线粒体功能障碍和氧化应激介导生理损伤由自噬的破坏引起

摘要

介绍

人们对这个角色越来越感兴趣宏观自噬，这里简称自噬在各种病理条件下[1,2]. 这个人们之所以感兴趣，部分是因为观察结果表明生物，自噬是寿命的重要决定因素[三]. 例如，在里面秀丽C，基因突变的延寿效应daf-2型pathway需要一个完整的自噬程序[4,5]. 同样，在蠕虫体内当自噬受损时，饮食限制并不明显[6]. 一致通过这些观察，可以增加自噬的基因操作果蝇属导致苍蝇寿命延长，总体压力增加电阻[7].

关于自噬在哺乳动物系统。分子和生物化学建立之前在自噬的基础上，人们充分认识到老化组织通常以受损细胞成分的积累为特征。此外，与自噬缺陷一致的是，动物组织长寿命蛋白质的周转率随年龄而下降[8]. 这些和其他研究表明，自噬通量随着年龄的增长而下降这种下降的幅度和时间大体上与衰老过程中受损蛋白质和细胞器的年龄依赖性积累组织。最近的基因小鼠模型加强了这种联系。While期间基本自噬基因的完全敲除似乎对新生儿期，最近出现了各种条件淘汰模型描述。在这些最新结果中，描述了组织特异性肝、脑、胰腺和心脏中重要自噬基因的缺失[9-14]. While期间在这些不同的模型系统中存在显著差异，大多数是以各种病理学和生理学迅速出现为特点正常老化也可观察到的损伤。

对下游的了解相对较少以下观察到的通常是深刻的生理变化的介质自噬通量的破坏。很可能没有单一途径在所有组织和器官中，甚至在单个组织类型中可能存在调解人。例如，当错误折叠和通常部分被自噬清除的聚集蛋白可能在在神经退行性变模型中的突出作用，在其他组织中受损蛋白质聚集体的积累不太明显。这个纸巾最近的观察结果表明，这种缺失增强了这种特异性p62是一种泛素和LC3/Atg8结合蛋白，可以拯救病理在自噬缺陷的肝脏中观察到的变化，但似乎没有改变大脑中Atg7缺失后的表型变化[15].

自噬的一个重要功能是包括线粒体在内的细胞器的周转描述了线粒体外观的结构变化自噬缺陷哺乳动物组织的电子显微照片[9,12-14]，的这些线粒体的功能改变，如果有的话，还没有报道。在这里，使用各种手机和体内Atg7缺乏模型，我们已经评估了线粒体功能障碍的程度和相应的氧化应激在介导自噬流量中断后观察到生理损伤。

结果

Atg7缺陷骨骼肌线粒体功能障碍肌肉

为了更全面地描述自噬在维持正常线粒体功能中，我们创造了一个条件敲除模型，其中Atg7是小鼠骨骼肌中的自噬体形成被删除。我们最初选择这种模型是因为骨骼肌是一种丰富的组织，也是一种丰富的线粒体来源。正如所料，肌肉蛋白会从动物身上分解在肌肉肌酸激酶的控制下表达Cre重组酶与骨骼肌相比，（MCK）启动子显示Atg7表达降低从对照小鼠获得的肌肉组织（图​（图1A）。1安培). 与Atg7表达减少，我们注意到p62、蛋白质大部分通过自噬清除，其水平是常规的用作整体自噬流量的标志[16]. 尽管这些结果表明，骨骼肌的自噬在与对照动物相比，这些有条件切除的动物，我们在生存能力、总体大小和Atg7的活性、血清参数或全身表现^上下：MCK-Cre公司小鼠在出生后的第一年内（未发表的观察结果）。此外，组织学分析显示没有明显的骨骼肌结构敲除小鼠和对照小鼠之间的异常（图​（图1B）。1B年). 相反，电子显微镜显示Atg7^上下：MCK-Cre小鼠累积明显异常的线粒体，在肌纤维亚肌膜区。这些异常线粒体出现电子密度较低，经常肿胀、嵴缺失或畸形外观（图​（图1C）。1摄氏度). 尽管线粒体存在这些深刻的差异外观上，我们观察到各种细胞色素复合物（图​（图1D），一维)也没有明显的差异使用蓝色天然凝胶组装单个电子转移组件分析（图​（图1E）。1E级).

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图1。

Atg7缺陷骨骼肌线粒体功能受损。

(A）用Western blot分析小鼠蛋白裂解物骨骼肌内Atg7的条件性缺失（Atg7^上下：MCK-Cre）或对照动物（Atg7^F类/+：MCK-Cre）。Atg7的相对水平，评估p62和肌动蛋白（负荷控制）。(B）代表比目鱼肌染色组织切片。(C）电子8周龄Atg7骨骼肌的显微照片^F类/+：MCK-Cre公司或Atg7^上下：MCK-Cre小鼠。电子显微照片显示Atg7内畸形线粒体的堆积^上下：MCK-Cre公司肌肉。(D类)纯化线粒体的Western blot分析来自Atg7^上下：MCK-Cre或对照动物Atg7^+/+：MCK-Cre公司证明了电子转移亚单位的明显相似水平成分。对线粒体蛋白裂解物进行复合物I的检测组分蛋白NDFS3（NADH-泛醌氧化还原酶30 kDa亚基），复合物II组分FP（复合物II的黄素蛋白亚基）复合物III蛋白核心1（泛喹诺酮类细胞色素c还原酶复合物核心蛋白1）和线粒体膜蛋白VDAC。(E类)蓝色利用线粒体提取物进行天然凝胶电泳控制和Atg7^-/-表现出相似化学计量的组织电子转移复合物组件的组装。(F类)线粒体的典型耗氧轨迹12个月大的Atg7的骨骼肌^+/+：MCK-Cre或Atg7^上下：MCK-Cre公司老鼠。Atg7缺陷的骨骼肌在在存在复合物II依赖物的情况下评估呼吸底物琥珀酸盐。定期添加鱼藤酮以防止逆转电子传输。在缺席的情况下进行了测量（状态IV）ADP的存在（状态III）和复合物III抑制剂的作用抗霉素A（AA）。(G公司)线粒体的综合测定琥珀酸盐和鱼藤酮存在下的呼吸。图形表示Atg7的平均+/-SEM^+/+：MCK-Cre（n=3）或Atg7^上下：MCK-Cre公司小鼠（n=3）。*p≤0.05；**p≤0.01。

为了测试观察到的变化是否线粒体外观也伴随着相应的功能变化，我们测量线粒体的基础呼吸和刺激呼吸与Atg7隔离^上下：MCK-Cre和对照动物。初步实验表明，虽然复合物I依赖性呼吸减少，Atg7缺陷患者的复合II依赖性呼吸受损更严重肌肉。当我们测试线粒体时，发现以琥珀酸为底物的线粒体功能显著降低从Atg7缺陷动物中分离出来（图​（图1F）。1楼). 这些缺陷很明显在基本条件下（状态IV），甚至在最大条件下添加ADP引起的刺激呼吸（状态III）（图​（图1G）。1G个).

第7页^-/-MEFs显示细胞受损呼吸和活性氧水平增加

为了进一步描述接下来我们分离出完整细胞背景下的线粒体功能野生型或Atg7小鼠胚胎成纤维细胞^-/-胚胎（图​（图2A）。2安培). 与WT MEF相比，附件7^-/-中小微企业表现出减少基础耗氧量（图​（图2B）。2B型). 此外，我们注意到Atg7^-/-MEF显示最大线粒体氧化显著降低能力，根据FCCP刺激水平评估呼吸。这些差异不是任何明显差异的结果两种细胞类型之间的线粒体总数（图​（图2C）。2摄氏度).我们注意到，与线粒体耗氧量下降相一致Atg7^-/-MEF产生更多乳酸，与增加对糖酵解的依赖（图​（图2D）。二维). 这个远离有氧运动的转变Atg7中的呼吸作用和朝向细胞溶质糖酵解^-/-MEF公司大概代表了维持细胞内的代偿机制线粒体功能失调时的能量稳态。

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图2。

Atg7的能量学变化^-/-MEF公司。

(A类)蛋白质印迹野生型（+/+）或Atg7的分析^-/-表达式的MEFAtg7，p62和肌动蛋白（负载控制）。(B类)氧气的测量WT和Atg7的消耗^-/-基础条件下的MEF，添加线粒体电子链抑制剂后寡霉素（0.5μM），或在存在线粒体解偶联剂FCCP的情况下（1μM），以确定最大氧化能力。所示为平均褶皱氧耗变化+/-SEM（WT-MEFs基础呼吸=1）来自5个实验，每个实验进行三次。（C）)评估WT或Atg7中的线粒体数量^-/-MEF公司。DNA被分离来自WT（n=3个独立的WT MEF细胞株）和Atg7^-/-MEF（n=3独立Atg7^-/-MEF细胞株）和定量PCR线粒体编码基因ND1和核编码基因H19。(D类)相对细胞外酸化表明乳酸生成的速率以及WT或第7页^-/-MEF公司。所示为中的平均+/-SEM褶皱变化由8个实验产生的乳酸，每个实验进行三次*p≤0.05；**p≤0.01。

受损的线粒体通常会导致活性氧（ROS）。ROS的增加可以进一步增加线粒体损伤导致更多氧化剂释放和额外线粒体损伤，这一过程被称为“恶性循环”[17]. 在一些这种线粒体损伤和氧化的持续循环压力被认为是导致正常衰老以及许多与年龄相关的因素疾病[18]. 鉴于上述观察结果，我们接下来试图评估是否持续氧化自噬缺陷细胞存在明显的应激反应。如图所示​图3A，第3页，附件7^-/-MEFs具有增加的细胞内ROS水平。在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）的存在导致ROS水平（图​（图3B）。3B公司).

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图3。

Atg7缺陷细胞的活性氧水平增加。

(A类)通过DCFDA荧光强度评估细胞内ROS水平WT和Atg7中的（任意单位）^-/-MEF公司。ROS测量值为由三个独立的WT或Atg7制成^-/-MEF原电池菌株和每个菌株250多个细胞的荧光强度对基因型进行评估。（B）)NAC治疗降低ROS水平在缺少Atg7的MEF中。通过DCFDA荧光评估ROS水平第7页^-/-MEF未经处理或用NAC（500μM）处理4天在成像之前。值表示标准化荧光强度（任意单位）每个条件大约300个单元。图表示平均值+/-SEM。

抗氧化处理似乎没有改变Atg7自噬通量水平^-/-作为p62水平的MEF为NAC处理细胞中未发生变化（图​（图4A）。4A级). 然而，慢性NAC治疗确实部分改善了在这些细胞中观察到的代谢缺陷（图​（图44B、 C）。这些结果表明，观察到的持续氧化应激在附件7中^-/-MEF导致线粒体下降功能。

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图4。

NAC治疗部分纠正了Atg7中观察到的代谢缺陷^-/-MEF公司。

(A）野生型（+/+）或Atg7的Western blot分析^-/-培养的Atg7、p62和肌动蛋白表达的MEF（负荷控制）在抗氧化剂NAC（500μM）上存在或不存在10天。(B）主要野生型和Atg7^-/-培养在10年内无或存在500μM NAC在细胞呼吸测量前几天。所示为代表在基底下进行三次耗氧量追踪添加寡霉素（0.5μM）后药物解偶联剂FCCP（1μM）或复合物III抑制剂抗霉素A（0.25μM）。(C）4的平均代谢曲线使用3个独立的WT和第7页^-/-MEF公司。所示为氧气中的折叠变化+/-SEMWT-MEF和Atg7的消耗量（WT-MEF-基础呼吸=1）^-/-在没有或存在500μM NAC的情况下培养10个MEF代谢评估前的第天。*p≤0.05；**p≤0.01；NS=不重要。

胰腺氧化应激与葡萄糖不耐受第7页^-/-老鼠

考虑到在孤立的来自Atg7缺陷骨骼肌的线粒体及其观察NAC治疗至少可以部分逆转观察到的代谢缺陷在附件7中^-/-MEF，我们接下来试图评估这些原则是否可以应用于体内模型Atg7缺乏。因为我们的骨骼肌有条件Atg7^-/-小鼠没有表现出明显的表型，我们在胰腺β细胞中的Atg7通过交叉Atg7用RIP2 Cre动物对小鼠进行鞭笞。纯化蛋白的Western blot分析胰岛显示条件敲除动物（Atg7^上下：RIP2-Cre）Atg7表达减少或缺失，p62相应增加级别（图​（图5A）。5A级). 在幼年小鼠中，β细胞内Atg7的缺失没有导致胰腺胰岛素表达显著改变（图​（图5B）。5亿).同样，单个胰岛的细胞组成为在8周大的小鼠中基本上没有受到干扰（图​（图55C、 D）。相反，电子对照组或敲除组组织的显微照片显示Atg7缺陷小鼠β细胞内线粒体明显异常（图​（图5E）。第五版). 分离物基础呼吸和FCCP刺激呼吸的分析胰岛基础线粒体显著减少呼吸和Atg7线粒体氧化能力显著下降缺乏胰岛（图​（图5F）。5楼). 与之前描述的报告一致β细胞线粒体改变的动物[12,13,19],β细胞内缺乏Atg7的小鼠也表现出明显的异常葡萄糖耐量（图​（图5G）。5克).

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图5。

胰腺β细胞内Atg7表达不足的小鼠表现出线粒体改变。

（A）纯化蛋白的Western blot分析从Atg7获得的胰岛^F类/+：Rip2-CRE或Atg7^上下：Rip2-CRE小鼠表现出Atg7、p62和肌动蛋白的相对表达（负载控制）。(B类)细胞内胰岛素水平（平均+/-SEM）8-9周龄Atg7的胰腺组织^F类/+：Rip2-Cre（n=4只小鼠）或第7页^上下：Rip2-Cre小鼠（n=5只）。The slight reduction inAtg7中的胰岛素水平^上下：Rip2-Cre小鼠不显著与控件相比。(C类)对照胰腺切片第7页^F类/+：Rip2-Cre或Atg7^上下：Rip2-Cre小鼠胰岛内非β细胞成分用同时使用抗胰高血糖素、抗生长抑素和抗多肽抗体。(D类)连续切片用于观察β细胞带有抗胰岛素抗体。8周龄小鼠体内缺乏自噬β细胞具有性质相似的α、δ和多肽产生细胞水平在他们的胰岛内，以及类似水平的β细胞与对照组小鼠相比。(E类)电子显微照片显示Atg7缺乏症中肿胀、畸形线粒体的积聚β细胞。(F类)从对照组和Atg7分离胰岛^-/-评估小鼠基础呼吸（Atg7）的褶皱+/-SEM变化^F类/+：Rip2-Cre分离的胰岛=1），以及在存在寡霉素（0.5μM）或FCCP（0.5μM）。结果归一化为胰岛蛋白质浓度和来自每个基因型n=4只小鼠。(G公司)Atg7的糖耐量受损^上下：Rip2-Cre老鼠。血液在8-10周龄的对照小鼠Atg7中进行血糖测量^F类/+：Rip2-Cre（n=10只小鼠）或Atg7^上下：Rip2-Cre小鼠（n=8只）IP注射D-葡萄糖（1 g/kg）。数据表示平均+/-SEM*第页≤0.05;**第页≤0.01.

接下来我们问持续氧化的作用是什么应激是β细胞功能障碍的模型。我们随机淘汰或对照组小鼠从4周龄开始接受NAC治疗或不进行NAC治疗。作为预期，与对照动物相比，有条件消融的小鼠Atg7使胰岛内p62水平升高（图​（图6A）。6A级).NAC治疗对这种有条件的累积没有显著影响消融动物（0/18个胰岛p62在Atg7中呈阳性^F类/+：RIP2-Cre小鼠；在Atg7中有22/24个胰岛p62阳性^上下：RIP2-Cre小鼠和17/17胰岛Atg7中p62阳性^上下：用NAC治疗的RIP2-Cre小鼠；随机地从n=3只小鼠中获得的载玻片）。此外，作为就地氧化应激的标志物，我们测量了已知的硝基酪氨酸水平增加并促成糖尿病表型[20]. 如前所述，Atg7缺乏的胰岛和与p62的观察结果相比，NAC治疗对减少观察到的增加（图​（图66B、 C）。

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图6。

NAC的体内治疗可减少胰腺β细胞内的氧化应激。

(A类)附件7^F类/+：Rip2-Cre或Atg7^上下：未经治疗或使用抗氧化剂NAC 12周。16周龄时，处死小鼠胰腺组织连续切片分析p62和胰岛素或(B类)硝基酪氨酸和胰岛素。(C类)硝基酪氨酸的定量对照小鼠、Atg7缺乏动物或用NAC治疗12周的Atg7缺陷小鼠（每组n=3只动物）。图表表示平均值+/-SEM。**；第页≤0.01.

接下来，我们询问是否降低水平氧化应激本身足以改善生理有条件删除Atg7后观察到的损伤。Littermates是断奶后随机分为两组，分别接受NAC治疗和非NAC治疗在16周时进行评估。与持续氧化应激一致与未经治疗的Atg7相比，其在潜在生理学中的致病作用^上下：RIP2-Cre小鼠，NAC治疗的Atg7^上下：RIP2-Cre小鼠的葡萄糖耐量反应与对照小鼠（图​（图7A）。第7页). 这种保护在以后的时间点也可以看到，尽管随着小鼠年龄的增长，整体救援程度似乎有所降低（未显示数据）。观察到的葡萄糖稳态差异不是外周胰岛素敏感性降低作为胰岛素耐受性试验的结果所有四个受试组都具有可比性（数据未显示）。此外，老鼠β细胞缺乏Atg7会导致葡萄糖刺激的缺陷胰岛素分泌，这种缺陷在条件消融中没有观察到用抗氧化剂处理的小鼠（图​（图7B）。7亿).

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图7。

NAC治疗Atg7缺陷小鼠可防止葡萄糖不耐受表型的发展。

(A）男性Atg7^F类/+：Rip2-Cre（n=6小鼠），Atg7^F类/+：Rip2-Cre（+NAC；n=6只小鼠），Atg7^上下：Rip2-Cre（n=11只小鼠）或Atg7^上下：禁食Rip2-Cre（+NAC；n=11只小鼠）过夜，然后注射1 g/kg D-葡萄糖。血糖测定水平，未经治疗的β细胞Atg7缺陷小鼠发现在指定的时间点存在统计差异，而其他三组小鼠在统计学上无法区分hr时间进程。(B）通过尾静脉血测定胰岛素水平葡萄糖给药后0分钟和15分钟取样：Atg7^F类/+：Rip2-Cre（n=6只小鼠），Atg7^F类/+：Rip2-Cre（+NAC；n=4只小鼠），Atg7^上下：Rip2-Cre（n=8只小鼠）或Atg7^上下：Rip2-Cre（+NAC；n=5只小鼠）。数据包括表示为平均值+/-SEM。*p≤0.05；**p≤0.001。

讨论

使用多种手机和体内模型，我们证明，自噬的损伤导致线粒体受损和功能失调以及相应的细胞内活性氧水平。在自噬缺陷模型中胰腺β细胞，我们进一步证明糖耐量和胰岛素分泌的整体生理损伤可以通过简单地添加抗氧化剂来显著改善。虽然通过p62表达评估自噬流量表明NAC治疗不会直接影响自噬，最终改善糖耐量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌表明至少对于这个体内模型中，持续氧化应激重要的病理生理作用。

最近的一份报告表明应激也可能在观察到的先天免疫改变中起作用自噬缺陷细胞[21]. 在特别是，活性氧似乎介导干扰素分泌的增加和Atg5对病毒感染的抵抗力^-/-细胞。的形式在这些实验中研究的自噬是非常专业的，涉及将病毒核酸传递到内体而不是标准体内货物被运送到溶酶体的情况。同样，它应该是注意到在这种情况下，Atg5缺陷细胞显示增加干扰素保护和增强对病毒感染的保护自噬中断导致功能丧失的通常情况表型。有趣的是，在最近的研究中，Atg5^-/-MEF公司线粒体数量大约增加了2倍每个细胞的基因组，但由于目前尚不清楚的原因，我们没有观察到我们Atg7中线粒体数量的增加类似^-/-MEF（见图​图2C）。2摄氏度).

基于最近的这些在体外关于细胞中Atg5缺失的观察和我们的体内关于胰腺中Atg7缺失的观察结果，很容易推测ROS水平的升高可能是自噬缺陷组织出现阳性或阴性改变。然而，其他证据表明，这样一个广泛的结论是不太可能的总是正确的。例如，泛素的积累包涵体中的阳性蛋白聚集体是Atg5的显著特征以及Atg7缺陷的神经元和心肌细胞，未观察到这些变化在缺乏Atg5表达的T淋巴细胞或树突状细胞中[10,11,14,22,23].这可能反映了自噬在快速分裂细胞与有丝分裂后细胞。同样，即使在单个组织或器官，废除或抑制自噬的作用不可能总是很容易预测。例如，成年小鼠中Atg5的缺失导致自发出现收缩功能障碍，同时出现相同的缺失在心脏发生早期进行不会导致任何基础心肌表型[14]. 甚至更少直观的观察结果是，虽然Atg5的心脏特异性缺失导致动物承受心肌压力能力下降另一个重要自噬基因beclin的超负荷杂合缺失，心脏表型看似相反的小鼠的结果[14,24]. 因此，下游介体和抑制自噬的最终后果可能根据用于阻断自噬通量的策略和破裂发生的组织或器官。

我们的数据表明NAC的抗氧化治疗对预防糖耐量异常表型特别有益β细胞内Atg7缺失后观察到。胰腺分泌物众所周知，胰岛素对细胞氧化还原状态的变化敏感线粒体的整体功能。根据我们的代谢曲线结果附件7的^-/-在NAC在场的情况下培养MEF，很容易认为在删除Atg7的设置中体内使用抗氧化剂阻断线粒体生成活性氧的“恶性循环”导致线粒体进一步损伤。这些观察结果表明抗氧化靶向治疗可能至少有助于自噬缺乏或受损的情况越来越多认为有贡献。

方法

小鼠和细胞。第7页^上下之前已经描述过老鼠[9]和是与MCK-Cre小鼠（杰克逊实验室）或RIP2-Cre小鼠（杰克逊实验室）产生骨骼内有条件缺失Atg7的小鼠肌肉或胰腺β细胞。对于基因型分析，组织用Gitschier缓冲液（67mM）在55°C下过夜消化三重HCL，pH 8.8，16.6 mM硫酸铵，6.5 mM氯化镁₂,0.5%TritonX-100，1%巯基乙醇，100μg/ml蛋白酶K）。样品在95°C下培养5分钟，摇晃20分钟使用Eppendorf热混合器，在16100 x克用于2至少三个引物5'-TGGCTGCTACTTCTGCAATGA TGT-3'、5'-GCAAGCTCACTAGGC TG CAGAACC-3'和5'-GGTCCCA GAGTCCGGTCTC GG-3'用于检测基因组DNA中的flox Atg7等位基因。

Cre介导的使用引物5'-GGTCTGGCAG TAAAAACTATC-3'和5'-GTGA AACAGCATTGCTGTCACTT-3'，和5'-GGGTCC CA AAGGCCCC-3'以及Rip2-CRE和MCK-CRE分别为5'-GGATAGTTTTACT GCCAGAC CGC-3'[25,26].与最近描述的类似[12,13]，我们没有观察到明显的Atg7之间的表型差异^+/+，附件7^+/+：MCK公司-Cre，附件7^+/+：Rip2-Cre，Atg7^上下，附件7^F类/+：MCK-Cre公司或Atg7^F类/+：RIP-Core小鼠，因此我们主要介绍后者两种基因型作为本研究的代表性对照。

对于慢性NAC治疗，随机选择4周龄小鼠在指定的持续时间内，在饮用水中用1 g/L NAC处理这项研究的结果。所有动物实验均按照国家心肺与血液动物护理与使用委员会指南NIH研究所。

从E12-E14制备小鼠胚胎成纤维细胞使用标准方法培育一天大的胚胎。MEF是在十字架之后准备的Atg7之间^上下携带Cre转基因小鼠系的小鼠重组酶在已知的腺病毒启动子EIIa的控制下在发育中的胚胎中广泛表达[27]. 聚合酶链反应使用5’-GCTG CTACTTC TGCAATGATGT-3’和5’GCAAGCTCACTAGG CTGCAGACC-3’引物进行分析，以检测野生型Atg7基因和引物，5'-GCTGCTAC TTCTGCAAT GATGT-3'和5'-ATG GTAC用ATGCTAAGCCTCTGGAC-3'检测缺失的Atg7基因。MEF是在含有Dulbecco改良Eagle培养基的生长培养基中培养（DMEM；Invitrogen）补充15%胎牛血清（FBS），50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素。对于在体外NAC公司处理后，将第2代新鲜解冻的初级MEF置于生长期培养基补充500μM NAC 10天，每10天更换一次培养基前几天。

葡萄糖耐量试验、胰岛素测量和胰岛隔离。隔夜禁食雄性小鼠腹腔注射D-葡萄糖（20%溶液；1 g/kg体重重量）和血糖使用一触式Ascensia Elite测定血糖计（费希尔）。在术后0分钟和15分钟采集尾静脉血用大鼠胰岛素测定葡萄糖注射液和血浆胰岛素水平符合制造商建议的放射免疫分析试剂盒（密理博）。

对于胰腺细胞内胰岛素的测量，用乙醇/酸缓冲液（25ml）消化胰腺的小部分无水乙醇，8.3 ml ddH₂O、 和0.5 ml浓HCl）如前所述，在4°C下过夜[30]. 胰岛素使用大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒胰岛素（Crystal Chem Inc.）进行测量。组织重量用于使细胞内胰岛素水平正常化。

胰岛用标准协议[31]. 简要地，用0.5 mg/ml V型胶原酶溶液灌注胰腺（Sigma）溶于含有钙和镁（Mediatech Inc）。在37°C下消化15-20分钟，然后用HBSS中和胶原酶添加1%FBS。胶原酶处理的胰腺依次通过1.5 mm和0.8 mm金属网过滤器进行过滤。岛屿随后在Histopaque 1077（Sigma）和在直接光学显微镜下进行手工采集。

分离的线粒体和完整的代谢研究 .已净化线粒体是用标准方法[28]. 简单地说，是孤立的骨骼肌被迅速采集、清洗并放入冰镇的爱奥尼亚（Ionic）中切碎培养基（100 mM surcrose，10 mM EDTA，100 mM Tris-HCL，46 mM KCl，pH 7.4）。这个在离子培养基中用5%的XXIV型蛋白酶（Sigma）消化组织在冰上放置5分钟，然后通过添加添加0.5%BSA的离子介质。然后用玻璃-聚四氟乙烯电动均质器和由差速离心。随后对线粒体进行两次清洗然后在悬浮培养基（230 mM甘露醇、70 mM蔗糖、0.02 mM乙二胺四乙酸、20 mM三氯化氢、5 mM钾₂高性能操作₄，pH 7.4）功能评估。琥珀酸（5 mM）、鱼藤酮（1μM）、抗霉素A（0.25μM）和ADP（1 mM）用于测定复合物II依赖性呼吸。

完整细胞呼吸的测量是使用Seahorse XF24分析仪（SeahorseBioscience Inc.）执行。主要在XF24组织培养基上以40000个细胞/孔的密度电镀MEF板。分离纯化的胰岛并在DMEM中培养过夜补充10%FBS、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素。在呼吸测量前两到三小时，50-100个胰岛转移到聚赖氨酸涂层的XF24组织培养板上。在呼吸测定，冲洗初级MEF或胰岛并在DMEM中培养运行培养基（8.3g/L DMEM（Sigma），200mM GlutaMax-1（Invitrogen），100mM丙酮酸钠（西格玛）、25 mM D-葡萄糖（西格马）、63.3 mM氯化钠（西格玛）和酚红（Sigma），用NaOH将pH值调节至7.4）协议。在基本条件下测量耗氧量存在线粒体抑制剂寡霉素（0.5μM）或抗霉素A（0.25μM），或存在线粒体解偶联剂FCCP（0.5μM或1微米）评估最大氧化能力。乳酸测量通过如前所述，测定细胞外pH值随时间的变化[29]. 氧气消耗量和乳酸盐测量值按原代细胞数标准化胰岛的MEF和蛋白质浓度。

组织学和免疫组织化学。对8-10周龄婴儿进行组织学分析以及16-24周龄的小鼠。骨骼肌或胰腺组织分离自第7页^+/+：MCK-Cre，附件7^F类/+：MCK-Cre和Atg7^上下：MCK-Cre，或Atg7^+/+：RIP2-Cre，附件7^F类/+：RIP2-Cre和Atg7^上下：RIP2-Cre小鼠。组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋组织切片用于随后的苏木精和伊红（H&E）染色。抗胰岛素（DAKO）、抗胰高血糖素免疫组化分析（Sigma）、抗生长抑素（DAKO）和抗多肽（Millipore）抗体使用标准协议执行。用4%固定冷冻段用免疫组织化学方法分析PBS中的多聚甲醛硝基酪氨酸抗体（Millipore）或p62抗体（Progen Biotechtick）。对于为了定量，胰岛被认为是p62或p62染色阳性如果胰岛内大于5个细胞，则硝基酪氨酸呈阳性染色。罗丹明或Cy2结合二级抗体（Jackson免疫研究实验室）用于可视化。电子显微照片是在组织的超薄切片上进行的，这些切片固定在2或2.5%戊二醛加1%多聚甲醛，用1%OsO后固定₄,用1%乙酸铀整体染色并嵌入嵌入812（电子显微镜科学）使用标准方法。这些部分是观看前用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色。

Western Blot分析。原发性MEF或分离的胰岛被溶解使用NonidetP-40裂解缓冲液（1.0%Nonidet P-40，50 mM Tris-HCl pH7.4150 mM NaCl，5 mM EDTA）添加蛋白酶抑制剂片剂（罗氏）和磷酸酶抑制剂（1mM Na_三VO（旁白）_三, 1mMβ-磷酸甘油酯，10 mM NaF）在冰上放置15分钟16100倍离心澄清克4点15分钟摄氏度。骨骼肌悬浮在均质缓冲液中（25 mM Tris.HCl pH7.4、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%Triton X-100、0.1%SDS、10%甘油、1 mM DTT，0.5%脱氧胆酸钠）补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂并使用组织裂解器（Qiagen）均质。蛋白质浓度使用Pierce BCA分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定。蛋白质在预制的三甘氨酸SDS凝胶（Invitrogen）和转移到硝化纤维上。免疫印迹分析采用针对Atg7（ProSci Inc和Sigma）、肌动蛋白（Sigma复合物I组分NDFS3（NADH-泛醌氧化还原酶，MitoSciences）复合物II组分FP（复合物II的黄素蛋白亚基，MitoSciences），以及复合物III组分Core1（泛喹诺酮类细胞色素c还原酶复合物核心蛋白质1，线粒体科学）。

用于检测线粒体复合物天然蓝色凝胶，纯化的骨骼肌线粒体在天然PAGE Novex Bis-Tris凝胶，符合制造商说明（Invitrogen）。简单地说，用100μl 1x NativePAGE缓冲液和12.5μl 10%麦芽糖苷（Sigma）。这个样品在冰上孵育30分钟，之前经常出现漩涡16100 x离心制粒克在4°C下保持10分钟。离心后，将100μl上清液转移至含有6.3μl考马斯蓝添加剂和样品的新试管（约50μg），然后通过Native PAGE Novex Bis-Tris凝胶电泳进行解析。

ROS测量。原代MEF在Nunc上培养Lab-Tek双腔玻璃载玻片。作为内部控制，每个滑道室包含一口WT MEF井和一口Atg7井^-/-MEF、，或Atg7的一口井^-/-MEFs和一口Atg7井^-/-MEF公司用500μM NAC处理4天。细胞与含50μM 5-（和-6）-氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素的HBSS乙酰双乙酸酯（CM-H₂加拿大食品药品监督管理局；Invitrogen）在37°C下保持30分钟。然后冲洗细胞并用安装介质（Vector实验室）和之前使用徕卡SP1共焦显微镜进行可视化描述[32]. 几个对每个基因型取随机字段，平均荧光强度为用来自250多个细胞的数据在三个或更多单独的实验中计算使用至少两个独立隔离的WT和Atg7^-/-MEF电池分离物。自我们之前观察到，当连接时，活性氧水平发生了显著变化细胞被胰蛋白酶化[33].

线粒体数量。线粒体DNA与核DNA的比率为如前所述确定[34]. 简言之，使用SYBR green（Applied Biosystems）进行定量PCR分析25μg分离DNA（Qiagen）。线粒体DNA评估使用引物，5'-CTCTTAT CCACGC TTCCGTTACG-3’和5'-GATGGTACTCGCGTA-3’，用于线粒体编码的ND1基因。核DNA水平由使用引物5'-GTACCACTCTGCGTCC-3'和5’-GTCCACGAGACCAATGA CTG-3’。线粒体与细胞核的相对数量DNA由归一化ND1至H19水平测定。

致谢

脚注

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