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细胞生物学杂志。2009年12月14日；187(6): 875–888.
数字对象标识：10.1083/jcb.200908115
预防性维修识别码：项目经理2806317
PMID：20008565
第条

含缬氨酸蛋白（VCP）是自噬所必需的，在VCP疾病中被破坏

郑善柱,1 罗德里戈·A·富恩特阿尔巴,1 萨拉·米勒,1 艾琳·杰克逊,三 大卫·皮尼卡·沃姆斯,2,三，4,5 罗伯特·H·巴洛,1,2和康拉德·C·威尔通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

在与缬氨酸相关蛋白（VCP）相关的痴呆期间，由于自噬受损而导致自噬体积聚，这可以解释为VCP缺乏或活性降低。

摘要

含缬氨酸蛋白（VCP）的突变会导致包涵体肌病（IBM）、佩吉特骨病和额颞叶痴呆（IBMPFD）。患者肌肉有退化纤维、边缘空泡（RV）和含有泛素和TDP-43（TARDNA结合蛋白43）的肌浆内含物。在本研究中，我们发现IBMPFD肌肉也积累了定位于RV的自噬体相关蛋白Map1-LC3（LC3）和p62/固存体。为了测试VCP是否参与自噬，我们沉默了VCP或表达了无活性的腺苷三磷酸酶VCP。在基础条件下，VCP活性的丧失导致自噬体的积累。在自噬诱导后，这些自噬体不能成熟为自溶体并降解LC3。类似地，IBMPFD突变VCP在细胞和动物中的表达导致非降解自噬体的积累，这些自噬小体在RV处结合，无法降解聚集的蛋白质。有趣的是，TDP-43在自噬抑制后积聚在细胞液中，类似于IBMPFD突变表达后的情况。这些数据表明VCP参与自噬，并表明自噬受损解释了IBMPFD肌肉的病理学，包括TDP-43的积聚。

介绍

含缬氨酸蛋白（VCP）是一种广泛表达的蛋白质，属于AAA+（与各种活动相关的ATP酶）蛋白家族(Halawani和Latterich，2006年). VCP参与多种细胞过程，包括细胞周期调节、核膜形成、高尔基体生物发生和泛素蛋白酶体系统（UPS；哈拉瓦尼和拉特里奇，2006年). 在这些功能中，通过分泌途径合成的错误折叠底物的降解是最具特征的(Ye等人，2001年). Ufd1和Npl4复合物中的VCP参与ER相关降解（ERAD）底物的逆转(Ye等人，2001年). VCP活性的丧失导致泛素化蛋白的积累和ERAD受损(Dalal等人，2004年;Wójcik等人，2004年). VCP也有助于将蛋白质聚集体贩运到包涵体。VCP的缺失会破坏含多聚谷氨酰胺蛋白质的攻击性形成和降解(小林等，2007年).

与VCP参与这些过程相一致，显性遗传突变导致包涵体肌病（IBM）、佩吉特骨病（PDB）和额颞叶痴呆（FTD[IBMPFD]），这是一种罕见的多系统退行性疾病，具有三种不同的渗透表型特征(Watts等人，2004年). 到第四到第五个十年，90%的患者出现致残性虚弱。在同一年龄段，51%的患者出现PDB。32%的患者在第五到第六个十年内出现FTD。一些家族的其他特征包括白内障、神经病变和心肌病，这表明IBMPFD的发病机制可能与其他常见的年龄相关疾病有关(Weihl等人，2009年).

IBMPFD患者的不同组织中存在一些共同的病理特征。肌肉和大脑含有泛素和TDP-43（TARDNA结合蛋白43）-阳性内含物(Schröder等人，2005年;Forman等人，2006年;Hübbers等人，2007年;Neumann等人，2007年;Weihl等人，2008年). 在脑组织中，泛素化和TDP-43内含物是核内的，将IBMPFD归类为具有泛素化内含物（FTLD-U）亚型的额颞叶变性(Schröder等人，2005年;Forman等人，2006年). 在肌肉中，泛素包涵体是肌核和肌浆(Guyant-Maréchal等人，2006年;Hübbers等人，2007年)并且TDP-43在包容肌纤维的细胞核中减少(Weihl等人，2008年;Salajegheh等人，2009年). 尚不清楚为什么TDP-43在IBMPFD患者的细胞液中积聚，但这与TDP-43的行为在其他FTLD-Us和散发性肌萎缩侧索硬化症中一致(Neumann等人，2006年).

IBMPFD肌肉的另一个显著病理改变是肌浆空泡(Watts等人，2004年). 这些液泡具有其他肌肉退行性疾病中发现的边缘液泡（RV）的特征，如散发性包涵体肌炎（sIBM）和遗传性IBM。RV一词实际上用词不当，因为RV没有限制膜，也不包含任何特定的细胞器内容物。它们更恰当地描述为肌纤维内的膜质和蛋白质碎片堆积。在组织加工过程中，这种膜堆积物被提取出来，留下RV。超微结构分析表明，RV含有不连续的膜螺纹，其中夹杂着管状纤维和电子致密材料(Fernandez等人，2005年). sIBM和遗传性IBM中RV的起源尚不清楚，但被认为是自噬性的。

VCP中的疾病突变如何影响其功能尚不完全清楚。所有描述的突变都位于N-末端和D1结构域内，这两个结构域被认为与底物和辅因子结合有关(Watts等人，2004年;Weihl等人，2009年). 一项初步研究表明，IBMPFD突变体仍然与Ufd1和Npl4结合，这对UPS功能至关重要(Hübbers等人，2007年). 几种疾病突变的生化特征表明，它们形成稳定的六聚体，并增加了ATP酶的活性(Weihl等人，2006年;Halawani等人，2009年). ATP酶活性增加可能反映了ATP结合后的结构变化(Halawani等人，2009年). 骨骼肌——转基因小鼠中IBMPFD突变体VCP-R155H（VCP-RH）的限制表达再现了IBMPFD肌肉中的许多特征，包括虚弱、肌病特征、泛素化内含物和空泡化(Weihl等人，2007年). 细胞培养中IBMPFD突变的表达结果喜忧参半。一些研究发现泛素化蛋白质增加(Weihl等人，2006年;Ju等人，2008年)而其他人则认为其水平变化很小或没有变化(Hübbers等人，2007年;Gitcho等人，2009年). 细胞培养能有效模拟IBMPFD的程度可能与细胞类型和蛋白表达水平有关。ERAD和UPS底物也可能积聚在IBMPFD突变细胞中。ERAD底物ΔF508囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR；Weihl等人，2006年)和UPS基板Unc-45B(Janiesch等人，2007年)在IBMPFD突变细胞中增加，类似于ATP酶非活性VCP或蛋白酶体抑制后的细胞(Dalal等人，2004年). 最后，在IBMPFD突变细胞中聚谷氨酰胺的清除速度减慢(Ju等人，2008年). 这是由受损的蛋白质聚集体贩运到(Ju等人，2008年).

这些先前的发现都不能解释IBMPFD患者肌肉的所有病理学。VCP是否参与自噬尚不清楚。在这项研究中，我们评估了缺乏功能性VCP或表达IBMPFD突变VCP的细胞和动物的自噬体形成、成熟和通量。此外，我们评估了IBMPFD突变型VCP表达细胞和动物以及自噬受损条件下细胞溶质TDP-43的积累。

结果

据推测，RV是自噬起源的。为了观察自噬蛋白标记物在IBMPFD肌肉中是否升高，我们使用p62或LC3抗体对9-12月龄对照组或VCP野生型（WT）或两种不同VCP-RH表达转基因小鼠系（RH9或RH12）的股四头肌裂解物进行免疫印迹。p62增加(图1 A)特别是与自噬体相关的LC3切割产物LC3II，在RH9和RH12肌肉中切割约两倍(图1 B). p62和LC3II水平的增加与对照小鼠每天腹腔注射50 mg/kg羟基氯喹（氯喹）48小时或慢性治疗4周后的急性治疗相似(图S1). 氯喹是自噬体-溶酶体融合的抑制剂，治疗可减少LC3II和p62等自噬底物的降解。对9例不同IBMPFD患者的肌肉裂解物进行的免疫印迹分析显示，与正常患者肌肉相比，p62蛋白水平增加了约5倍(图S2). 如前所述，sIBM肌肉的p62蛋白水平增加了大约三倍(Nogalska等人，2009年). 表达IBMPFD突变体的转基因小鼠的进一步表征发现，RH9和RH12肌肉积累了肌膜下、弥散和点状肌浆p62和LC3(图1、C和D). 这种p62积累模式与对照小鼠每天腹腔注射50 mg/kg氯喹48小时后的急性治疗模式相似(Ju等人，2009年)或慢性治疗4周(图S5 D). 在某些情况下，p62和LC3定位于与RV一致的区域的肌纤维中心(图1D). 在对照组或VCP-WT小鼠肌肉中未发现类似模式(图1 C). IBMPFD患者肌肉有相同的发现(图S3). 这些数据表明，自噬体标记物p62和LC3在IBMPFD肌肉中增加并定位于RV。

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LC3和p62在IBMPFD肌肉组织中积聚。（A和B）来自具有p62（A）或LC3（B）抗体的对照（cont）或VCP-WT、-RH9或-RH12突变转基因系的9个月龄四头肌裂解物的免疫印迹。注意突变动物中p62和LC3II亚型的增加。密度定量来自6只9个月龄以上的动物/组。LC3和p62水平归一化为负载控制。误差条表示六个独立实验的标准误差。**，P<0.001。AU，任意单位。（C） 对9个月龄对照组、VCP-WT或两个VCP-RH转基因系之一（RH9或RH12）的胫骨前肌（TA）或股四头肌（Quad）进行p62免疫染色。注意p62在肌纤维中部或沿肌瓣下区域积聚。（D） 表达VCP-RH转基因小鼠股四头肌的组织化学和免疫组织化学。15个月大的RV动物的苏木精和伊红（H&E）染色，12个月大动物的RV的p62免疫染色，RV的LC3免疫染色，以及12个月的动物的LC3的肌下膜积聚。支架突出显示一个LC3阳性肌纤维。单根肌肉纤维轮廓为白色。（C和D）箭头表示p62或LC3的液泡或积聚。棒材，30µm。

由于VCP突变导致IBMPFD，我们评估了VCP缺失对自噬的影响。VCP靶向siRNA寡核苷酸治疗（敲除[KD]）4天后，U20S细胞中VCP蛋白水平下降了约60–70%(图2 A). 使用相同裂解物的p62和LC3的免疫印迹显示，与加扰对照siRNA处理（Scr；图2 A). 用GFP-LC3表达构建物转染类似处理的细胞后，与对照Scr细胞相比，VCP-KD细胞在基础条件下GFP-LC3puncta增加(图2 B). 我们进一步研究了VCP对自噬的影响，方法是使用先前描述的表达myc标记VCP-WT、ATP酶非活性VCP-E578Q（VCP-EQ）或两个IBMPFD突变体之一VCP-RH或VCP-A232E（VCP-AE）的四环素诱导U20S细胞，其表达量约为内源性VCP的两到三倍(Ju等人，2008年). 来自16小时诱导的U20S细胞裂解物的LC3或p62的免疫印迹鉴定了表达IBMPFD突变体（RH和AE）和VCP-EQ的细胞中p62和LC3的LC3II片段的增加(图2 C). 用VCP-WT–、VCP-EQ–或IBMPFD突变体表达结构对亲代U20S细胞系进行慢病毒转染，得到了相同的结果，表明我们的发现不是由U20S稳定细胞的克隆性引起的（未发表的数据）。与VCP-KD一样，与对照细胞或VCP-WT细胞相比，VCP-EQ或IBMPFD突变细胞中的基础GFP-LC3点增加(图2、D和E). GFP-LC3点状细胞的增加与VCP-WT或对照细胞被bafilomycin A（Baf）处理时相似，Baf是一种自噬体-溶酶体融合和溶酶体空泡型H的抑制剂+-ATP酶，持续4小时(图2、D和E). 有趣的是，经Baf处理4小时后，VCP-EQ和IBMPFD突变表达细胞并没有显著增加GFP-LC3阳性点的数量(图2 E). 这些数据表明VCP活性的丧失或IBMPFD突变VCP的表达不会破坏自噬体的形成并导致其积累。

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LC3和p62在VCP-KD和IBMPFD突变表达细胞中积累。（A） 用VCP、LC3、p62或α-微管蛋白抗体免疫印迹打乱siRNA或VCP-靶向siRNA处理的U20S细胞的裂解物。密度分析由四个独立的实验用图形表示。LC3和p62水平归一化为负载控制。（B） 表达GFP-LC3的siRNA干扰控制（Scr）或VCP靶向siRNA KD细胞的荧光显微镜图像。计算GFP-LC3点/细胞的基本数量。（C） 来自稳定转染四环素诱导的U20S细胞的对照或myc标记的VCP-WT、ATP酶非活性VCP-EQ或两个IBMPFD突变体之一VCP-RH或-AE的裂解物表达16小时，并用myc、LC3、p62或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹。密度分析由四个独立的实验用图形表示。LC3和p62水平归一化为负载控制。注意VCP siRNA KD和突变表达细胞中LC3II和p62的增加。（D） 四环素诱导的表达GFP-LC3的U20S细胞经Baf处理和不经Baf治疗4小时的荧光显微镜图像（DMSO对照[左]或Baf+[右]）。细胞为对照组U20S细胞和VCP-WT、-RH、-AE和-EQ。（E）计算了GFP-LC3 puncta/cell的数量，用于对照组U20 S和VCP-WG、-EQ、-RH和-AE，包括和不包括Baf，持续4小时（DMSO或Baf）。注意突变表达细胞中基础GFP-LC3点的增加。（A–C和E）误差条表示四个独立实验的标准误差。*，P<0.01；和**，P<0.001。棒材，25µm。

正常情况下，自噬体与溶酶体等细胞器融合后具有酸性。一旦融合，它们就成为自溶体。区分自噬体和自溶体的一种方法是使用一个串联标记的单体RFP（mRFP）–GFP-LC3报告子（tfLC3；Kimura等人，2007年). 这个报告子在自噬体的中性环境中发出绿色和红色的荧光，将其与自溶体的酸性环境区分开来，自溶体会猝灭绿色荧光，只留下红色荧光可检测。我们用tfLC3报告基因转染对照、Scr对照、VCP-KD或表达VCP-WT、-EQ、-RH或-AE的细胞。作为阳性对照，用Baf处理细胞以抑制自溶体的形成。为了诱导自噬体成熟，细胞与雷帕霉素孵育2小时，这一时间点被确定为自溶体可视化的最佳时间点。雷帕霉素能够诱导U20S细胞自噬，如GFP-LC3阳性点和LC3I转化为LC3II所测（未发表的数据）。对照组、Scr对照组和VCP-WT表达细胞与Baf共培养2 h的细胞相比，绿色/红色自噬体更少，红色自溶体更多(图3，A和B). 对照细胞红点与绿点的相关系数计算为～0.5，而Baf处理细胞的相关系数为～0.8(图3 C). 与Baf处理的细胞类似，VCP-KD和-EQ以及两个IBMPFD突变体的红/绿阳性结构增加，共定位系数>0.75(图3，A和C). 为了证实自溶体形成受损，我们用免疫印迹法将表达VCP-WT或突变VCP的细胞的裂解物进行4小时的分析。在正常细胞中，Baf增加LC3II蛋白的水平，而在自噬体-溶酶体融合缺陷的细胞中，它不会增加LC3III的水平(Rubinsztein等人，2009年). 对照组和VCP-WT表达细胞中的LC3II物种随着Baf的增加而增加，而IBMPFD突变表达细胞并没有进一步增加LC3II蛋白水平(图3 D). 这些数据与图2（D和E）其中Baf治疗未能进一步增加GFP-LC3阳性点状物的数量，而在基础条件下已观察到这一点。这些数据表明VCP功能丧失或IBMPFD突变VCP表达导致非降解自噬体的积累。

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自噬体成熟需要功能性VCP。（A） 转染mRFP-GFP-LC3（tfLC3）并用雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成的U20S或VCP-WT-、VCP-RH-、VCP-AE-或VCP-EQ表达细胞中GFP和mRFP的荧光图像。（B） siRNA对照（Scr）或VCP-KD或Baf处理的对照U20S细胞转染tfLC3并用雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成。（A和B）开放箭头表示自噬体（GFP和mRFP荧光），而闭合箭头表示自溶体（mRFP仅荧光）。（C） 该图表示两个不同实验中10个独立的细胞场的GFP和mRFP共定位的皮尔逊系数。误差条表示两个独立实验中20个字段的标准误差。*，P<0.001。（D） U20S或四环素诱导的VCP-WT、-RH或-AE细胞经载体或Baf处理4 h后的裂解产物，并免疫印迹LC3和α-微管蛋白。请注意，Baf处理不会增加IBMPFD突变（RH和AE）表达细胞中的LC3II水平。棒材，15µm。

我们通过LC3免疫印迹评估了VCP-非活性或IBMPFD突变表达细胞中自噬底物的降解。自噬体相关LC3II片段的降解是细胞自噬通量的一个特定标记（有关综述，请参阅Klonsky等人，2008年). Scr对照细胞或VCP-KD细胞通过营养剥夺诱导自噬，并在0、2或4小时采集进行免疫印迹。Scr对照细胞LC3裂解物的免疫印迹显示LC3II蛋白在4小时内减少(图4 A). 我们没有发现LC3II水平的短暂增加表明LC3I在自噬诱导后转化为LC3II，因为评估的最早时间点是2小时。以前的研究表明，细胞培养中的这种转化发生在2小时之前，因此在我们的分析条件下不会出现（有关综述，请参阅Klonsky等人，2008年). 相反，VCP-KD处理的细胞不能降解LC3II(图4 A). 使用对照细胞、VCP-WT和-EQ以及IBMPFD突变细胞进行了类似的实验。在这些实验中，在营养剥夺长达6小时后，细胞裂解物的免疫印迹后检测到内源性LC3II。尽管对照细胞或VCP-WT细胞的LC3II、VCP-EQ和IBMPFD突变VCP细胞未能快速降解LC3II(图4 B). 这在三个独立实验的密度分析后以图形显示(图4C).

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自噬蛋白降解需要功能性VCP。（A） 通过营养剥夺0、2或4小时的自噬诱导和LC3和α-微管蛋白的免疫印迹，来自siRNA处理的U20S细胞（争夺对照[Scr]或VCP siRNA KD）的裂解物。LC3II在对照中随时间降解，但在KD细胞中不降解。显示了两个实验中的一个。（B） U20S或四环素诱导的VCP-WT、-EQ、-RH或-AE细胞经0、2、4或6小时营养剥夺和LC3和α-微管蛋白免疫印迹诱导自噬后的裂解物。LC3II在对照组和VCP-WT中降解，但在表达突变（EQ、RH或AE）的细胞中降解效率较低。（C） 三个独立实验中每个时间点LC3II和α-微管蛋白密度测定评估的图形表示。

接下来，我们评估了雷帕霉素治疗2小时后GFP-LC3点状物与内体/溶酶体标记物、溶酶体追踪红（LTR）或内源性Lamp1的共定位，以确定自噬体-溶酶体融合是否有缺陷。对照组或VCP-WT细胞的GFP-LC3点与LTR共定位或相邻(图5 A)-或Lamp1(图5 C)-阳性囊泡，共定位系数为～0.5(图5、B和D). 在VCP-EQ、IBMPFD突变VCP或与Baf共处理的对照细胞中，GFP-LC3点和LTR的共定位降低(图5 A)或灯1(图5 C)，共定位系数为～0.3–0.4(图5、B和D). 使用mRFP-LAMP1融合蛋白的共表达获得了类似的结果（未发表的数据）。为了证明GFP-LC3阳性结构与积累的自噬体一致，我们使用了电子显微镜。在VCP-RH和VCP-AE表达细胞中发现了与自噬体和溶酶体一致的空泡结构(图5 E). 这些数据表明，IBMPFD突变VCP可能导致自噬体与溶酶体的功能失调融合。

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自噬体降低了IBMPFD突变表达细胞中溶酶体标记的定位。（A） 转染GFP-LC3并用雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成的VCP-WT-、VCP-RH-、VCP-AE-或VCP-EQ表达细胞的GFP-LC2（LC3）和LTR的表观荧光图像。开放箭头突出显示自溶体（GFP和LTR共定位），闭合箭头显示自噬体（仅GFP）。（B） 两个不同实验中10个独立的细胞场的GFP和LTR皮尔逊系数共定位。（C） U20S、VCP-WT–、VCP-RH–、VC P-AE–或VCP-EQ–表达细胞或与转染GFP-LC3的Baf共处理的U20S细胞，经雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成的GFP-LC2和内源性Lamp1免疫组化的表观荧光图像。箭头突出显示自溶体（GFP和Lamp1共定位）。（A和C）合并字段中的方框区域在相邻面板中被放大。（D） 在两个不同的实验中，来自10个独立的细胞场的GFP和Lamp1的Pearson系数共定位。（B和D）误差条表示两个独立实验中20个字段的标准误差。*，P<0.001。（E） 四环素诱导的对照细胞或表达VCP-WT-、VCP-RH-或VCP-AE-的U20S细胞诱导16小时，然后用雷帕霉素处理2小时的电子显微镜观察。注意在突变表达细胞系中自噬结构的积累。箭头表示自噬结构。棒材：（A和C）15µm；（E） 1微米。

我们推断RV可能是细胞培养中看到的非降解自噬体的类似堆积物。用p62和Lamp1对股四头肌进行免疫组织化学染色显示，9个月龄VCP-RH小鼠肌肉中肌纤维中央区域内和某些纤维RV样结构周围的肌纤维沉积，这在VCP-WT或对照动物中不明显(图6 A). 这种共定位没有完全重叠，一些p62点与Lamp1阳性点不同。在使用IBMPFD患者肌肉时发现了类似的模式，其中p62阳性RV含有Lamp2阳性小泡(图6 A). 与非降解自噬体的积累一致，表达IBMPFD和VCP-RH的小鼠中的RV未能用水解酶染色标记，如酸性磷酸酶和非特异性酯酶（图S3、C和D）。超微结构分析确定VCP-RH肌肉中含有膜液泡积聚的结构(图6、B和C).

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自噬和溶酶体标记定位于IBMPFD组织中的RV。（A） 使用p62和Lamp1或-2抗体的股四头肌免疫荧光图像。显示了9个月龄VCP-WT小鼠的股四头肌切片、年龄匹配的VCP-RH转基因、12个月龄的VCP-RH转基因和IBMPFD患者的肌肉活检。打开的箭头突出显示p62和Lamp1/2共定位，而关闭的箭头仅显示p62免疫荧光区域。合并面板中概述了包含RV的单个肌纤维。（B和C）来自12个月大表达VCP-RH的转基因小鼠的两个独立系（B显示RH12，C显示RH9系）之一的胫骨前肌的透射电子显微镜。请注意核周或茎鞘下的大液泡状结构。棒材：（A）30µm；（B和C）500纳米。

为了验证自噬受损的功能后果，我们使用了一种基于荧光素酶的定量分析，测量自噬刺激后选择性蛋白聚集体降解(Ju等人，2009年). 本试验使用两个荧光素酶报告子融合到非聚集性聚谷氨酰胺重复序列（polyQ19-lucifferase）或聚集性丙氨酸扩展聚谷氨酰胺复序列（poly Q80-luciferase），电穿孔到6个月龄对照或VCP-WT或-RH（RH9和RH12）转基因小鼠的左、右胫骨前部。使用体内生物发光成像，在电穿孔后2天对荧光素酶活性进行基线测量(图7 A). 然后将动物饥饿24小时，并记录重复的荧光素酶活性测量结果(图7 A). 计算三只动物/治疗条件下polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶比率的变化。对照组和VCP-WT组动物的polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶的平均减少量分别为～25%和18%(图7 B). 相反，RH12和RH9转基因株系的polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶比率增加。这些数据表明，VCP-RH动物在蛋白质聚集体的自噬清除方面存在缺陷。

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IBMPFD小鼠肌肉自噬底物降解受损。（A） 分别在电穿孔（基线）后2天或在营养剥夺（饥饿）24小时后，在右侧和左侧胫骨前部使用polyQ80（Q80）-或polyQ19荧光素酶（Q19），使用对照或IBMPFD突变RH-表达小鼠（RH12）体内生物发光的代表性图像。polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶的比率显示在每个图像集的下方。数值单位为×104每秒每平方厘米每斯特拉迪安的光子数。（B） 饥饿24小时后，对照组、VCP-WT或两个VCP-RH（RH12或RH9）转基因小鼠系之一的左右胫骨前肌中polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶活性比率变化（Δ）的方框图和胡须图。图表代表每组三只动物。与对照动物或VCP-WT转基因动物相比，RH12的p值分别为0.05和0.06。与对照或VCP-WT转基因相比，RH9的p值为0.03。将RH12和RH9组合动物分别与对照组或VCP-WT组进行比较时，p值分别为0.01和0.02。对照组和VCP-WT组之间没有统计学差异。

IBMPFD的一个特征是核TDP-43缺失和细胞质TDP-43内含物积聚(Neumann等人，2007年;Weihl等人，2008年). 为了观察TDP-43是否在IBMPFD突变体表达细胞的细胞质中积累，我们将具有N-末端mCherry标签的人类TDP-43（mCherry–TDP-43）转染到我们的四环素诱导型U20S细胞中。在mCherry–TDP-43表达48小时后，我们量化了仅具有核荧光或胞浆荧光的mCherry-阳性细胞的百分比(图8 A). 由于TDP-43在细胞分裂和细胞死亡过程中离开细胞核（未发表的数据），我们与DAPI协同显示有丝分裂图和核固缩。这使得我们只能计算细胞核完整的细胞。与先前报道的研究类似，表达IBMPFD突变体和VCP-EQ的细胞胞浆TDP-43增加(图8，A和B;Gitcho等人，2009年). 类似地，用已知损害自噬体成熟的药物（如氯喹和Baf）处理对照U20S细胞4小时，导致转染的TDP-43的胞浆积聚(图8，A和B). 将来自类似转染细胞的裂解物分离为细胞核和细胞溶质部分。对这些组分进行mCherry–TDP-43、层粘连蛋白A/C和肌动蛋白的免疫印迹，以确认类似的蛋白质负载和组分的完整性。与表达VCP-WT的细胞相比，表达IBMPFD突变体和VCP-EQ的细胞浆中富含mCherry–TDP-43(图8 C). 在这些相同的细胞中，核TDP-43的数量没有明显的差异。这些数据与用氯喹或Baf处理4小时的U20S细胞裂解液进行细胞分馏时的数据相似(图8 C)并提示阻断自噬体成熟可以增加胞浆TDP-43的数量。

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IBMPFD突变表达或自噬抑制将TDP-43重新分配到细胞内的胞浆中。（A） 来自两个独立实验的10个不同领域的对照U20S、VCP-WT、VCP-RH、VCP-AE或VCP-EQ表达细胞或用10µM Baf或50µM氯喹（Chlq）处理4小时的对照U20 S细胞中mCherry–TDP-43分布（仅核或细胞质）的定量。误差条表示两个独立实验中20个字段的标准误差。*，与表达VCP-WT的细胞相比，P<0.02。（B） 对照U20S、VCP-WT、VCP-RH或VCP-AE表达细胞或用Baf或氯喹处理4小时的对照U20S细胞中mCherry–TDP-43（红色）和DAPI（蓝色）的荧光图像。箭头表示胞浆TDP-43和核周TDP-43内含物。（C，顶部）mCherry–TDP-43–转染VCP-WT–、VCP-RH–、VC P-AE–或VCP-EQ–表达细胞的核或细胞溶质裂解物部分的TDP-43、层粘连蛋白A/C和肌动蛋白的免疫印迹。注意，IBMPFD突变型和EQ表达细胞的胞浆TDP-43增加。（底部）用30µg/ml（cq1）或120µg/ml（cq2）二磷酸氯喹或200 ng/ml Baf处理的mCherry–TDP-43或类似转染细胞转染的未处理U20S细胞的核或细胞溶质裂解物部分的TDP-43、层粘连蛋白A/C和肌动蛋白的免疫印迹。数据代表了三个独立的实验。棒材，15µm。

接下来，我们评估了TDP-43在对照组和VCP-WT和IBMPFD突变表达动物中的免疫定位。值得注意的是，用丙酮固定骨骼肌可消除所有核TDP-43，而用PFA和丙酮固定可在小鼠骨骼肌约80–90%的细胞核中产生TDP-43免疫荧光(图S4). TDP-43主要位于15个月龄对照组和表达VCP-WT的动物肌肉的细胞核内，与之前报道的人类骨骼肌的细胞核类似(图9 A;Weihl等人，2008年;Salajegheh等人，2009年). 相反，来自同样年龄的RH9和RH12转基因小鼠的骨骼肌细胞核内TDP-43免疫荧光降低，核周肌浆TDP-43增加(图9 A). 在一些纤维中，TDP-43免疫染色集中在整个肌浆的小点状内含物或与RV一致的肌纤维中央区域(图9 A). 这种模式与IBMPFD患者骨骼肌中的模式相同（图S3、M和N），在对照组、表达VCP-WT的小鼠或正常患者中从未见过。长期服用氯喹的啮齿动物会患上带有LC3-和酸性磷酸酶阳性空泡的RV肌病，这可能是由于自噬成分的溶酶体降解受损引起的(Ikezoe等人，2009年). 与每天注射缓冲盐水的年龄匹配的对照小鼠相比，我们评估了TDP-43在每天用50 mg/kg氯喹治疗1个月的3月龄小鼠中的定位。与之前的研究一致(Ikezoe等人，2009年)氯喹处理导致空泡化、肌纤维变性以及p62和LC3II的积累（图S1和S4）。氯喹治疗动物的TDP-43免疫染色与IBMPFD突变表达动物和患者的TDP-33免疫染色相似。特别是，氯喹治疗动物细胞核附近的肌浆中肌纤维积聚TDP-43(图9 B). 这些数据表明，自噬蛋白降解的阻断概括了IBMPFD中的TDP-43病理。

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IBMPFD突变表达或自噬抑制将TDP-43重新分配到小鼠骨骼肌中的胞浆中。（A） 15个月龄对照组（Cont）或VCP-WT、-RH9或-RH12转基因小鼠股四头肌骨骼肌的TDP-43免疫染色。单个肌纤维轮廓为白色。（B） 用生理盐水或50 mg/kg/d腹腔注射氯喹（Chlq）治疗4周的3月龄小鼠股四头肌骨骼肌的TDP-43免疫染色。（A和B）插图显示每个场有一个肌核。棒材，30µm。

讨论

我们证明VCP活性的丧失会损害自噬。具体来说，LC3阳性液泡不能成熟为自溶体，导致非降解自噬体的积累。此外，在缺乏功能性VCP的细胞中，自噬通量的测量值受损。IBMPFD突变型VCP-RH或-AE的表达导致了类似的结果，即在IBMPFD患者和转基因小鼠肌肉的RV处积聚功能异常的自噬体。TDP-43在IBMPFD突变表达细胞和动物的胞浆中积累，并在体内外化学抑制自噬体成熟。我们的数据表明，IBMPFD是一种自噬体成熟障碍，导致自噬功能障碍。

自噬体成熟缺陷解释了IBMPFD肌肉的许多病理特征。例如，自噬缺陷组织中存在泛素聚集物和p62内含物(Hara等人，2006年;小松等人，2007年). RV被推测为自噬起源，实际上是IBMPFD中p62和LC3阳性自噬体的积累。氯喹是溶酶体蛋白酶抑制剂，通过药物治疗对小鼠或患者的自噬抑制会导致带有空泡和蛋白质积聚的肌病(铃木等人，2002年). 同样，微管分裂药物秋水仙碱和长春碱的中毒给药会导致RV肌病(Kuncl等人，2003年). 这些药物的作用机制被认为是自噬体/溶酶体贩运的缺陷。

骨骼肌自噬的作用尚不清楚。小鼠骨骼肌自噬必需蛋白ATG5的特异性敲除导致II型肌纤维萎缩，并在这些纤维中积聚泛素和p62(Raben等人，2008年). 相反，当肌肉接受针对LC3的沉默RNA治疗时，由组成活性FOXO3（叉头盒O3）诱导的骨骼肌萎缩减少(Mammucari等人，2007年). 自噬体-溶酶体降解受损是其他空泡性肌病（如达农氏病）的拟议机制(Nishino等人，2000年)和X连锁肌病伴过度自噬(Ramachandran等人，2009年). 这些肌病类似于IBMPFD，与膜结构相关，积累未降解蛋白。据推测，缺乏骨骼肌自噬基因的小鼠自动液位计5不产生自噬体，而在IBMPFD病例中，自噬体能形成但不能成熟和降解。也许空泡性肌病中发生的细胞骨架紊乱和膜堆积对骨骼肌功能有害，并解释了自噬缺陷和缺陷肌肉之间的病理脱节。

TDP-43从细胞核重新分布到胞浆并随后聚集是IBMPFD患者肌肉的一个特征(Weihl等人，2008年). 肌浆TDP-43与泛素共定位，表明其降解受到影响(Weihl等人，2008年). 这一特征见于其他RV肌肉疾病，包括sIBM和hIBM2(Weihl等人，2008年;Küsters等人，2009年;Salajegheh等人，2009年). 这些疾病中RV的原因尚不清楚，但推测为自噬的继发性。我们证明TDP-43积聚在IBMPFD突变表达细胞和转基因小鼠肌肉的细胞质中。在氯喹和Baf治疗后自噬体-溶酶体融合受损的情况下，对这一病理学发现进行了总结。我们认为IBMPFD突变体破坏了自噬，随后导致细胞溶质TDP-43的积累。最近的一项研究发现VCP和TDP-43可以在细胞培养和患者组织中相互作用(Gitcho等人，2009年). 他们提出TDP-43可能是VCP的底物。据推测，TDP-43或其片段可能通过自噬降解，并在自噬功能失调时积聚(Filimonenko等人，2007年;Caccamo等人，2009年;Kadokura等人，2009年;Kim等人，2009年). TDP-43的再分配如何影响骨骼肌，以及TDP-43或其片段是否是真正的自噬底物尚待确定。

本研究主要关注IBMPFD的骨骼肌发病机制。50%以上的IBMPFD患者以肌无力为表现特征，90%的IBMPFD患者发展为IBM，PDB和FTD的表型表达显著减少（分别为～51%和～32%；Weihl等人，2009年). 此外，IBMPFD患者肌肉和神经元的病理学也有明显不同。例如，IBMPFD脑组织主要有核泛素包涵体和罕见的细胞质包涵体(Schröder等人，2005年;Forman等人，2006年)而IBMPFD骨骼肌组织有泛素阳性细胞核和丰富的肌浆泛素化内含物(Hübbers等人，2007年;Gidaro等人，2008年;Weihl等人，2009年). 类似地，IBMPFD脑组织具有核TDP-43内含物，以及受影响的皮层神经元的核TDP-43减少(Neumann等人，2007年)而IBMPFD骨骼肌具有肌浆TDP-43的专属蓄积，并且在肌核中缺乏内含肌纤维(Weihl等人，2008年;Küsters等人，2009年;Salajegheh等人，2009年). 这些病理差异的原因尚不清楚，但可能与肌肉和脑组织如何处理自噬损伤有关。

自噬的破坏与其他疾病的数据一致，这些疾病与IBMPFD（即PDB和FTLD-U）具有共同的表型特征。自噬体蛋白p62的突变导致PDB(Laurin等人，2002年). p62结合泛素化蛋白和LC3(Pankiv等人，2007年). 在自噬受损的条件下，p62介导泛素化蛋白的聚集(小松等人，2007年)并将其与UPS隔离(Korolchuk等人，2009年). 有趣的是，VCP在p62过度表达的情况下改善了UPS功能，确定了UPS和自噬之间的潜在交叉点(Korolchuk等人，2009年). CHMP2B（带电多泡体蛋白2B）突变导致FTLD-U(Skibinski等人，2005年). CHMP2B是ESCRT（运输所需的内体分选复合物）途径的成员，它促进了质膜蛋白的内体/溶酶体降解(Skibinski等人，2005年). 包括CHMP2B在内的ESCRT家族成员参与自噬体-溶酶体融合，ESCRTI和ESCRTIII家族成员的缺失导致TDP-43的积累(Filimonenko等人，2007年).

本研究并不排除IBMPFD中UPS或肌肉特异性UPS基质降解受损的可能性。我们之前报道过IBMPFD突变VCP成肌细胞中ΔF508CFTR的稳态水平增加(Weihl等人，2006年). 我们认为这是由UPS介导的降解缺陷引起的。然而，我们目前的数据表明，由于IBMPFD突变体对自噬的影响，ΔF508CFTR可能累积。这是通过自噬直接降解ERAD底物还是通过慢性自噬抑制导致UPS继发性损伤尚不清楚(Korolchuk等人，2009年). 无论如何，可以想象，先前评估UPS底物降解和泛素化蛋白积累的研究反映了IBMPFD突变体介导的自噬的主要缺陷，而不是功能失调的UPS(Weihl等人，2006年;Janiesch等人，2007年;Ju等人，2008年).

VCP调节自噬的机制尚待阐明。我们的数据表明，VCP的丢失并不影响自噬的诱导，而是损害了自噬体向酸性自溶体的成熟。这可能是由于自噬体/溶酶体运输或自噬体与溶酶体融合的缺陷引起的。我们之前已经表明，VCP中的IBMPFD突变会影响蛋白质聚集体向包涵体的运输(Ju等人，2008年). 这导致聚集的聚谷氨酰胺蛋白的自噬降解受损。IBMPFD突变体是否也会影响自噬体向包涵体的转运尚不清楚，但这与我们目前的数据一致。VCP通过与泛素化中间体的相互作用或与泛素样结构域的结合来发挥其功能(Schuberth和Buchberger，2008年). 这些辅因子包含一个与泛素结构相似的同源76-80-aa序列。一些自噬体相关蛋白（LC3、GABARAP和GATE-16）也具有与泛素同源的结构域(Sou等人，2006年). VCP是否与这些蛋白质形成复合物以介导自噬体-溶酶体融合是推测性的。然而，另一种AAA+蛋白NSF与GATE-16相关(Sagiv等人，2000年). NSF介导GATE-16和GOS-28的组装，这是一种高尔基病毒SNARE，是同种膜融合所必需的(Muller等人，2002年). 我们的研究确定了VCP在自噬中的重要作用，并暗示自噬功能异常与IBMPFD的发病机制、其表型变体（IBM、PDB和FTLD-U），以及可能的其他TDP-43蛋白病有关。

材料和方法

质粒和细胞培养

先前描述了PolyQ19-和polyQ80-荧光素酶结构(Ju等人，2009年). LC3-GFP质粒和用GFP和mRFP构建物标记的tfLC3分别从H.Virgin（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）实验室获得。mCherry–TDP-43的构建如下：使用全长人类TDP-43 cDNA（Thermo Fisher Scientific）作为模板，通过PCR生成编码人类全长TDP-43并带有N末端Flag标签的cDNA。Flag序列位于起始蛋氨酸之后，最终序列为MDYKDDDKSEYIR。该PCR产物与载体pCherry-C1中的mCherry红色荧光蛋白一起克隆到框架中的XhoI和BamHI位点，该载体是通过用pEGFP-C1骨架上的mChery替换EGFP而产生的。如前所述，建立并培养U20S TRex稳定细胞系（VCP-WT、-EQ、-RH和-AE点突变）(Ju等人，2008年). 细胞保存在补充有青霉素/链霉素、10%胎牛血清、50µg/ml潮霉素B和65µg/ml泽奥辛的DME中，温度为37°C，CO含量为5%2将稳定的细胞系接种在适当的培养板中，并在转染当天生长至～80%的融合。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）或Fugene 6（Roche）进行转基因，如果是mCherry–TDP-43。对于氨基酸饥饿，用HBSS广泛清洗细胞，并在指定的时间段内在HBSS中进一步培养。在指定的时间内，以10µg/ml的最终浓度使用雷帕霉素。使用浓度为200 ng/ml的Baf，使用浓度为120µg/ml的二磷酸氯喹。

siRNA寡核苷酸的转染

VCP的KD是通过用siRNA双链（对应于VCP RNA序列（QIAGEN）或非靶向siRNA双序列（QIA GEN））处理U20S细胞来实现的。根据制造商的说明转染细胞（HiPerFect转染试剂；QIAGEN）。简言之，在转染前1天，将细胞接种在6孔板上，在含有10%FBS且不含抗生素的DME中达到70%的融合。在室温下，将靶向siRNA或阴性对照siRNA与HiPerFect转染试剂在OptiMEM（Invitrogen）中混合15分钟，然后添加到最终浓度为50 nM的培养基中。细胞在37°C下孵育48小时。细胞以类似的方式再次感染siRNA双链。第二次转染48小时后，使用VCP抗体通过Western blotting测定蛋白质表达，显示VCP降低了约60-70%。

荧光和电子显微镜

用质粒或siRNA构建物瞬时转染生长在玻璃盖玻片上的U20S细胞。对于稳定表达的细胞，在转染后第二天加入1µg/µl四环素。转染后24-48小时，用PBS洗涤细胞两次，用PBS中的3%PFA固定15分钟，用PBS中的0.1%Triton X-100透化10分钟，洗涤，用3%山羊血清封闭1小时，并进行荧光显微镜染色。对于骨骼肌免疫组织化学，使用黄原胶固定分离的骨骼肌，并在液氮冷却的2-甲基丁烷中快速冷冻。冷冻活检样品被切成8-µM厚的切片，并在TDP-43免疫染色的情况下固定在冰镇丙酮或4%PFA中，然后固定在丙酮中（图S5）。使用荧光显微镜（80i立式；尼康）和电荷耦合器件相机（EZ单色；Roper Industries）以及反褶积软件分析（NIS Elements；尼康。使用500万像素彩色电荷耦合设备（尼康）拍摄非荧光图像。使用NIS Elements 4.0软件和Photoshop CS3（Adobe）进行图像处理和分析。所有图像均在室温下使用Prolong Gold安装液（Invitrogen）在固定细胞或组织上进行。用于免疫荧光的目标是Apochromat 20×和40×。使用的共轭二级抗体荧光团为Alexa Fluor 488和543（Invitrogen）。对于共定位分析，选择了10个随机的细胞域，每个域包含至少两个转染细胞。使用NIS Elements 4.0软件测定每个细胞的Pearson共定位系数。结果来自两个独立的实验。LC3 puncta是从四个独立的实验中计算出来的，在这四个实验中计算了五到八个低功率场。所有图像均以相同的增益和曝光强度拍摄。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）和TOPHAT过滤器对图像进行后处理(http://u759.curie.u-psud.fr/softwaresu759.html)在点强度计数之前。

对于mCherry–TDP-43定量，U20S细胞以每12孔盖玻片50000个细胞接种在无抗生素培养基中，并在第二天转染。转染后，用指定的药物诱导或处理细胞。治疗后，用PBS清洗盖玻片三次，在4%PBS/PFA中固定20分钟，再次清洗，然后安装在含有DAPI的荧光贴装介质中，以观察细胞核。用显微镜（Eclipse 80i；Nikon）使用Apochro 20×物镜从10个随机场（每个场至少包含10个转染细胞）中获取解卷积图像。采集是在相同的增益和曝光设置下进行的。使用NIS Elements Advanced Research 3.0软件（Nikon）对细胞进行可视化，根据细胞核边界外是否存在樱桃荧光，将细胞分为仅含核细胞或含细胞质细胞。基于均匀DAPI染色，仅考虑携带健康细胞核的细胞用于计数。分裂细胞被排除在当前分析之外。

对于薄片电子显微镜，将瞬时转染的细胞在100 mm培养皿中培养至70%的汇合处36小时。对于样品制备，收集胰蛋白酶化细胞，在PBS中洗涤，在碳酸钠中的2.5%戊二醛中固定，按照标准程序包埋、切片并用乙酸铀酰染色。

蛋白质印迹

肌肉组织和U20S培养细胞在冰镇放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）均质，裂解液在14000℃离心克持续10分钟。使用BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）定量可溶性蛋白质。将等分匀浆进一步溶解在Laemmli样品缓冲液中，并对20–50µg蛋白质进行SDS-PAGE（10–12%分辨率凝胶）。将蛋白质转移到硝化纤维素膜（Trans-Blot；0.2-µm硝化纤维素；Bio-Rad实验室）。在含有5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水溶液中封闭膜。使用以下抗体：抗p97（1:2000）、抗Lamp1和抗层粘连蛋白A/C（1:2000；BD）；抗LC3（1:2000）；抗p62（1:4000）、抗GFP和抗actin（Sigma-Aldrich）；抗myc和抗管蛋白（细胞信号技术）；和抗-TDP-43（1:2000；N末端；Proteintech）。在与适当的第二抗体（辣根过氧化物酶-缀合的IgG）孵育后，通过ECL观察条带。用胶片扫描仪（Perfection 1359；Epson）扫描免疫印迹，并在Photoshop CS3中收集图像。用ImageJ测量密度。

核质分馏

细胞被放置在10厘米的培养皿中。转染后8 h，进行四环素诱导，细胞再生长36 h。对于自噬抑制实验，转染的U20S细胞生长24 h，然后在之前用指定浓度的氯喹、Baf或载体单独处理6 h。处理后，将细胞清洗两次，在冷PBS中刮除，并在700℃离心收集克将细胞颗粒重新悬浮在400µl缓冲液A（10 mM，Hepes-KOH，pH 7.9，1.5 mM MgCl）中10分钟2，10mM KCl和0.5mM DTT），并使细胞在冰上膨胀30分钟，然后涡旋10秒，并通过29号针7次。样品在700℃下离心克将细胞核颗粒化10min，将核后上清液收集在新的试管中。为了防止携带，将核颗粒在缓冲液A中清洗一次，并将核后上清液以最高速度离心10 s，以去除所有轻碎片和核。为了获得可溶的细胞溶质部分，将核后上清液在100000下离心克1h后，用丙酮沉淀浓缩可溶性胞质部分。然后将细胞溶质部分重新悬浮在缓冲液B中（20 mM Hepes-KOH，pH 7.9，420 mM NaCl，1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA和0.5 mM DTT）补充1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物。为了获得核部分，将核颗粒重新悬浮在50–70µl缓冲液B中，缓冲液B补充有1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物，并在冰上培养20分钟以进行高盐提取。在新试管中高速离心后收集核部分。通过Bradford试验（Bio-Read Laboratories）测定每个组分的蛋白质浓度，并对2µg细胞核组分和8µg细胞溶质组分进行免疫印迹。

荧光素酶分析

如前所述，使用小鼠体内电穿孔和生物发光成像测量体内自噬蛋白降解(Ju等人，2009年). 简言之，分别将polyQ19-和polyQ80-荧光素酶构建物电穿孔至小鼠左、右胫骨前骨骼肌。恢复2天后，将小鼠麻醉（吸入异氟醚），注射150µg/gd日-荧光素，并使用电荷耦合器件相机（IVIS成像系统；卡尺）进行预处理。在胫骨前肌上手动定义感兴趣区域，以确定总光子通量（每秒光子数）。测定每只动物的polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶活性的比率。饥饿24小时后进行成像，并再次测定每只动物的polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶活性的比率。为了进行比较，绘制了比率Δ。

统计分析

数据由配对学生的吨检验和/或方差分析，然后进行Fisher LSD事后比较，P<0.05。

在线补充材料

图S1显示了氯喹治疗动物骨骼肌裂解物的p62和LC3免疫印迹分析。图S2显示了来自IBMPFD、sIBM和对照患者肌肉的p62免疫印迹。图S3显示了IBMPFD患者骨骼肌活检的组织化学和免疫组织化学分析。图S4显示正常小鼠肌肉中的TDP-43免疫荧光。图S5显示了氯喹治疗小鼠的骨骼肌组织化学和p62免疫组织化学。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200908115/DC1.

致谢

我们感谢保罗·泰勒博士的有益评论。我们还感谢华盛顿大学阿拉菲成像实验室对共焦显微镜的支持。Herbert Virgin博士提供了GFP-LC3和tfLC3表达载体。Alan Pestrong博士协助人体肌肉组织活检处理。

该项目的资金来自美国国立卫生研究院（NIH）的拨款R01AG031867（给C.C.Weihl）、5K08AG026271（给C.C.Weihls）和P50 CA94056（给D.Piwnica-Worms）。我们还获得了NIH神经科学蓝图核心拨款P30 NS057105（给华盛顿大学）和华盛顿大学阿尔茨海默病研究中心拨款P50AG05681的支持。

脚注

本文中使用的缩写：

Baf公司
巴菲尔霉素A
CFTR公司
囊性纤维化跨膜调节因子
ERAD公司
ER相关降解
英尺-天
额颞叶痴呆
FTLD-U公司
额颞叶变性伴泛蛋白包裹体
国际商用机器公司
包涵体肌病
IBMPFD公司
IBM、PDB和FTD
杜兰特
击倒
长期风险率
LysoTracker红色
PDB公司
佩吉特骨病
RV汽车
边缘液泡
滑铁卢弹道导弹
发性包涵体肌炎
上升
泛素蛋白酶体系统
VCP公司
含缬酪肽蛋白
重量
野生型

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社