1 ≫ GUS公司 研究了在含有极性生长素转运抑制剂NPA(1-N-萘基邻苯二甲酸)的培养基上进行幼苗生长,然后向生长培养基中添加生长素(NAA)的报告人。 证实了这一预测,当幼苗生长在NPA上时,ICR1的表达较低,并且在NAA处理后的4-6小时内就被诱导表达( 和 图S14 ). 如上所示,侧根发育在 集成电路1 ( ). 侧根的萌生是由生长素诱导的,发生在短暂的局部生长素最大值处 [15] , [28] 一致地,在侧根起始的位置观察到GFP-ICR1的表达( ),进一步表明ICR1的表达是由生长素诱导的。
在形成稳定生长素最大值的QC和干细胞中,ICR1的缺失与生长素对其表达的诱导明显不同,这表明它可能受到不同机制的抑制。 检查稳定的生长素最大值是否可以抑制 国际资本市场1 直接表达,局部应用生长素 pICR1 ≫ 绿色荧光蛋白-ICR1 根部,使用小的,1 mm 2 ,含有10µM NAA的琼脂颗粒。 在生长素处理的根中观察到强烈的局部GFP-ICR1表达,而在用不含生长素的琼脂颗粒处理的对照根中没有观察到增加( ). 这些结果再次证实了 国际资本市场1 表达是由生长素诱导的,进一步表明稳定的生长素最大值可能不会直接抑制ICR1的表达。 根尖稳定生长素最大值的位置显示出表达一组特定的基因 [18] , [27] , [34] 因此,ICR1表达的抑制可能与稳定生长素最大值部位及其周围发生的特定细胞过程有关。
为了进一步了解ICR1表达的调控,我们检测了其表达的抑制是否与ICR1基因或蛋白有关。 为此,GFP-rop6 加利福尼亚州 记者(波拉蒂和亚洛夫斯基,未公开数据)是根据 国际资本市场1 发起人。 为了减少由于位置效应导致表达差异的可能性,使用LhG4/pOp转录/反式激活系统进行表达 [35] , [36] ,使用相同 pICR1 表达GFP-rop6的启动子激活系 加利福尼亚州 、GUS或GFP-ICR1( 图S13 ). 与GFP-ICR1相比,GFP-rop6 加利福尼亚州 在QC和干细胞中观察到( )这表明,确实可以通过与ICR1基因或蛋白相关的机制来调节根分生组织中ICR1表达的抑制。 总结这些数据,生长素诱导 国际资本市场1 是促进生长素运输的正反馈回路的一部分,抑制根分生组织中ICR1的表达与细胞特异性机制有关,可能导致抑制生长素的定向运输,并有助于形成稳定的生长素最大值。
ICR1的亚细胞定位 接下来,我们检查了GFP-ICR1的亚细胞定位是否反映了ICR1在PIN蛋白极性定位中的功能。 GFP-ICR1补充了 集成电路1 突变植物( 图S15 ). 此外,在花粉管中,GFP-ICR1或非融合重组ICR1的过度表达具有相同的表型效应 [13] 由此看来,GFP-ICR1融合蛋白的定位反映了天然ICR1蛋白的定位。 重要的是,GFP-ICR1定位对BFA不敏感( )与早期研究表明ICR1向质膜的募集不是ARFGEF,而是ROP依赖性的一致 [12] , [13] GFP-ICR1定位于质膜和细胞内。 质膜定位通过质膜溶解得到证实,质膜溶解导致膜从细胞壁上脱落( 图S16 ). 在侧根创始细胞和胚胎中,GFP-ICR1具有极化定位( ,箭头)。 在初生根中,GFP-ICR1的定位逐渐从生长素最大值极化( ,箭头)。 生长素最大值附近的非极化ICR定位可能有助于生长素运输减少,从而形成稳定的生长素极大值。
BFA敏感的内吞再循环在 集成电路1 GFP-ICR1定位对BFA不敏感。 (A,B)BFA处理的胚和根分别用FM4-64染色。 箭头标记BFA舱室。 请注意,在 集成电路1 所有检查的根组织中都形成了BFA隔室。 (C) pPIN1基因 ::GFP-PIN1与FM4-64在WT和 集成电路1 (箭头)根细胞。 (D) pICR1 驱动型GFP-ICR1不在FM4-64标记的BFA小体中积累,其膜定位不受BFA处理的影响。 条形对应于10µm(A)和20µm。 有关更多信息,请参阅 图S10B .
ICR1与组织内循环 PIN1和PIN2的极性降低及其与质膜的结合 集成电路1 植物表明,ICR1是PIN蛋白向质膜募集所必需的,而不是其Rab5调节的内吞再循环 [37] 的确,内吞示踪剂FM4-64在BFA体内的内化在 集成电路1 突变根和胚( ). 此外,与野生型根类似,PIN1-GFP和PIN2-GFP在 集成电路1 根( 和 S10B型 ). 这些数据证实,FM4-64标记的质膜衍生小泡的内吞作用一般不受影响,尤其是PIN1和PIN2的内吞不受影响 集成电路1 突变植物。
BFA对内吞再循环的影响是可逆的。 当BFA从培养基中洗脱后,BFA小体消失,PIN蛋白重新定位在质膜中 [21] , [22] 进行BFA冲刷试验,以检查PIN动力学是否在 集成电路1 .孵化后 GFP-引脚2 和 GFP-PIN2 icr1 在BFA植物中,含有GFP-PIN2的BFA小体出现在80%到90%的细胞中,WT和 集成电路1 ( ). 然而,在不含BFA的培养基中培养2小时后 集成电路1 根中仍含有BFA小体,而WT植物中只有2%-5%的细胞( ). WT和 集成电路1 含细胞的BFA小体中的根系百分比具有统计学意义( 第页 ≤0.001; 学生的 t吨 测试)。 这些结果再次证实,ICR1可能不参与BFA处理后Rab5介导的PIN蛋白内吞积累,并表明ICR1影响PIN蛋白再循环回质膜。
PIN2-GFP标记的BFA小体在WT和 集成电路1 根。 PIN2-GFP标记的BFA隔间 引脚2-GFP (A) 和 引脚2-GFP icr1 (C) 用50µM BFA处理表皮和皮层1小时 引脚2-GFP (B) 和 引脚2-GFP icr1 (D) BFA冲洗2小时后。 (E) 含BFA小体的表皮细胞在BFA洗脱前后的百分比 引脚2-GFP 和 引脚2-GFP icr1 误差条表示SE*** 第页 ≤0.001; 学生的 t吨 测试。 箭头标记着BFA的尸体。 对于所有图像,比例尺对应于10µm。
ICR1在胞吐中的作用 以前,我们发现ICR1与AtSEC3A外囊复合物亚单位相互作用,ROPs可以将ICR1-SEC3复合物募集到质膜上 [12] 这表明ICR1可能参与调节极化胞吐。 为了验证这一假设,比较蛋白质分泌标记物secGFP在WT和 集成电路1 进行了突变体植株的培养。 SecGFP是GFP的一种分泌形式,在其N端与几丁质酶信号肽融合,在其C端与HDEL(ER-抑制信号)融合,并已用于分析蛋白质贩运 [38] , [39] secGFP分泌到质外体导致信号微弱,因为该细胞室的pH值相对酸性。 分泌物的扰动导致细胞内积累蛋白的荧光。 因此,可以通过监测荧光差异来评估特定突变或处理对分泌的影响。 表达secGFP的转基因植物 [38] , [39] 被划入 集成电路1 背景。 定性和定量荧光成像分析表明 集成电路1 根系明显更强( 第页 ≤0.001; 学生的 t吨 测试)比WT根( ). 当幼苗生长在pH值高于8.1时,分泌的GFP的荧光可以恢复 [39] 验证WT和 集成电路1 根系与蛋白质分泌有关,而不是与之无关的机制,幼苗从低pH(5.5)培养基转移到高pH(8.5)培养基。 定量分析显示显著( 第页 ≤0.01; 学生的 t吨 试验)WT根的GFP荧光增加,而在 集成电路1 根( 图S17 ). 这些数据证实,secGFP分泌在 集成电路1 高倍荧光共聚焦图像显示 集成电路1 植物secGFP以标点结构累积( ). 内化的secGFP没有与FM4-64标记的细胞内小泡共存( )且未在BFA隔间内积聚( ).
secGFP在中的本地化 集成电路1 根。 (A) WT和 集成电路1 在相同条件下对4 DAG的根进行成像。 DIC图像上的白色虚线(两个上部面板)标记了距根部500µm长的区域,用于量化(B)中所示的平均荧光。 (B) WT和中的平均荧光 集成电路1 根在4和7 DAG。 平均荧光 集成电路1 根系在4日龄时比对照强约1.5倍,在7日龄时强约2倍。 afu,任意荧光单位。 误差条对应SE; n个 ≥20; *** WT和 集成电路1 根( 第页 ≤0.001; 学生的 t吨 测试)。 (C) secGFP在中的本地化 集成电路1 根在4 DAG。 注意secGFP在标点结构(箭头)中的累积。 (D) secGFP(绿色)标点符号结构 集成电路1 未与标记有FM4-64(红色)(箭头)的早期/再循环内体共存。 (E) secGFP(绿色)未内化到以FM4-64(红色,箭头)标记的BFA隔间中。 棒对应于100µm in(A)和10µm in(C至E)。
讨论 我们的结果表明,ICR1调节生长素极性运输的方向性,因此在胚胎发生、器官发生和分生组织活性期间需要形成稳定的生长素最大值和顶端定位生长素梯度。 早期有关生长素相关模式的研究加强了这样一个概念,即模式并不反映一个严格的程序,而是反映每个细胞固有的发展潜力 [30] 本研究的结果表明,ICR1是生长素调节的正反馈回路的一部分,将生长素依赖的转录调控与Rho家族GTPases介导的细胞极性调节结合在一起。 因此,ICR1在细胞极性和依赖于生长素运输的组织模式之间形成了生长素调节的联系。
动态PIN极性是通过(1)整合先前描述的结构性内吞再循环来实现的,该内吞再循环涉及氯氰菊酯依赖性内吞 [14] , [23] 和BFA敏感的ARF GEFs介导的再循环 [21] , [22] 和(2)ROP-ICR1调节的BFA不敏感的胞吐(本研究)。 在质膜中检测到ROP-ICR1复合物 [12] , [13] 此外,在质壁分离后 pICR1 驱动型GFP-ICR1仍与质膜相关( 图S16 ). 因此,ICR1可能与ROP一起发挥作用,将PIN蛋白招募到膜中的特定位置。 使用诸如光漂白后荧光恢复(FRAP)等技术对PIN动力学的未来分析 [37] ,以阐明ICR1相关的胞吐和BFA敏感的PIN内吞再循环之间的相互作用。
胞吐缺陷 集成电路1 与之前的发现一致,即ICR1可以与ROPs和AtSEC3A胞外囊亚单位在质膜上相互作用 [12] 植物具有进化上保守的外囊复合体 [40] 基于突变分析,这与极化分泌、细胞形态发生和模式的调节有关 [40] —— [43] PINs与膜的结合减少,在细胞内积累 集成电路1 突变背景( 和 图S8 , 第9部分 , 第10页 , 第11条 )以及BFA洗脱后PIN2向质膜的募集较慢( )表明ICR1和可能的胞外依赖性胞吐作用于或靠近质膜是PIN定位所必需的。 因此,在没有ICR1的情况下,由于内吞再循环,PIN蛋白在细胞中降解或积累。 PIN1和PIN2的基尖位移与PINOID(PID)蛋白激酶的功能以及BFA不敏感途径有关 [14] , [31] 。在 集成电路1 表明ICR1对该BFA不敏感途径有减少或无影响。
ROPs通过翻译后脂质修饰的丙内酰化或 S公司 -保守的C-末端半胱氨酸残基上发生的酰化反应 [1] , [7] , [8] , [9] , [44] 此外,至少一些ROP也经历激活依赖性瞬态 S公司 -酰化作用和随后的分裂成耐洗涤剂的膜,可能是脂筏 [9] 与质膜内叶的结合还需要一个靠近脂质修饰半胱氨酸的多基结构域 [8] 已经表明,Rho蛋白中的多元性结构域与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PtdIns-P2)和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PtdIns-P3)结合 [45] 一直以来,在花粉管顶端,ROP/RAC蛋白与磷脂酰肌醇单磷酸激酶(PtdIns P-K)活性有物理关联 [46] 和PtdIns P-K的产物PtdIns-P2具有相似的分布 [46] , [47] 当在花粉管中表达时,ICR1/RIP1和ROP1在生长尖端稳定了彼此的膜定位,表明ICR1除了与ROP相互作用外,还可能与膜中的其他成分相互作用 [13] 因此,ROP-ICR1亚细胞定位的测定涉及多种机制,包括不同的蛋白-脂质修饰、分裂成离散的膜微域、与磷脂酰肌醇结合,以及可能与未知成分结合。
在根尖,GFP-ICR1的定位逐渐与质膜相关,并在距离稳定生长素最大值较远的细胞中极化( ). 这表明ICR1的膜定位和极化受到局部调节,可能是由局部生长素梯度相关机制调节的。
生长素通过抑制PIN内吞作用调节其从细胞的极性流出 [48] 并可能通过调节ICR1的表达(本研究)。 因此,ICR1可能是促进生长素外排的生长素调制正反馈回路的一部分。 根中的ICR1表达( )与生长素通量模式和PIN4在发育不全、QC和小柱初始生长素最大值部位的非极性定位一致 [14] , [33] 在初生根的大多数区域,ICR1的表达仅限于中柱( ). 表达模式在两个区域发生变化:(1)侧根创始细胞和首字母;(2)根尖周围,在表皮、皮层、内胚层和根冠中检测到表达。 稳定的生长素最大值和根尖的局部梯度与特定基因的表达有关。 其中一些基因的表达水平与生长素水平相关 [27] , [34] , [49] QC和分生组织干细胞中ICR1表达的抑制可能与一个或一些生长素最大特异性基因有关。 快速归纳 国际资本市场1 生长素的表达和 pICR1基因 -通过局部应用生长素驱动的GFP-ICR1进一步表明,生长素对ICR1在生长素最大部位表达的抑制是由生长素间接调节的。 有趣的是 HALTEDROOT公司 ( HLR公司 )编码RPT2a 26S蛋白酶体亚单位的基因与 集成电路1 .喜欢 集成电路1 ,根分生组织 hlr公司 崩溃,QC丢失,几个标记的表达模式包括 可控硅 和 SHR公司 已更改 [50] 。相比之下 集成电路1 然而,与WT相比,在6-d大鼠中观察到了额外的小柱细胞层 hlr公司 幼苗,在 集成电路1 年龄相近的植物,小柱的规格显著降低( ). 在 集成电路1 当 pICR1 ≫ 绿色荧光蛋白-ICR1 植物被蛋白酶体抑制剂处理(未公布的数据)。 因此,目前尚不清楚蛋白酶体是否参与ICR1表达的调节。
基于计算模型,已经提出PIN介导的生长素在根部的通量足以维持生长素的稳定最大值 [51] .这项工作的结果( )暗示抑制ICR1表达,可能还调控其亚细胞定位形成稳定的生长素最大值。 稳定的生长素最大值可能促进正反馈回路,维持ICR1表达的抑制及其在直接近端和对端细胞中的分布。
本构活性ROP诱导的细胞变形与肌动蛋白和MT细胞骨架的重组以及质膜上小泡的摄取受损有关 [1] , [2] ICR1的异位表达诱导叶表皮铺装细胞和根毛的变形 [12] 还有花粉管 [13] ,类似于激活的ROP突变体的作用。 因此,ICR1可以作为一种支架,促进ROP和其他蛋白质(如特定膜域的外囊复合体)的分隔 [12] 这也表明ICR1可能参与各种过程的调节。
ROPs通过包括RIC1(包含1的ROP相互作用CRIB)、RIC3和RIC4的蛋白质调节细胞骨架组织,从而协调细胞极化 [52] , [53] 、ADF/Cofilin [54] 、WAVE和Arp2/3复合物 [55] , [56] 如本工作所示,并基于之前的调查结果 [12] ROP-ICR1相关的细胞极化机制需要用于胞膜募集和PIN蛋白的极性定位,从而指导生长素的运输。
材料和方法 分子克隆
PICR1::LhG4
这个 国际资本市场1 通过使用寡核苷酸引物SYP1502从基因组DNA中扩增起始ATG密码子上游2050 bp的片段来克隆启动子( CCGGTACTTTTGATTCGTGTTGAGG公司 )和SYP1503( CGTGTCGACCCTCCTACAAGTGTGG公司 )并克隆到pGEM(Promega)中。 用Kpn1和Sal1消化所得质粒(pSY1500),并将所得片段亚克隆到合成转录因子基因上游的pLhG4-Bj36中 LhG4型
[35] , [36] 生成pSY1501。 用Not1消化pSY1501 pICR1-LhG4基因 将该片段亚克隆到植物二元载体pART27中,得到pSY1502。
pOp::GFPICR1
一个2339 bp的基因组片段 国际资本市场1 ,包括该基因的整个5′-UTR、外显子、内含子和3′-UTR,被克隆到植物二元载体pMLBART中,如下所示: 国际资本市场1 用寡核苷酸引物SYP321从基因组DNA中扩增5′-UTR( CAGCAATGGGACGTCAATTTGATCAGC公司 )和SYP322( ATTATATCTCAACACGAATCAAACCATGGCTG公司 ),用NcoI消化并在上游亚克隆 GFP公司 在pGFP-MRC中 [57] 生成pSY350。 基因组 国际资本市场1 用引物SYP323从基因组DNA中PCR扩增起始ATG密码子的基因( CTAGAGCTCATGCCAAGACAAGGTACG公司 )和SYP324( GCAGGTACCGTTTAAACGGGTTCTCCATTTACGA公司 ),用SacI和KpnI消化并亚克隆到 GFP公司 从而得到pSY351。 pSY351依次用SalI和KpnI消化,得到的片段包含 pICR1-5′UTR′-GFP-ICR1 基因组学 -ICR1-3′非屏蔽双绞线 将其亚克隆到pOPTATABJ36中,得到pSY352。 pSY352依次用NotI消化,得到的片段被亚克隆到植物二元载体pMLBART中,得到pSY353。
pOp::他的 6 -GFP-rop6型 加利福尼亚州
pSY812质粒含有 伊斯 6 -GFP-rop6型 加利福尼亚州 如前所述准备 [9] 用XhoI消化.pSY812。 生成的片段包含 伊斯 6 -GFP-rop6型 加利福尼亚州 被亚克隆到p10Op-Bj36中 [36] 以获得pSY819。 反过来,用NotI消化pSY819,得到的片段包含10个 Op-His公司 6 -GFP-rop6型 加利福尼亚州 -接触网 将终止子亚克隆到植物二进制载体pMLBART中 [35] , [36] 以获得pSY818。 转录-转录系统中的表达 [35] , [36] 通过跨越 启动子::LhG4 激活器线路及其各自的 pOp::报告人 线。
q-PCR(定量PCR) 根据制造商的说明,使用“SV Total RNA isolation”分离总RNA(麦迪逊州普罗米加)。 使用Super ScriptII逆转录酶(Invitrogen Carlsbad,美国)进行cDNA第一链合成。 用寡核苷酸引物集SY1582进行定量: TCAAAATGCCAAGACACAGA公司 和SY1583: TTGGAATGTGAATTCAGAAG公司 使用ABI Prism 7700 StepOnePlus™仪器(德国魏特斯塔特应用生物系统公司)通过q-PCR进行。 研究样品在最终体积为10µl的8孔光学PCR条带(Applied Biosystems)上一式三份进行。 引物是使用罗氏通用探针库设计的( https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/index.jsp ). PCR循环如下:在95℃下初始变性10 min,然后在95℃进行40个后续的15 s变性循环,以及在60℃下退火1 min和伸长率。 根据制造商的说明(德国魏特施塔特应用生物系统公司),通过熔融曲线分析确定独特扩增产物的特异性。 通过ddCt方法计算RNA的相对数量(Applied Biosystems Incorporated(2001),用户公告#2:ABI PRISM 7700序列检测系统, http://www.appliedbiosystems.com ). 制备cDNA稀释序列,计算扩增效率系数。 根据扩增效率系数计算RNA的相对水平,并根据 UBQ21(UBQ21) 基因标准 [58] ,其级别为1。 使用geNorm分析工具验证每个实验中标准的稳定性( http://medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/ )并计算为 M(M) ≤0.7. 用三个独立的生物复制品重复分析。
植物生长条件 WT种子 哥伦比亚-0 ( 第0列 )和突变拟南芥植物被播种在土壤上(通用盆栽土壤,以色列塔夫莫拉姆戈兰),并在4°C下放置2 d。 然后,将植物转移到生长室,并在22°C的长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗循环)生长。 光强度为100µE m −2 秒 −1 为了进行幼苗分析,种子被表面消毒,并播种在含有0.5×Murashige&Skoog(0.5×MS)盐混合物(Duchefa)的平板上,用MES和KOH、1%蔗糖和0.8%植物琼脂(Duchefa)滴定至pH 5.5,并在4°C下静置2d。 然后将平板转移到生长室,并在22°C的长日照条件下(16小时光照/8小时暗循环)生长指定的时间。 光强度为100µE·m −2 ·秒 −1 在生长素诱导试验中,幼苗在平板(如上所述)上发芽5d,然后转移到液体培养基(0.5×MS)中,并在施用NPA(10µM)或NAA(10μM)之前再生长2天。
药物和染料治疗与血浆溶解
BFA(Fluka)治疗 将2至3日龄幼苗浸入25、50或90µM BFA(由DMSO中的100 mM储备溶液制备)和4µM FM4-64(由DMMO中的1 mM储备液制备)中,并在室温下在0.5×MS液体培养基中稀释1-2小时。 对于对照处理,将幼苗浸入含有4µM FM4-64的0.09%二甲基亚砜溶液中。 为了进行胚胎的BFA处理,在立体显微镜下从胚珠中分离心脏期和鱼雷期胚胎,并立即转移到添加1%蔗糖的0.5×MS液体培养基中。 在黑暗中用50µM BFA和5µM FM4-64在玻璃载玻片上处理解剖胚胎1–2 h,并使用共焦激光扫描显微镜(CLSM)用63×水浸(无盖滑动)物镜进行观察。
丙二醛(PI)染色 幼苗置于浸没在显微镜载玻片上的50µg/ml PI水溶液中。
通过在0.8 M NaCl中培养离体叶片5分钟来进行血浆溶解 [7] .
GUS染色 如前所述进行β-葡萄糖醛酸酶(GUS)染色 [59] 除幼苗浸泡在染色液中2h,然后在水合氯醛/甘油/水(8∶1∶2)或70%乙醇中澄清外。
拟南芥胚胎的清除 如前所述,清理拟南芥胚胎 [60] 简而言之,生长中的西力克是从土生植物中收获的,并在立体显微镜下解剖。 收集单个西力克羊的胚珠,并在室温下将其固定在乙醇/乙酸(6∶1)中1-4h。 然后,在100%乙醇中清洗胚珠三次,每次5分钟,在70%乙醇中清洗一次。 然后,将胚珠在透明溶液(水合氯醛/甘油/水8∶1∶2 v/v)中培养24 h,安装在含有30%甘油的载玻片上,并用Nomarsky微分干涉对比(DIC)光学观察。
淀粉染色 将指定年龄的幼苗转移到Lugol(IKI-0.2%w/v碘和2%碘化钾)中,并孵育3分钟。然后用水短暂清洗Lugol染色的幼苗,并用清洁溶液(30%甘油中的水合氯醛)将其安装在载玻片上。
局部生长素诱导 小固体培养基(0.5×MS,1%蔗糖,中性红,0.8%植物琼脂)颗粒,约1 mm 2 将直径为10µM的NAA(含或不含NAA)涂敷在垂直生长的7 d龄树根上 pICR1基因 ≫ 绿色荧光蛋白-ICR1 基因组学 幼苗高于根尖5毫米。 治疗24小时后观察GFP-ICR1的表达。
光和共焦激光扫描显微镜 Nomarsky/DIC成像是使用配备Axio-Cam冷却电荷耦合器件(CCD)相机的Axioplan-2成像显微镜(德国耶拿卡尔蔡司)进行的,使用数值孔径(NA)值为1.3的40×或100×油浸物镜或数值孔径为1.2的63×水浸物镜。 采用Olympus MVX10荧光立体显微镜进行低倍成像。 使用Leica TCS-SL CLSM进行CLSM成像,使用20×多浸没、63×水和63×水浸没(无盖滑动)物镜,NAs分别为0.7、1.2和0.9。
荧光标记的可视化 在488nm处用氩激光激发观察GFP。 使用505 nm到530 nm之间的光谱检测器检测发射。 通过514nm氩激光激发和525-560nm光谱检测器检测发射,可见YFP。 用氩激光在514nm激发FM4-64。 发射是通过设置在530 nm和560 nm之间的光谱检测器检测的。 在514nm激发下观察PI。 将光谱检测器设置在600至650 nm之间检测发射。
BFA洗脱试验 四天一次 GFP-引脚2 和 GFP-PIN2 icr1 用50µM BFA处理幼苗1h,然后用0.5×MS培养基冲洗2h。为了计算带有BFA小体的表皮细胞,每个品系和处理至少使用15根。 实验重复了三次。 使用Student’s t吨 测试。
分泌物分析 如前所述进行分泌物分析 [38] , [39] .转基因拟南芥纯合系表达 35S::秒GFP 在中 第0列 背景被交叉到 集成电路1 二者的T2子代纯合子 集成电路1 选择secGFP。 幼苗在0.5×MS培养板(pH 5.5)上生长,并添加1%蔗糖,持续指定时间。 WT和 集成电路1 使用徕卡LCS LSCM在相同条件下,使用10倍物镜、完全打开的针孔(600µm)和如上所述的GFP发射/激发,采集根尖。 使用Image-J在距根尖500µm的区域测量平均信号强度。使用相同根的DIC图像调整测量区域。 在每个实验重复中使用每个品系的至少20个幼苗。 使用Student’s t吨 测试。
外界pH值对secGFP荧光的影响 为了比较外部pH值为5.5和8.5时的secGFP荧光,幼苗在pH为5.5的0.5×MS培养板上生长5 d,补充1%的蔗糖,然后转移到0.5×MS液体培养基上3 h,用MES或KOH滴定至pH 5.5或8.5,并补充1%蔗糖。
支持信息 图S1
早期发育异常
集成电路1
胚胎。 (A–F) 第0列 ,(G–L)90% 集成电路1 早期胚胎发育正常的子代,(M–P)10% 集成电路1 具有早期基底缺陷的后代。 (A和G)1-细胞期,(B和H)4-细胞期,,(C、I和M)8-细胞期、(D、J和N)16-细胞期,以及(E、K和O)早期球状期和(F、L和P)晚期球状期。 h、 垂体; lc,透镜状细胞; llc,下部大细胞。 箭头(M和N)表示垂体和胚柄分裂异常; (O和P)中的垂直括号表示未成形的基底区。 条形对应于所有图像的10µm。
(1.88 MB畅通节能法)
图S2
后期异常发展
集成电路1
胚胎。 (A–D)三角台,(A) 第0列 和(B–D) 集成电路1 .(B)中的箭头表示胚柄和胚柱的初始分裂异常; (C和D)中的箭头表示原皮细胞分裂异常。 (D) (C)中箭头高亮部分的放大。 (E–K)心脏早期/中期,(E和J) 第0列 ,(F–I和K) 集成电路1 (G–I)中的箭头表示原皮层分裂异常。 (J)中的箭头表示WT柱的正常斜周分裂。 (K)中的箭头指向 集成电路1 胚胎。 (L–S)弯曲的子叶阶段,(L、N、P和R) 第0列 、和(M、O、Q和S) 集成电路1 (N和O)根分生组织扩大(RM)。 (O)中的箭头表示小柱的异常分裂。 (L和M)中的竖线表示(P和Q)中所示的放大区域。 pd,原皮; pc,原形成层; col,小柱首字母; QC,静止中心; v、 血管组织; 表皮; c、 皮层; 恩,内胚层。 棒材对应于20µm(A–m)、10µm。
(3.72 MB TIF)
图S3
集成电路1
西力克表现出更大的发育变异性。 堆积巴氏图显示了从12个具有代表性的西力克中采集的胚胎的发育阶段。 (A) 第0列 和(B) 集成电路1 不同年龄的西力克。 每一种颜色都有一个单独的菱形。 颜色的高度混合 集成电路1 突变体表明一个单晶硅内胚胎发育的同步性受到损害。 注意胚胎致死 集成电路1 胚胎被排除在外。
(0.22 MB畅通节能法)
图S4
异常
DR5(数字参考5)
中的响应
集成电路1
胚胎。
DR5版本 ::ER-GFP在WT和 集成电路1 胚胎。 (A–E和L) 第0列 ,(F–K) 集成电路1 (A和F)早期球状阶段,(B和G)三角形阶段,(C和H)早期/中期心脏阶段,以及(D、E和I–L)晚期心脏阶段。 面板(K)和(L)分别是(D)和(I)RM的放大。 箭头表示发育中的子叶中存在生长素积累点。 (C、D、H、I、K和L)中的箭头表示QC的位置。 (E和J)中的箭头表示生长素通过血管外组织向下运动。 (A–J)多个共焦截面的最大投影Z叠加; 整个RM中心的(K和L)单共焦扫描。(A–D、F–I、K、L)为荧光/DIC叠加图像。 (E) 和(J)是荧光图像。 GFP荧光以绿色显示。 棒材相当于20µm。
(2.37 MB畅通节能法)
图S5
的异常表达模式
pWOX5::
ER-GFP输入
集成电路1
胚胎。
WOX5型 首次在球形期胚胎中检测到表达。 在WT胚胎中,可以在晶状体形状和上胚柄细胞中看到表达。 在 集成电路1 球形和心脏期胚胎的表达扩散到透镜状细胞(箭头)附近的细胞。 成人 集成电路1 胚胎结实 WOX5型 表达于下胚轴下部(箭头)和子叶中。 相比之下,成年WT胚胎 WOX5型 在QC和子叶中检测到表达。 然而,子叶中的表达较弱,需要使用高灵敏度的检测器进行检测。 条形对应于10µm球形胚胎、20µm心脏期胚胎和50µm成人胚胎。
(2.19 MB畅通节能法)
图S6
的表达模式
可控硅
在中更改
集成电路1
胚胎。 的表达式模式 可控硅 由确定 pSCR:: YFP-His2b报告者被视为黄色细胞核。 WT球形胚胎 可控硅 在垂体、基底分生组织和血管前细胞中表达。 插图是多个共焦扫描的投影堆栈。 在心脏期,表达扩大到QC细胞。 在成年胚胎中,在QC和胚胎根的未来内胚层以及下胚轴中检测到表达。 注意下胚轴和胚根之间表达模式的明显差异(用矩形和弧形括号表示)。 在弯曲的子叶胚中,表达仅限于胚胎根的QC和内胚层/皮层干细胞。 子叶中检测到低水平表达。 的异常表达模式 可控硅 出现在球状阶段 集成电路1 早期发育异常的胚胎(箭头)。 心脏期 集成电路1 胚胎表达扩散到其他细胞(箭头)。 与WT相似,在成熟期 集成电路1 胚胎 可控硅 在胚根和下胚轴中检测到表达。 然而,与WT胚胎不同,胚根和下胚轴之间的表达模式没有明显区别。 在弯曲的子叶中 集成电路1 胚胎 可控硅 表达仅限于胚根,但与WT胚(箭头)相比,表达更广泛。 条形对应于10µm球形胚胎、20µm心脏期胚胎和50µm成人胚胎。
(1.78 MB TIF)
图S7
叶脉组织的分化
集成电路1
受到损害。 玫瑰花结的横切面离开了中央血管链。 血管链的缩小 集成电路1 很明显。 还要注意叶肉细胞形状的改变和 集成电路1 叶子。 棒材相当于20µm。
(1.82 MB TIF)
图S8
高分辨率图像显示PIN1和PIN2在
集成电路1
根。 箭头表示PIN定位在单元格中的方向。 棒材厚度为20µm。
(1.72 MB TIF)
图S9
pPIN1码
-在WT和
集成电路1
根。 GFP-PIN1在3 DAG初级根中的表达 第0列 (A至C)和 集成电路1 (D到F)。 (A和D)DIC和GFP荧光之间的重叠,(B和E)GFP和(C和F)PIN1-GFP表达的根部用5µM FM4-64染色。 (C和F)中的插图是RM的特写视图。(G–I) pPIN1码: GFP-PIN1在根毛和表皮中的表达。 (G) 第0列 (H和I) 集成电路1 (H)中的箭头表示表皮和根毛中的异位表达。 (I)中的箭头表示GFP-PIN1在体内的堆积。 (A、B、D和E)多个共焦切片的最大投影Z堆栈。 (C、F和G–I)单次共聚焦扫描。 (A、D、G和H)是荧光/DIC叠加图像。 (B、C、E、F和I)是荧光图像。 (C和F)是GFP/FM4-64覆盖图像。 GFP荧光以绿色显示,FM4-64以红色显示。条形对应于20µm(A到F)和50µm的(G到I)。
(2.42 MB TIF)
图S10
的本地化
pPIN2码
-驱动GFP-PIN2英寸
集成电路1
根。 (A) WT和 集成电路1 表示根 pPIN2码 ::GFP-PIN2,4 DAG时用FM4-64染色。 白色方框表示右侧面板上显示的放大区域。 WT中的箭头标记GFP-PIN2在表皮和皮层基底部的顶端定位。 注意GFP-PIN2在表皮和皮层的顶端化 集成电路1 根(箭头)。 (B) BFA处理WT和 集成电路1 幼苗导致FM4-64和GFP-PIN2在BFA隔室(箭头)中共存。 棒材相当于20µm。
(3.97 MB TIF)
图S11
修改后的
pPIN1码
-驱动GFP-PIN1本地化
集成电路1
胚胎。 (A–D、I和J) 第0列 、(E–H、K和L) 集成电路1 表现出轻微基底缺陷的胚胎(M和N) 集成电路1 具有强烈基础缺陷的胚胎。 (A、B、E和F)中期球状期,(C、D、G、H、M和N)三角形期,(I–L)心脏期。 (B、D、F、H、J和L)中的箭头表示GFP-PIN1定位的方向,在原膜细胞中为基底,在原皮细胞中为顶端。 (M和N)中的箭头表示PIN1-GFP在基底区的表达缺失 集成电路1 具有强烈基础缺陷的胚胎。 (I和K)中的插图是正在发育的子叶的放大图。 (A、C、E、G、I、K和M)多个共焦截面的最大投影Z堆叠。 (B、D、F、H、J和N)整个胚胎中心的单次共聚焦扫描。 (A、C、E、G、I、M和K)是荧光/DIC叠加图像。 (B、D、F、H、J、L、N以及插入I和K)是荧光图像。 GFP荧光以绿色显示。 棒材相当于20µm。
(2.87 MB畅通节能法)
图S12
总结WT和WT中PIN1定位、生长素分布和模式的模型
集成电路1
胚胎。 WT(A)和 集成电路1 胚胎(B和C)。 (A) PIN1极性膜定位介导发育过程中胚根分生组织和未来子叶顶端生长素的定向流动和生长素最大值的出现。 (B) PIN1极性降低导致生长素通量减弱,并逐渐破坏生长素最大值的形成 集成电路1 具有晚期图案缺陷的胚胎。 (C) 在 集成电路1 早期模式缺陷的胚胎PIN1膜定位和极性受到强烈影响,可能导致生长素非极性分布(交叉箭头)。
(1.24 MB畅通节能法)
图S13
这个
pICR1::LhG4
和
pOp::ICR1 5′-UTR -绿色荧光蛋白-ICR1 基因组学
构造。 (A) pICR1 受驱动的效应器/报告器线。 这个 长G4/pOp 系统允许来自同一效应器的不同报告者表达,从而减少对基因表达的位置效应 [35] , [36] 在这项工作中,GFP-ICR1、GFP-rop6 加利福尼亚州 和GUS是使用相同的pICR1效应器系表达的。 (B) 的示意图 pICR1 发起人。 (C) GFP-ICR 基因组学 构造。
(0.30 MB畅通节能法)
图S14
生长素诱导ICR1表达。
pICR1 ≫GUS在NPA上生长或NAA诱导6小时后表达。箭头表示NAA处理后周周期细胞中的GUS表达。 棒材相当于50µm。
(2.96 MB TIF)
图S15
根系生长的互补性
集成电路1
GFP-ICR1突变体。 GFP-ICR1的表达由ICR1启动子使用转录/反式激活系统驱动(参见 图S12 ). 棒材相当于100µm。
(0.61 MB畅通节能法)
图S16
血浆溶解后检测到GFP-ICR1的质膜定位。 在质壁分离前后,PI染色的GFP-ICR1表达叶表皮铺装细胞。 底部的大面板是等离子分解后覆盖面板的放大。 红色箭头表示细胞壁,白色箭头表示分离的质膜。 质壁分离后检测到的荧光绿色斑块表明,一些GFP-ICR1没有附着在质膜上。 棒材相当于20µm。
(5.46 MB TIF)
图S17
质外体pH值对secGFP荧光的影响及其在WT和
集成电路1
根。 (A) WT和 集成电路1 将5 DAG的根转移到滴定至pH 5.5或pH 8.5的液体MS培养基中培养3小时。 误差条对应SE, n个 ≥20,**在pH 8.5和5.5之间检测到WT根的荧光存在显著差异( 第页 ≤0.01; 学生的 t吨 测试)。 荧光差异 集成电路1 pH值在8.5和5.5之间不明显( 第页 ≥0.72). (B) 在MS培养基中培养的WT根滴定至pH 8.5,PI染色(红色)。 箭头表示secGFP的质外体定位。 (C) 安 集成电路1 在MS培养基中培养的根滴答作响,pH值为8.5,并用PI染色(红色)。 请注意,GFP荧光仍在细胞内。 棒材相当于10µm。
(0.46 MB畅通节能法)
表S1
频率
集成电路1
−/− 在指定的发育阶段表现出图案缺陷的胚胎。 *具有强烈基底缺陷的胚胎被排除在分析之外。 1 在1细胞、2细胞、4细胞、8细胞(辛特)和16细胞(皮肤原)阶段对胚胎进行分析。
(0.04 MB文件)
视频S1
的表达式
pICR1
≫GFP-ICR1位于根尖。 这部电影强调了在QC及其周围缺乏ICR1表达。
(10.12 MB AVI)
致谢 我们感谢Ben Scheres、Viktor Zarski、Yuval Eshed和俄亥俄大学拟南芥生物研究中心提供的材料,以及特拉维夫大学植物科学系的Manna中心提供的设备支持。
缩写 农业研究基金 ADP核糖基化因子 博鳌亚洲论坛 布雷费尔丁A 英国石油公司 基极对 加利福尼亚州 本构激活 CLSM公司 共焦激光扫描显微镜 第0列 哥伦比亚-0 DAG公司 发芽后天数 驾驶员信息中心 差分干涉对比度 联邦铁路管理局 光漂白后的荧光恢复 全球环境基金 鸟嘌呤核苷酸交换因子 GFP公司 绿色荧光蛋白 GUS公司 β-葡萄糖醛酸酶 HLR公司 HALTEDROOT公司 国际资本市场1 本构主动ROP 1的交互因子 微软 Murashige&Skoog公司 机器翻译 微管 NAA公司 萘乙酸 国家行动计划 1-N-萘基邻苯二甲酸 圆周率 碘化丙锭 PID(PID) 松果体 PIN码 针状的 铂族锡P-K 磷脂酰肌醇单磷酸激酶 质量控制 静止中心 q-PCR(定量PCR) 定量实时RT-PCR 独立电源1 ROP相互作用蛋白1 机械钻速 植物Rho 玫瑰红 活性氧物种 可控硅 SCARECRAW公司 SHR公司 SHORTROOT公司 UTR公司 未翻译区域 WOX5型 WUSCHEL相关同源异型盒5 重量 野生型
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