胃癌患者外周血中Survivin基因水平独立预测生存率

摘要

背景

胃癌是世界上第四大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。目前估计的胃癌发病率约为16.2/10万人/年（世界标准化率，WSR），东亚、东欧和南美洲发病率最高[1]. 目前，唯一一个常规用于胃癌患者管理的预后系统是基于国际抗癌联盟肿瘤结节转移（TNM）分期系统[2]其中肿瘤浸润程度（pT）和淋巴结状态（pN）[三]是无远处转移疾病患者的两个主要预后指标。处于早期阶段的患者被认为是通过手术治愈的候选者。然而，50%的胃癌患者即使在根治性手术后也会复发[4,5]. 因此，目前的分期系统似乎无法准确预测单个患者的癌症复发风险。事实上，该分类确定了各阶段具有显著不同预后亚组的广泛类别，这使得该系统不适合个性化治疗方法。一些目前被归类为“低风险”的患者没有接受辅助治疗，尽管他们确实经历了疾病复发，这一事实证明了这一点。反之亦然，由于“高危”TNM分类，一些目前正在接受辅助治疗的患者不需要这种治疗[6]. 为了解决这个问题并改善患者的预后，迫切需要新的可靠预测患者预后的参数。接受过可能治愈的手术的患者仍有复发的风险，这种风险源于显微镜下的肿瘤残留，即微小残留病（MRD）。MRD会影响不同的身体部位，包括骨髓、淋巴结和外周血[7]. 近年来，一些研究集中于检测循环肿瘤细胞（CTC）对胃癌患者的临床意义。因此，定量实时聚合酶链反应（qrtPCR）及其变体被认为是评估基因表达最敏感的方法，已用于检测血液中存在CTC的肿瘤标记物[8].

在当前的分析中，我们旨在使用qrtPCR对70例胃腺癌患者的外周血进行分析。我们测试了四个生物标志物，其中两个是肿瘤的存在，两个是其侵袭性，其中一个是Survivin，它为TMN分期系统增加了独立的预后能力。这可能会更好地分层患者的风险，从而更好地进行治疗管理，尤其是在辅助治疗环境中。

方法

结果

细胞尖峰：qrtPCR技术的敏感性

在N87细胞系中，CEA、CK19、Survivin和VEGF基因的mRNA水平高表达（图​（图1）：1)因此，该胃癌细胞系代表了我们实验的有效阳性对照。

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图1

N87人胃癌细胞中四个相关基因的基因表达水平（通过定量实时PCR测定：详见正文）表达水平的自然对数在y轴上报告：轴原点（0）表示参考样品（称为校准器），在相对定量方法中，所有实验样品都与该参考样品进行比较（详见正文）。

为了确定qrtPCR技术的检测限（灵敏度），使用CEA和Survivin作为基因标记物，用qrtPCR对N87胃癌细胞的连续10倍稀释液（PBMC）进行了三次检测。CEA和Survivin mRNA检测到1个细胞/10⁸PBMC稀释：这相当于每10毫升外周血中发现1到10个恶性细胞（数据未显示）。

血样中的表达标记

对所有70名患者的外周血样本进行四种基因标记物的评估。Survivin、CK19、CEA、VEGF的阳性表达率分别为98.6%、97.1%、42.9%、38.6%（高于校准品）（表​（表2）。2). 由于在几乎所有患者中发现的Survivin和CK19基因水平都高于健康对照组，这些发现表明这两种基因具有诊断潜力。

表2

胃癌患者外周血中四种预后标志物的转录水平。

标记	高于校准器（%）*	低于校准器（%）*	不可检测（%）
Survivin公司	69 (98.6)	1 (1.4)	0 (0.0)
CK19型	68（97.1）	2 (2.9)	0 (0.0)
CEA公司	30 (42.9)	21 (30.0)	19（27.1）
血管内皮生长因子	27 (38.6)	43 (61.4)	0 (0.0)

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*通过实时定量PCR测量基因表达水平：使用相对定量方法，将样本分为高于或低于校准品中的水平（来自健康献血者的合并外周血样本）。

此外，如果我们考虑每个阶段Survivin表达水平的第75个百分位，那么从I到III阶段，我们有显著的增加趋势（p=0.04），但阶段IV没有（图​（图22).

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图2

70例TNMⅠ～Ⅳ期胃癌患者外周血Survivin基因水平的检测趋势测试分析显示，I至III期胃癌患者的Survivin转录水平显著增加（趋势测试P值=0.04）。报告每列的平均值±SD。

生存分析

平均随访26个月后，TNMⅠ-Ⅱ期患者的中位总生存率（OS）未达到；第三阶段和第四阶段的平均OS分别为25个月和13个月（log-rank检验P值<0.0001，图​图3三).

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图3

所有患者TNMⅠ-Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期的总生存率（log-rank检验P值<0.0001）。

在单变量生存分析中，在我们测试的四个基因中，只有Survivin表达可以识别出预后显著不同的两个患者组。事实上，考虑到对数转化基因转录水平的第75个百分位（1.508）作为临界点，高（>1.508）和低（≤1.508）Survivin mRNA丰度的中位数OS分别为14个月和41个月（log-rank P值=0.036，图​图44).

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图4

外周血中Survivin转录水平高（>75%）或低（<75%）患者的Kaplan-Meier生存曲线.对数-秩检验P值=0.036。

多变量生存分析包括TNM分期、年龄、性别和四个标记物的mRNA水平，结果表明，只有外周血中测得的TNM分期和Survivin mRNA水平才能独立预测患者的OS。与Survivin水平相关的危险比（HR）表明，Survivin-表达增加100倍，死亡风险增加（表​（表3三).

表3

70例胃癌患者的多因素生存分析。

协变量	人力资源	95%置信区间		P值
		下限	上限
TNM第一阶段	1（参考）	-	-	-
第二阶段	1.20	1.01	1.45	0.048
第三阶段	1.34	1.05	1.70	0.017
第四阶段	3.17	1.38	6.77	0.004
幸存者*	1.34	1.14	1.53	< 0.001

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HR：危害比；CI：置信区间；*与Survivin水平相关的HR表明，Surviwin表达增加100倍，死亡风险增加。

由于Cox模型仅保留了这四个独立变量，因此该分析表明，Survivin基因表达可以为TNM分期系统等成熟因素添加有用的预后信息。

讨论

在这项研究中，我们发现胃癌患者外周血中Survivin的转录水平与他们的总体生存率独立相关。

如果在更大规模的前瞻性研究中得到验证，这些结果将有助于提高传统预后因素的预后能力，而传统预后因素目前由TNM分期参数体现。这对TNM I至III期疾病患者尤其重要，对他们来说，最佳风险分层对于确定最有可能从辅助治疗中获益的受试者至关重要。

从肿瘤生物学角度来看，我们的发现也具有特别的相关性，因为Survivin基因编码一种关键的抗凋亡蛋白，属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族。除了是最具特征的抗凋亡因子之一之外[14]，Survivin是深入研究的对象，因为在成年人中，它实际上只由不同来源的癌症选择性表达；此外，其在原发肿瘤中的表达与预后不良和对常规化疗的耐药性有关[15]. 这些观察结果使Survivin成为肿瘤特异性治疗的理想靶点，如小分子抑制剂和抗原特异性免疫治疗[16].

Survivin蛋白在包括胃癌在内的原发性肿瘤中的表达已被研究为预后因素，较高水平与癌症预后较差相关[17]. 关于RNA表达，Survivin mRNA水平已被作为不同类型癌症中循环肿瘤细胞（CTC）的标志物进行了研究，但现有数据很少[18,19]. 在26名胃癌患者中，外周血中的Survivin mRNA（通过基于ELISA的qrtPCR测定）与患者预后相关，TNM分期被排除在最终的多变量模型之外（将所有变量强制纳入Cox模型）[20]. 在我们的更大系列（n=70）中，虽然TNM分期在最终的多变量模型中仍然是一个重要的预后因素（使用逐步模式进行变量选择），但Survivin血水平的预后作用得到了证实。尽管与患者预后显著相关，但Survivin mRNA水平在所有四个TNM分期中均未增加：事实上，转录丰度增加的趋势仅在I至III期疾病患者中表现出来（图​（图2）。2). 这一发现可能取决于单个TNM分期的低样本量（以及由此产生的低统计能力），但也可能表明Survivin在局部而非远处转移性疾病中发挥作用（如最近报道的那样，其他基因可能更相关[21]).

与其他研究不同[9,22-26]CK19和CEA水平与我们系列中的患者生存无关，无论是单变量（数据未显示）还是多变量生存分析：这可能取决于几个因素。首先，在我们的多变量分析中（采用逐步变量选择模式）包含了其他作者未考虑的标记，这使得任何比较都不可行。

值得注意的是，一些阳性报告只使用单变量生存分析，一旦对已确定的预后因素（即TNM分期）进行了调整，就会危及其结果的可靠性和再现性[9,25,27,28]. 此外，根据我们的结果，其他研究人员确实报告了细胞角蛋白阳性细胞的存在与预后之间缺乏关联[29]（表​（表44).

这些相互矛盾的数据可能取决于这样一个事实，即CK19和CEA是CTC存在的标志，但不一定是CTC转移能力的标志：事实上，人们普遍认为，只有一部分CTC具有引起转移性沉积物的生物潜力，而大多数CTC最终死亡时对宿主没有危害[7]. 因此，CTC“攻击性”标记物，如Survivin，在与患者预后的相关性方面可能更具信息性。

值得注意的是，在本研究中，Survivin和CK19的mRNA丰度始终大于健康对照组，但分别有一例和两例除外。这强调了使用定量方法（qrtPCR）的重要性，该方法使我们能够在连续范围内对患者风险进行分层，而标准PCR实际上会将所有患者归类为阳性。另一方面，据我们所知，这一发现以前从未报道过，这表明这些基因也可能被用于诊断目的，尽管有必要进行专门为此目的设计的研究。

最后，我们希望观察到，基于PCR的方法不允许识别被测标记物的细胞来源：事实上，所有这些方法都需要分解从患者外周血中采集的细胞，以提取用于评估目标基因表达的mRNA。除了CTC，PCR检测基因的其他潜在来源是PBMC、循环内皮细胞（CEC）、骨髓来源的循环干细胞以及在抽血过程中污染样本的皮肤细胞（如角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞）。然而，CTC可能是Survivin的主要细胞来源，因为其在正常成人组织中的表达非常有限，而主要局限于恶性细胞[30]. 在这方面，细胞学方法不太容易出现假阳性结果，因为它们意味着先进行基于抗体的细胞分类，然后进行肿瘤细胞的细胞学鉴定，然后再进行表型鉴定[31].

结论

Survivin的基因表达水平为胃癌患者当前的TNM分期系统增加了显著的预后价值。在更大的前瞻性系列中验证这些发现可能会优化风险分层，并最终个性化这些患者的治疗管理。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

LB构思了研究设计，处理了生物样本，进行了qrtPCR分析并起草了手稿。SM构思了研究设计，进行了统计数据分析并起草了手稿。JG、AM和PP参与了本研究的设计，并收集了患者的临床数据。RS负责样品的收集和储存，直到提取RNA。DN负责协调研究并参与手稿撰写和编辑。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。

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