生物化学杂志。2010年1月22日；285(4): 2580–2590.
3-羟基脯氨酸残基在I型、II型、III型和V/XI型胶原中的位置暗示其在纤维超分子组装中的作用*
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玛丽·安·韦斯
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
大卫·M·哈德森
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
拉米·金
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
鋂利沙·史考特
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
建安久武
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
大卫·R·爱
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
来自华盛顿州西雅图华盛顿大学骨科和运动医学系骨科研究实验室，邮编：98195-6500
1收件人：1959 NE Pacific St.，HSB BB1052，Box 356500，Seattle，WA 98195-6500，传真：206-685-4700；电子邮件：乌德·诺格尼肖.u@eryed. 2009年9月22日收到；2009年11月2日修订
摘要
胶原蛋白三螺旋通过4-羟基脯氨酸残基稳定。虽然抑制其形成的基因缺陷会导致隐性成骨不全，但不太常见的3-羟脯氨酸（3Hyp）没有任何功能。为了帮助理解发病机制，我们使用质谱法鉴定正常人和牛组织中纤维形成胶原蛋白中3Hyp残基的位置和局部序列基序。结果证实，Pro的一个3Hyp站点（A1）基本上被完全占用986在A支链α1（I）、α1（II）和α2（V）中。在Pro中发现两个部分修饰位点（A2和A3）944在α1（II）、α2（V）和Pro中707在α2（I）和α2（V）中，其序列基序与A1不同。值得注意的是，位点2和3之间的距离，237个残基，接近胶原蛋白D期（234个残基）。搜索其他D周期性3Hyp站点后，发现Pro上有第四个站点（A4）470在α2（V）中，237个残基N末端到位点3。相反，尽管存在候选脯氨酸残基和可识别的A1序列基序，但人和牛的III型胶原蛋白在任何位置都不含3Hyp。哺乳动物α1（III）中A1处的保守组氨酸可能阻止了3-羟基化，因为鸡III型中的该部位完全羟基化，酪氨酸取代组氨酸。所有三条B族V/XI型胶原链都显示出3Hyp的相同三个位点，但与A族胶原链的位点和序列背景不同。其中两个B分支位点被231个残基隔开。从这些和其他观察结果中，我们提出了3Hyp残基在胶原超分子结构有序自组装中的基本作用。
关键词：细胞外基质/胶原蛋白、细胞外基质/Hydroxyproline、生物体/哺乳动物、蛋白质/翻译后修饰、3-羟脯氨酸、骨、软骨
介绍
胶原是多细胞动物中最丰富、最普遍的蛋白质。已明确4-羟脯氨酸（4Hyp）2残基通过水脊分子内氢键稳定胶原三螺旋(1). 然而，尽管在50年前发现了含量少得多的3-羟脯氨酸（3Hyp），但其功能尚不清楚(2). 在I型和II型胶原中，每条链上只有1-2个3Hyp残基，在V型和XI型胶原中每条链上有3-6个残基。基底膜IV型胶原蛋白含量最高，其中总羟脯氨酸的10%为3Hyp(三).
特定的脯氨酰3-羟化酶（P3Hs）负责3Hyp的合成。人类基因组中存在编码P3H1、P3H2和P3H3的三个不同基因，它们的表达具有组织特异性(4,5). 底物脯氨酸残基以先决序列Pro-4Hyp-Gly出现。α1（I）链只有一个在Pro上建立的3Hyp位点986在脊椎动物物种间保守的基序（人类GLPGPIGPPR）中，II型胶原蛋白（人类GIPGPIGP（P）PGPR）。
最近，3Hyp再次引起人们的兴趣，这是因为发现了一种隐性的成骨不全症（OI）是由以下基因突变引起的：CRTAP公司该基因编码一种蛋白（软骨相关蛋白），该蛋白与内质网中的P3H1和亲环素B结合，是脯氨酰3-羟基化所必需的986胶原蛋白α1（I）和α1（II）链中的位点(6,7). 进一步研究表明，P3H1本身的突变也会导致隐性的严重OI(8,9). 一个关键问题是OI中的脆性骨表型是由骨基质胶原中缺乏3Hyp引起的，还是由功能失常的酶复合物引起的细胞内组装和运输缺陷引起的，或两者兼而有之。
因为除了单个脯氨酸外，3Hyp在正常纤维形成胶原蛋白中的分布尚不清楚986在α1（I）和α1（II）链中的位点，我们使用蛋白质质谱在脊椎动物胶原原纤维形成中使用的所有A分支和B分支基因产物中进一步定位。I型胶原纤维组装在V型胶原的丝状模板上，II型胶原纤维则组装在XI型胶原的模板上(10). 为理解CRTAP公司,LEPRE1公司（编码P3H1），以及与胶原蛋白脯氨酸-3-羟基化有关的其他基因，确定人类和其他脊椎动物组织正常胶原蛋白中脯氨酸-3-羟基化的所有位点非常重要。
我们的结果显示，在不同的纤维胶原链中，3Hyp有几个部分羟基化的位点，而在Pro中通常是完全羟基化的初级位点986在α1（I）、α1（II）和α2（V）中。所有其他位点都缺乏Pro独特的序列基序986但与IV型胶原中已知的含3Hyp序列有共同特征。一个重要的发现是A族链（α1（II）、α2（V）和α2（I。相比之下，哺乳动物III型胶原蛋白缺乏3Hyp，尽管在Pro中具有可识别的初级位点基序986根据胶原链上的保守位点、序列基序和3Hyp位点的间距，我们推测3Hyp在介导三螺旋间相互作用和帮助胶原超分子组装中的作用。
实验程序
组织来源
成人骨、软骨和半月板（20-40岁）购自西北组织中心（西雅图，华盛顿州）。胎儿人骨和软骨由华盛顿大学出生缺陷研究实验室获得内部审查委员会（IRB）批准。在患者知情同意和IRB批准的情况下，从正常丢弃的手术组织中获得人类椎间盘组织。从当地超市购买的鸡翅上解剖鸡皮（12-14周龄）。从当地一家屠宰场获得的成年牛眼睛（18个月大）上解剖了牛玻璃体。
胶原的制备
I型和V型胶原蛋白是从成人和胎儿骨骼中制备的。粉末骨在4℃甲醇/氯仿（1/3 v/v）中脱脂，在4℃0.5中脱盐米EDTA，0.05米三氯化氢，pH 7.5。以脱脂鸡皮和成人半月板为原料制备III型胶原蛋白。II型胶原由成人关节软骨、胎儿骺软骨、成人髓核、牛半月板和玻璃体（18个月大）制备而成。XI型胶原是从胎儿人类关节软骨中制备的。用4种蛋白聚糖从软骨组织中去除米盐酸胍，0.05米Tris-HCl，pH 7.5，含蛋白酶抑制剂（5 m米1,10-菲咯啉和2 m米苯甲基磺酰氟）在4°C下放置24小时，并彻底清洗残留物。用胃蛋白酶（1:20 w/w，胃蛋白酶/干组织）将来自所有组织的胶原蛋白溶解在3%乙酸中，在4°C下溶解24 h(11). 含有0.7和1.8的可溶性骨胶原蛋白的系列沉淀米NaCl分别分离I型和V型胶原蛋白。溶解的关节软骨、髓核和玻璃体胶原连续沉淀0.8和1.2米NaCl分别分离出II型和XI型胶原蛋白。皮肤III型胶原蛋白在0.8时沉淀米氯化钠。半月板胶原蛋白连续沉淀0.7、0.9和1.2米NaCl分别分离I/III型、II型和V/XI型。II型胶原是半月板的一个次要成分，翻译后高度修饰，导致其在0.9时沉淀米NaCl，从大块I型胶原蛋白中分离(12). 脱钙骨和盐酸胍提取软骨残渣的部分在室温下用70%甲酸中的CNBr消化24小时(13)，并将所得CB肽冻干。为了进行微序列分析，从牛髓核中制备α1（II）CB9,7，并用胰蛋白酶消化，用反相高效液相色谱法分离单个肽。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
莱姆利方法(14)用于胃蛋白酶化胶原蛋白的6%凝胶和用于CNBr肽的12.5%凝胶。
微层序分析
Edman化学公司在配备在线HPLC分析裂解苯硫乙内酰脲氨基酸的Portion 2090E机器上进行了N末端序列分析。
肽质谱法
从SDS-PAGE凝胶中切下胶原蛋白α链或CB肽带(15)并进行凝胶内胰蛋白酶消化(16,17). 使用配备在线液相色谱（LC）（ThermoFinnigan）的LCQ Deca XP离子阱质谱仪，使用C8毛细管柱（300μm×150 mm；Grace Vydac 208MS5.315），以4.5μl/min的速度洗脱，对胰蛋白酶肽进行电喷雾质谱。液相色谱流动相包括缓冲液a（0.1%甲酸溶于MilliQ水中）和缓冲液B（0.1%甲酸在3:1乙腈中：n个-丙醇（v/v）。电喷雾电离源将LC样品流引入质谱仪，喷射电压为3 kV。机器通常以三重播放模式运行，离子排斥打开，这意味着它将进行全扫描，然后对最丰富的离子进行几次缩放扫描和MS/MS，然后切换到下一丰富的离子。该机器还可以通过缩小选择质量范围来靶向特定的低丰度离子。序列搜索软件（ThermoFinnigan）用于使用NCBI蛋白质数据库进行肽鉴定。Sequest没有发现许多大的胶原蛋白肽，必须通过计算可能的MS/MS离子并将其与实际MS/MS进行匹配来手动识别。通过滚动或平均数分钟的完整扫描，手动搜索羟基差异，以便给定肽的所有翻译后变化在完整扫描中同时出现。
结果
基因A链胶原链α1（I）、α1（II）、α2（I）和α2（V）中的3Hyp
已知3Hyp在Pro的完全占据位点的肽986胰蛋白酶肽质谱显示α1（I）、α1（II）和α2（V）的羟基化接近100%(). 早期研究通过Edman测序确定α1（I）中的脯氨酸残基为3Hyp(18).
含脯氨酸胰蛋白酶肽的串联质谱986（位点A1），胶原链α1（I）、α1（II）和α2（V）中唯一的、完全占据的3Hyp位点。 A类对人骨胶原蛋白的CNBr消化物进行SDS-PAGE后，通过凝胶内胰蛋白酶消化制备肽(车道1)，人类关节软骨胶原(车道2)和胃蛋白酶溶解的人类骨胶原蛋白，1.2米氯化钠沉淀(车道3).B类，α1（I）CB6和α1（II）CB9,7的胰蛋白酶肽LC-MS图谱的全扫描质谱，穿过含有脯氨酸的胰蛋白酶多肽翻译后变体的洗脱窗口986。任何未羟基化的肽都将被包括在内，因此这提供了脯氨酸羟基化的测量986该部位在骨的I型胶原和软骨的II型胶原中完全3-羟基化。C类，在含有Pro的胰蛋白酶肽的洗脱窗口上，α2（V）链的LC-MS图谱的全扫描质谱986离子773.7的（上部）和MS/MS分析2+（下部）。y轴5碎片离子在Pro上建立添加的16 Da986773.7型2+肽离子缺乏脯氨酸的4-羟基化978，而7822+离子在Pro上都有3Hyp986专业版和4Hyp978; α2（V）在Pro下持续欠羟基化978（7822+离子不是来自α1（I）的污染物。）P（P）#，3Hyp；P（P）*，4类型。
此外，从单个CB肽和凝胶内胰蛋白酶消化的整个α链制备的胰蛋白酶肽在其他GPP位点上的质量变异（+16 Da）表明3Hyp。从α1（II）中，在Pro中发现了第二个部分羟基化位点944来自人和牛关节软骨的CB肽CB9，7(; 牛的结果显示）。列出了用于解释MS/MS光谱的片段y和b离子这也将作为解释所有光谱结果的指南和（另请参见–). 我们将此站点和后续站点称为A2、A3等，A1为主要站点。通过仔细检查各种CB肽或整个α链中包含候选GPP序列的所有可识别肽，在α1（II）中未发现其他位点。脯氨酸的部分羟基化944来自牛关节的α1（II）促进了对II型胶原蛋白的其他组织来源的调查。在该地点发现了一致的物种和组织依赖性变异。这些分析结果总结如下.专业程度944根据质量比估算的3-羟基化（以及通过MS/MS碎裂曲线确定的+16添加位置）范围一致，从牛玻璃体II型胶原中的80%以上到牛关节II型胶原的20%以下。纤维软骨半月板中的少量II型胶原（占总胶原的3-6%；参考文献。12)在Pro中高度3-羟基化（66%）944类似地，髓核II型胶原（人类结果如，但也包括牛）也在Pro中严重羟化（～40%）944(; 另请参见). 专业人士944人类骨中α2（V）的位点为60%的3-羟基化（质谱结果未显示）。
α1（II）类胰蛋白酶肽的串联质谱显示Pro处的二级可变羟基化3Hyp位点944（现场A2）。 A类,上部四个面板是经羟化和脯氨酰版本的Pro洗脱窗口的软骨（牛）、髓核（人）、半月板（牛）和玻璃体（牛）中α1（II）CB9,7的凝胶内胰蛋白酶消化物的LC-MS全扫描质谱图944-包含肽。所示离子的相对丰度提供了脯氨酸羟基化程度的指数944.B类，的底部两个面板显示肽的脯氨酰和疑似3-羟基脯氨酰基版本的MS/MS光谱分析，从中y离子梯确定了脯氨酸上添加的16Da的位置944透明软骨的羟化率为10%，玻璃体II型胶原蛋白的羟化程度为87%，椎间盘和半月板胶原蛋白的羟基化程度为中等。请参见用于指导碎片离子如何确定3Hyp残基的序列和位置。P（P）#，3Hyp；P（P）*，4液压。
串联质谱鉴定3Hyp在Pro的第三个分子位点707在α2（I）和α2（V）链中（位点A3）。 A类和B类显示了分别来自α2（I）CB3,5和α2（V）的胰蛋白酶肽的LC-MS图谱的成对光谱，制备方法如下A类。在每个上部面板是所示序列的胰蛋白酶肽在LC洗脱窗口上的全扫描质谱顶部面板是脯氨酰3-羟基化版本的MS/MS分析。胶原链中脯氨酰与3-羟基脯氨酰基形式的比率可以通过离子比率916来估计2+/9242+和9152+/9232+对于α2（I）和α2（V），分别在该Pro下707现场。P（P）#，3Hyp；P（P）*，4液压。
串联质谱鉴定3Hyp在Pro的第四个分子位点470在α2（V）中（站点A4）。光谱来源于通过SDS-PAGE从骨中分离的α2（V）链制备的胰蛋白酶肽的LC-MS图谱，如A类和答：A是所示序列肽的LC洗脱窗口上的全扫描质谱。B类是脯氨酰3-羟基化版本的MS/MS分析，确定了脯氨酸上额外16Da的位置470.P（P）#，3Hyp；P（P）*，4液压。
候选A1 3Hyp位点的比较蛋白质序列（Pro992)人和鸡的相应胰蛋白酶肽的胶原蛋白α1（III）链和串联质谱α1（III）。这个顶部面板比较不同种类哺乳动物与鸡的同源序列（集合基因组数据库）。对于人、牛和鸡，显示了MS建立的4Hyp（*）和3Hyp。这个上部成对(A类)和下部对(B类)光谱分别来自人和鸡α1（III）胰蛋白酶肽的LC-MS图谱。在每一个中上光谱是LC洗脱窗口上的全扫描质谱，该洗脱窗口将结合所示肽的所有翻译后形式，以及低光谱是对如此发现的单个肽的MS/MS分析。755离子来自一个无关的α1（III）胰蛋白酶肽。来自人和牛（未显示）α1（III），Pro992不是羟基化的，而是来自鸡的同源Pro989100%羟基化。P（P）#，3Hyp；P（P）*，4液压。
α1（V）和α1（XI）胶原链中3Hyp位点（B1、B2和B3位点）的串联质谱鉴定。分别用胃蛋白酶消化法和盐沉淀法从人骨骼和关节软骨中制备V型和XI型胶原，经SDS-PAGE后，用凝胶内胰蛋白酶消化制备肽。A类，通过所示序列肽洗脱窗口的α1（V）胰蛋白酶肽LC-MS图谱的全扫描质谱(上光谱). 1371的MS/MS谱3+离子证实Pro上存在两个额外的16-Da单元作为羟基665和专业692（低光谱）。还显示了中性己糖损失（−162和−324）产生的碎片离子。类似地，MS/MS光谱显示13663+在Pro上多了一个16 Da665和专业1360 3+主要是具有六个4Hyp和无3Hyp残基的序列（未显示）。B类，通过所示序列肽洗脱窗口的α1（XI）胰蛋白酶肽LC-MS图谱的全扫描质谱(上光谱). 1152的MS/MS谱2+离子在Pro上建立额外的16 Da作为羟基434(低光谱). 同样，1144的MS/MS谱2+表明它缺少Pro上的16Da434（未显示）。P（P）#，3Hyp；P（P）*，4型；玻璃钢，葡萄糖基半乳糖。
总结在A链和B链胶原链中识别的3Hyp残基的人类序列和分子位置。沿三螺旋线的相对位置表示为盒A1-A4用于A分支站点，B1-B3用于B分支站点。人类序列的同源延伸显示为所有A分支链类型和所有B分支链类型。Pro之间存在明显的D周期间隔470和专业707，专业人士之间707和专业944在A级三螺旋中，以及在Pro之间434和专业665在B级三螺旋中。这个带下划线的P牛半月板α1（V）中B3处的脯氨酸也被～50%羟基化。P（P）#，3Hyp；P*，4相。
我们知道4Hyp只发生在（G）的Y位置X（X）是）n个胶原蛋白的重复，因此羟化脯氨酸在X（X）这本身就是3Hyp的有力证据。为了排除4Hyp（因为单独的质谱结果无法区分3Hyp和4Hyp），将Edman微测序应用于从牛α1（II）中分离的含有羟基化位点A2的胰蛋白酶肽。结果如所示用于从小牛髓核α1（II）分离的全3-羟基化肽。在第11次循环中，苯硫乙内酰脲衍生物的反相HPLC图谱与3Hyp苯硫乙内酯降解产物的特征报告相似(19)与4Hyp给出的结果截然不同（见循环12）。
Edman N末端序列分析确定944（A2位点）为3-羟脯氨酸。含有Pro的胰蛋白酶肽944来自GFTGLQGLP*GP序列的α1（II）#P*GPSGDQGASGPAGPSGPR由人类髓核（3Hyp版本的丰富来源）制备而成。序列测定器步骤10–14显示了苯硫乙内酰脲衍生物的顺序HPLC图谱。在第11周期，情况与α1（IV）胶原中3Hyp残基的报告非常相似(19)明显不同于脯氨酸（周期14）或4Hyp（周期12）。
人工评估骨I型胶原α2（I）链中所有胰蛋白酶肽的质谱()揭示了3Hyp在Pro的第三个位点707（现场A3）。（在我们检测的人类或其他脊椎动物物种的α2（I）中，没有发现A1或A2位点的候选GPP或序列基序（集合条目：ENSG00000164692）。）残留物Pro707在人α2（I）中80%羟基化（在牛中类似）。类似地筛选人类α2（V），Pro707该位点也发生了类似程度的羟基化。因此，在α2（V）中，所有三个位点A1、A2和A3都严重羟化。
Pro之间的近D周期间距707和专业944（237个残留物与D=234）(20)促使我们通过串联质谱法搜索任何进一步的3Hyp位点，该位点间隔一个或两个D周期以上的N末端。显示了在Pro中含有候选脯氨酸的胰蛋白酶肽的分析结果470（A4部位）来自骨的α2（V）。经3Hyp和Pro版本肽的MS/MS片段分析证实，残基确实部分羟基化。其他分析表明，在来自α1（I）链的等效胰蛋白酶肽中，脯氨酸的3-羟基化水平可变，但仅来自细胞培养，因此目前α1（II）的生物学意义尚不清楚（结果未显示）。
哺乳动物III型胶原蛋白缺乏3Hyp
人类和其他哺乳动物III型胶原蛋白的蛋白质序列（集合条目：ENSG000168542）显示了一个可识别的基序和初级位点的GPP986然而，质谱显示，从皮肤、主动脉和其他组织中制备的牛和人胶原蛋白III中的脯氨酸形式的肽质量，但没有3Hyp形式的肽(显示了人类半月板α1（III）的结果。在比较所有可用COL3A1序列的基因组数据库（Ensemble）时，所有序列都用GHx代替了GPIGPP之前的三联体GLP或GIP，预测脯氨酰3-羟化酶缺乏底物识别（参见对于样本序列）。在检测更广泛的脊椎动物COL3A1序列时，鸡以GYP而非GHP脱颖而出(). 看看这是否能在相邻的GPP中形成3Hyp体内，从鸡皮中提纯胶原蛋白III并进行质谱分析。如所示，来自鸡α1（III）的候选胰蛋白酶肽在同源位点Pro处100%羟基化989因此，似乎在残基980（Ile、Leu或Tyr）处需要一个亲水残基或至少不是组氨酸，以便P3H复合物识别脯氨酸作为底物。
基因B族胶原链α1（V）、α1（XI）和α2（XI
对分别从人类骨骼和关节软骨中制备的V型胶原和XI型胶原进行类似分析。手动检查LC-MS生成的胰蛋白酶肽谱，明确显示3Hyp在Pro的三个位点434，专业665、和专业692()我们在这里称之为位点B3、B2和B1（与沿着分支A链使用的从右到左的顺序一致）。位点B1和B2位于相同的胰蛋白酶肽中，相隔27个残基(). 结果仅显示为α1（V）。3+母体离子的MS/MS裂解模式确定了添加的羟基（+16）的特定位置。来自软骨XI型胶原蛋白制剂的α1（XI）和α2（XI。在B类，站点B3（专业版434)软骨中α1（XI）的质谱结果显示，但α1（V）和α2（XI。
总结了在α1（I）、α2（I），α1（II）、α1（III）、α1-V、α2-V、α1-XI和α2-XI链中鉴定的所有3Hyp位点的分子位置和局部序列模体。其他GPP位点可能是3-羟基化的，特别是在V/XI型胶原B分支链中，因为并非所有含GPP的序列都能提供信息性胰蛋白酶肽。但早期文献报道的分离链和衍生溴化氰肽的氨基酸组成与α1（I）和α2（I）中单位点的一个残基/链一致(21,–23)，α1（II）中的一个或两个残基(24)，α1（III）中无3Hyp(25)，α1（V）中有三个或四个残基(26,27)，以及α2（V）中的两个或三个残基(26). 目前的结果显示了一些聚类证据，例如3Hyp位点B1和B2将27个残基隔开。还有GP中带下划线的脯氨酸#P*G公司P（P）P*序列（其中P#表示3Hyp，P*表示4Hyp），位于站点B3()对从牛半月板制备而非骨制备的α1（V）链进行分析，显示出显著的羟基化（≤50%）（数据未显示）。值得注意的是，半月板α1（II）链的羟基化程度始终高于A2部位关节软骨的α1（Ⅱ）链().
讨论
我们的发现建立了一些先前在原纤维形成胶原中未发现的脯氨酸3-羟基化位点。文献中关于胶原蛋白中3Hyp的大多数数据都是从氨基酸分析中收集的，因为发现了不同的链型，并对其氰溴化物衍生肽进行了表征(21,–27). 目前的结果与这些原始定量测量结果一致，例如，这些测量结果表明，I型胶原的每α1（I）和α2（I）链中有一个3Hyp残基(22,23). Proα1（I）链中的主位点（位点A1）986最初是根据Edman对小牛皮肤α1（I）CB6胰蛋白酶肽的测序建立的(18). α2（I）中的单一3Hyp残基发现于链的C末端第三（α2（II）CB5）(23)，但据我们所知，其确切的序列上下文尚未建立。我们在这里显示它在α2（I）Pro的位置707（位点A3）位于CB5的N末端附近，其序列基序与α1（I）中的A1位点不同。α2（I）序列没有可识别的A1脯氨酸位点。如图所示，α1（II）链之前有一个A1位点，该位点在软骨组织中几乎完全3-羟基化(6). Pro缺乏A1位点基序的3-羟基化992在α1（III）中()尽管存在候选脯氨酸，但根据氨基酸组成和Edman测序分析，这与早先报道的人和牛III型胶原蛋白中缺乏3Hyp一致(25).
哺乳动物III型胶原蛋白缺乏3Hyp
完全羟基化Pro986鸡α1（III）中的主要位点，但哺乳动物中没有()很可能反映出缺乏可识别的底物序列。这似乎是哺乳动物的进化损失。检查基因组数据库中唯一的另一种鸟——斑马雀的COL3A1序列（集合条目：ENSTGVG00000010995）；蜥蜴，爬行动物（集合条目：ENSACAG0000015062）；和热带非洲爪蟾，一种两栖动物（集合条目：ENSXETG00000010783），均显示相同的GTSGY（Y）地点1的PGPIGPPGPR，可预测来自鸡与哺乳动物序列意味着他们的专业986组织中III型胶原的位点将被3-羟基化。
因此，一个关键问题是，哺乳动物III型胶原中缺乏3Hyp是否会对哺乳动物细胞外基质中III型胶原的功能行为产生影响。胶原蛋白III本身不形成厚纤维，但在皮肤和其他组织中的I型胶原蛋白纤维表面发生共聚(28)成熟关节软骨中的II型胶原纤维(29,30). III型胶原蛋白的主要作用似乎是伤口愈合、基质修复和组织发育，以及作为机械柔韧“软”组织的结构组成部分，例如动脉壁。至少在哺乳动物中，它似乎总是作为由更丰富的I型和/或II型胶原蛋白形成的纤维成分共存。在A1位点可以3-羟基化的物种中，III型胶原蛋白能否发挥更独立的纤维作用是一个有趣的问题。例如，它可能会像I型和II型原纤维一样在胶原V/XI模板上独立聚合(10).
A分支和B分支3Hyp站点的比较
A1序列基序在α1（I）、α1（II）、αl（III）和α2（V）等所有A分支胶原蛋白基因产物中都很明显。他们共同的主题是GXX年GPIGP公司#P*GPR.（P*GPR）。其他原纤维胶原部位(,站点A2–A4和B1–B3层)缺少该序列，但彼此之间以及IV型胶原中已知的脯氨酰3-羟基化位点具有一些共同特征(19). 除-PP*G-要求外，它们最可识别的特征是底物脯氨酸的苯丙氨酸残基为九个残基或更少的N末端。这可以在中的站点A2、A3、B2和B3上看到B1位点缺乏这种苯丙氨酸，但在相同的胰蛋白酶肽中紧跟在B2之后。在先前报道的同源序列-GF中α1（IV）链的两个位点上，3Hyp残基在苯丙氨酸之后的位置很明显X（X）普通合伙人#P*糖蛋白-(19). 苯丙氨酸是酶识别所必需的，还是仅仅是已识别底物序列的一致特征，尚待观察。同样相关的是，在模型三螺旋胶原蛋白肽中观察到苯丙氨酸通过与邻近分子中的Pro/Hyp相互作用促进高阶结构的重要性(31).
最近的研究表明，酶变体P3H2负责IV型胶原的脯氨酰3-羟基化(5). 因此，A链和B链胶原链中的非A1位点可能不会被P3H1羟化。然而，P3H1似乎是制造纤维胶原的细胞表达的主要亚型，而P3H2最显著地表达于基底膜丰富的组织中(5). 或者，非A1 3Hyp位点可能不需要与位点A1相同的酶复合物。后者通常由P3H1、CRTAP蛋白和亲环素B的三聚体蛋白复合物羟基化(32). 没有CRTAP，P3H1无法将胶原α1（I）和α1（II）中A1位点羟基化crtap（crtap）空鼠标(6)和人CRTAP-无OI患者(9). 从P3H1（LEPRE1）阴性人类细胞的分析来看，这种情况不太清楚，即使是在细胞培养中观察到一些残余羟基化的A1位点(8,9). 如果表达，P3H2可能在一定程度上作为3-羟化酶作用于a链和B链胶原链中A1和非A1位点以及IV型胶原，因为它似乎没有与CRTAP和亲环素B形成复合物(5). 显然，分析CRTAP和LEPRE1突变对各种脯氨酰3-羟化酶位点的不同影响应有助于理解3Hyp形成对正常胶原生物学的意义及其在隐性OI发病机制中的缺陷形成。
A1场地作为基底的起源
人们很容易推测，纤维胶原链中的A1位点在真核生物进化中出现得很晚，刚好在脊椎动物出现之前。尽管3Hyp早在现存最原始的多细胞动物海绵（porifera）的无脊椎动物胶原蛋白中就存在(33)可识别的A1位点序列基序的3-羟基化使其在原始脊椎动物中出现。三海鞘中存在单个P3H基因肠圆线虫基因组（原始脊索动物）和祖先至少可以追溯到蛇床子属(34). 因为基底膜IV型胶原蛋白和纤维形成胶原蛋白的祖先可以在海绵中识别(孔虫属) (33)，我们推测A1序列在进化方面是P3H相对较新的底物，可能在P3H1/CRTAP/亲环素B复合物（或其祖先形式）首次出现时才被识别。据推测，在该位点产生羟基化活性的事件发生在导致脊椎动物中A型胶原基因（α1（I）、α2（I），α1（II）、α1（III）和α2（V））分化的一系列全基因组或部分基因组复制之前(35)也许在祖先的leprecan（P3H）基因被复制两次并最终分化为三个拷贝之前或之后不久(4,34,36,37). 因为A1位点的序列基序与A2–A4和B1–B3位点的序列模序不同()从IV型胶原中的3Hyp基序来看，P3H活性的功能增强，可能是通过P3H1与CRTAP结合，似乎比单纯的胶原序列改变更可能。这种解释也适用于脊椎动物A链胶原链在A2、A3和A4位点的相对脯氨酸3-羟基化水平上的明显差异()根据这一概念的逻辑，这是比A1遗址更古老的基底。这些发现可能最好用A2、A3和A4底物活性的位点特异性变化来解释，因为它们在五个A分支基因中的序列发生了差异。
α2（V）链在所有四个位点A1、A2、A3和A4上显示出最完整的3-羟基化模式。需要注意的是，α2（V）是一种A族基因产物，但它只在异源三聚体中与两条B族链结合起作用，例如，两条α1（V）链，一条α1和一条αl（XI）链，或两条依赖于组织的α1（XI(10). 由于V/XI型胶原作为I型和II型胶原纤维聚合和生长的模板，人们很容易怀疑V/XI低聚物的a链中3Hyp的D周期间隔在招募a链I型或II型分子以形成混合纤维中的作用。
影响脯氨酸3-羟基化的遗传缺陷
专业人士的重要性986在CRTAP-null小鼠的研究中发现了正常骨和软骨发育的（位点A1）3Hyp位点(6). 含有这种已知的脯氨酰3-羟基化位点的胰蛋白酶肽的串联质谱分析显示完全不存在3Hyp。这并不完全令人惊讶，因为CRTAP蛋白与P3H1的N末端半部分有很强的序列同源性（但没有活性位点，因此没有酶活性），并且已知与内质网中的P3H1和亲环素B蛋白复合(4). 进一步的研究表明，CRTAP和P3H1的突变导致人类OI的隐性形式，证实了疾病表达与I型胶原A1位点3Hyp含量缺失或减少有关(6,–9). 然而，仍然没有解决的是，小鼠细胞外组织胶原蛋白缺乏3Hyp或隐性OI病例本身是否是导致组织缺陷的原因。例如，这个3Hyp结构域是否为胶原正确矿化所必需的纤维相关蛋白提供了一个结合位点？还是由于内质网中的胶原蛋白伴侣缺陷导致继发性细胞营养不良，进而导致充分组装的基质胶原蛋白缺乏？在Pro中突变A1位点986在转基因小鼠中，从脯氨酸到另一种氨基酸的α1（I）可以验证这一点。
胶原蛋白中3-羟基脯氨酸的推测功能
考虑到3Hyp在胶原蛋白生物学、OI发病机制和4Hyp稳定三螺旋的功能方面的所有已知信息，我们怀疑3Hyp残基通过在相邻胶原三螺旋之间形成氢键在超分子组装中发挥基础作用。3Hyp残基之间的D间距(,站点A2到A3号,A3号到A4（A4）、和地下二层到地下三层)表明含3Hyp结构域之间的这种相互作用可能参与微调D周期关系，并通过三螺旋间氢键在寄存器中形成二聚体。有很好的证据表明，排列整齐的前胶原分子聚集体离开高尔基体(38)，并且与单个前胶原分子相比，聚集体似乎是BMP-1（前胶原C-前肽酶）的更好底物(39). 对合成肽的初步研究表明3Hyp可能会破坏三螺旋的稳定性(40)，但进一步的研究得出结论，稳定性略有增加(41). 含有3Hyp和Gly-Xaa-Xaa重复序列的合成肽的晶体结构表明，脯氨酸上的3-OH从三螺旋中指向，因此可以介导与其他蛋白质分子的氢键(42). 一个合理的结合伙伴是另一个三螺旋，可能通过水分子，类似于4Hyp如何通过链间氢键稳定三螺旋本身。（值得注意的是，胶原蛋白样肽的晶体可以在4Hyp-羟基之间形成三螺旋间氢键(43,–46).) 如果是这样，相邻分子的相邻含3Hyp的结构域之间的相互作用可能最强，这些结构域由D周期交错排列或相互注册。
而不是驱动D错开本身，因为它有234个残留物(20)比观察到的A分支3Hyp间隔（237个残基；)羟基和主链羰基之间直接或通过水相互3Hyp氢键可以加强静电和疏水力驱动的关系。这个假设特别有吸引力，因为它可以提供力量，帮助精细调整D交错排列中的分子组装，以形成具有最佳分子间交联位置的原纤。如果前胶原分子的注册二聚体而不是单体是晚期高尔基体和分泌囊泡中纤维生成的亚单位，这将解释注册的两个最近邻对分子和另一个交错4D周期的分子之间有效形成成熟的分子间交联(47) (). 这种成熟的交联是脊椎动物骨骼组织的标志，尤其是骨和软骨胶原蛋白的标志(47).
纤维分子堆积的推测概念，其中亚基是分子二聚体，在寄存器中轴向交错排列d日-期间。 A类显示了复杂分子间交联在骨骼组织胶原蛋白中的位置。B类说明了纤维堆积的分子模型。这种排列可能是由含有3Hyp的基因座之间三螺旋间氢键的影响引起的。现场A1在Pro的位置986并说明了螺旋间键合的潜力。剩余的3Hyp位点同样可以促进大分子组装过程中的D交错螺旋缔合。
这些概念如所示四角包装二聚体的包装排列(B类)Woodhead-Galloway最初考虑的模型是（二聚亚基可能发生超螺旋）(48)与继续作为参考标准的更密集的单体或五纤维准六角形阵列相比，更适合于x射线衍射数据和胶原蛋白原纤维的测量蛋白质密度(49). 考虑到骨胶原蛋白原纤维如何有空间容纳矿物微晶的有序内板，并在交联胶原蛋白分子片之间排列，形成紧密复合物，二聚体的方形排列也很有吸引力(50). 此外，专门容纳矿物微晶沉积的有序分子包装的破坏可能对骨特性特别有害，如成骨不全所证明的那样(51).
总之，我们得出的结论是，A分支胶原创始基因中A1 3Hyp位点的出现是在更古老的3Hyp位点的背景上叠加的。据推测，这一新特征影响了脊椎动物进化起点的胶原蛋白组装机制，进而影响了胶原蛋白原纤维亚基组成和交联特性的组织相关多样性(10).
*这项工作得到了美国国立卫生研究院AR37318和AR36794的全部或部分支持。
三D.R.Eyre、M.A.Weis和L.Kim，未发表的观察结果。
2使用的缩写如下：
- 4液压缸
- 4-羟脯氨酸
- 3液压
- 3-羟脯氨酸
- 第3页
- 脯氨酰3-羟化酶
- 油
- 成骨不全
- 高效液相色谱法
- 高压液相色谱法
- 微软
- 质谱法
- 毫秒/毫秒
- 串联MS
- 信用证
- 液相色谱法。
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