美国国家科学院院刊。1998年12月22日；95(26): 15394–15399.
衔接蛋白Crk将多种细胞刺激连接到JNK信号通路
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法布里奇奥·多菲
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
米盖尔·加西亚-古兹曼
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
Marja Ojaniemi女士
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
中村贤治
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
松田美智
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
克里斯蒂娜·武奥里
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
*加州拉霍拉伯纳姆研究所拉霍拉癌症研究中心，邮编：92037；和†日本东京日本国际医疗中心研究所病理学系
由纽约州纽约市洛克菲勒大学Hidesaburo Hanafusa传达
1998年4月29日收到；1998年10月19日接受。
摘要
c-Jun N末端激酶（JNKs）被许多细胞刺激激活。小GTPases，尤其是Rac，负责启动JNK通路的激活。到目前为止，从细胞外刺激到Rac激活的信号仍然难以捉摸。最近的研究表明，含有Src同源性2（SH2）和Src同系物3（SH3）的衔接蛋白Crk在体外表达时能够激活JNK。我们发现Crk的瞬时表达诱导JNK激活，并且这种激活依赖于Crk的SH2-和SH3-结构域。p130的表达卡斯Crk SH2结构域的主要结合蛋白（Cas）也诱导了JNK的激活，该激活被Crk的SH2突变体阻断。Cas和Crk的JNK激活被显性负形式的Rac有效阻断，表明从Cas-Crk复合体到Rac-JNK活化是一条线性途径。许多激活Rac-JNK通路的刺激物增强了Crk SH2域的参与。Crk显性阴性突变体有效地阻断了这些刺激物（如表皮生长因子、整合素配体结合和v-Src）对JNK的激活。Cas显性阴性形式反过来阻断了整合素，但不阻断表皮生长因子或v-Src-介导的JNK激活。总之，这些结果证明了Crk在将多种细胞刺激连接到Rac-JNK途径中的重要作用，以及Cas-Crk复合体在整合素介导的JNK激活中的作用。
细胞与多种激动剂的相互作用导致丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的刺激，MAPK控制对许多细胞功能（包括增殖和分化）至关重要的基因的表达。c-Jun N末端激酶（JNKs）是MAPK家族的成员，在细胞应激和其他刺激（如生长因子、渗透压变化和紫外线照射）下被激活。激活JNK的底物包括转录因子c-Jun、ATF2和Elk-1；JNK磷酸化每个分子内的反式激活域，从而增加其转录活性。与所有的MAPK级联一样，JNK通路将自己排列成一个非常保守的三组分顺序激酶级联(1–三). 证据支持小GTP结合蛋白在启动MAPK通路激活中的关键作用。特别是，Rac和Cdc42是小GTPase Rho家族的成员，它们位于JNK级联的上游(4,5). 到目前为止，导致这些GTPase激活的信号通路的拓扑结构仍然难以捉摸。
Crk是一个主要由Src同源2和3（SH2和SH3）结构域组成的衔接蛋白家族的成员，最初被鉴定为编码癌基因产物v-Crk的禽逆转录病毒(6). 两个细胞同源物c-CrkI和c-CrkII是由同一基因通过选择性剪接产生的(7). 在v-Crk转化细胞中，细胞内蛋白质的酪氨酸磷酸化水平显著增加(8)与v-Crk的转化活性相关(9). 在高度磷酸化的蛋白质中，Cas被证明与v-Crk的SH2域相互作用(10). 有趣的是，已知Cas在非转化细胞中会对多种细胞刺激（如生长因子刺激和整合素介导的细胞粘附）产生酪氨酸磷酸化反应（综述见参考文献）。11). 在这些条件下，酪氨酸磷酸化的Cas似乎是c-Crk的SH2域的主要结合蛋白，它很容易与c-Crk发生免疫沉淀(12,13). c-Crk的SH3域可以与多个靶分子结合，包括两个鸟嘌呤核苷酸交换蛋白C3G(14)和Sos(15)和功能未知的180-kDa蛋白DOCK 180(16). 在细胞刺激时，这些蛋白质被c-Crk有效地招募到Cas-Crk信号复合体(12). 因此，c-Crk被认为参与生长因子和整合素介导的信号通路，但c-Crk的生理作用基本上仍不清楚。最近，田中等。(17)据报道，JNK在v-Crk转化的细胞中被激活，并且可以通过v-Crk和c-Crk的短暂过度表达而激活。这些研究促使我们研究c-Crk的生理作用，我们在此证明，c-Crk在通过小GTP-结合蛋白Rac将多种细胞刺激与JNK的激活联系起来方面具有之前未确定的关键作用。
材料和方法
质粒。
参考文献中描述了本研究中使用的Crk结构。7和18参考文献中描述了DOCK180、C3G和Sos的.pCAGGS表达向量。14–16pCAGGS-（Myc）Rap1N17是在M.M.的实验室中构建的。描述了野生型Cas-表达结构(10). 缺少底物结构域（氨基酸213–514）的CasΔSD表达载体如参考文献所示。19描述了pSRα3-（HA）JNK1、pCMV5-（M2）JNK1、pSRγ3-（HA(5,20,21). 参考文献中描述了野生型Grb2和Grb2的SH2突变体（R86K）的pEBB-结构。22绿色荧光蛋白的pEGFP-N1载体编码来自克隆技术。
细胞系和转染。
COS和HeLa细胞保存在补充10%胎牛血清的DMEM中。使用脂质体或磷酸钙法进行瞬时转染。按照制造商的说明（GIBCO/BRL）使用了脂质内酰胺。对于磷酸钙法，2.4μg纯化DNA用于含有3×10的35-mm细胞培养皿5每个孔的细胞数。转染24小时后，用PBS冲洗细胞，并在裂解前用无血清培养基重新培养18–24小时。
抗体，免疫印迹分析，免疫沉淀。
以下抗体来自商业来源：抗血凝素（HA，克隆Y-11；Santa Cruz Biotechnology）、抗Flag（M2；Kodak，IBI）、抗Myc和抗Ras（Calbiochem），以及抗c-CrkII、抗Cas和抗Grb2（肯塔基州列克星敦市转导实验室）。描述了抗DOCK180和C3G的抗血清(16). 按照说明进行免疫印迹和免疫沉淀(12).
JNK和Erk激酶分析和c-Jun荧光素酶分析。
如参考文献所示，通过免疫复合物激酶分析测定JNK和Erk活性。20在进行激酶分析的同时，用图中所示的抗体分析等分的未标记免疫沉淀物，以确定转染蛋白的表达水平。对于荧光素酶检测，HeLa细胞与1μg pFR-Luc报告质粒、50 ng pFA-c-Jun（1–223）（PathDetect报告系统，Stratagene）和文中所示质粒共同转染。转染后，将细胞保存在无血清培养基中24小时，进行裂解，并根据制造商的协议使用荧光素酶检测系统（Promega）检测荧光素素酶的表达。除非另有说明，这些数字代表了三个独立进行的实验。
免疫细胞化学。
将所示质粒与pEGFP-1一起转染Cos-7细胞，作为转染细胞的标记物。在无血清培养基中培养24小时后，用多聚甲醛固定细胞并用Triton X-100渗透。丝状肌动蛋白的染色用罗丹明结合的卵磷脂（Sigma）进行，细胞用尼康Axiovert系统在100倍放大下进行分析。在罗丹明的激发发射滤光片下研究表达绿色荧光蛋白的细胞，以分析肌动蛋白纤维的组织。
表皮生长因子（EGF）刺激和细胞粘附。
为了用EGF刺激细胞，在用100 ng/ml EGF（钙生物化学）刺激后，将COS和HeLa细胞保存在无血清培养基中24小时。在血清饥饿之前，细胞已经被转染了所示的质粒。在添加EGF和JNK免疫复合物后7小时进行荧光素酶分析。为了分析Erk对EGF的反应，用图图例中所示的质粒瞬时转染COS-7细胞，然后用100 ng/ml EGF刺激10分钟。如上所述，通过免疫复合物激酶分析测定Erk活性。当用整合素介导的细胞粘附刺激细胞时，首先用如上所述的所示质粒转染细胞。转染48小时后，通过胰蛋白酶作用分离细胞，并立即裂解或重新连接在20μg/ml纤连蛋白涂层板上，在37°C下保持15分钟。免疫复合物激酶检测如上所述。
结果
c-Crk以SH2-和SH3-依赖方式激活JNK通路。
为了检测c-CrkII激活JNK的能力，将COS-7细胞与c-CrkⅡ表达载体和编码HA表位标记JNK1的质粒共转染。用谷胱甘肽测定免疫沉淀物中JNK1激酶的活性S公司-转移酶-c-Jun（1-79）作为底物。与早期报告一致(17)发现c-Crk能有效激活JNK（图。A类). Crk激活JNK反过来会刺激c-Jun转录活性。为了研究这一点，使用荧光素酶作为报告基因分析了含有c-Jun激活域的GAL4-c-Jun（1–223）融合蛋白的激活。如图所示。B类c-Crk的表达有效地诱导了GAL4-c-Jun的激活，这严格依赖于上游JNK的激活。作为对照，另一种衔接蛋白Grb2的过度表达未能激活JNK通路（图。B类). c-Crk与HA-tagged Erk（MAPK家族的另一成员）共转染未能导致Erk激活，而EGF在相同细胞中容易激活Erk（见图。D类). 这与早期的发现一致，即在稳定表达v-Crk的成纤维细胞中，Erk活性没有增加(17)并提示Crk是JNK途径的特异性激活剂。
c-CrkII和Cas对JNK活化的影响。(A类)将COS细胞与pSRα3-（HA）JNK1-vector（JNK）以及包含野生型c-CrkII（CrkII wt）、c-CrkⅡ的SH2-突变体（R38V突变）（CrkⅡSH2m）、c-CrkII的SH3-突变体（W169L突变）（CrkII SH3m）或空pCAGGS-表达载体cDNA的pCAGG-表达载体共同转染，进行JNK免疫复合物激酶分析。通过抗c-CrkII和抗HA抗体的免疫印迹分析c-CrkⅡ和HA标记JNK的野生型和突变型的表达水平。注意，pCAGGS结构在产生的蛋白质的N末端包含myc表位。(B类)将HeLa细胞与pFR-Luc和pFA-c-Jun（1–223）（GAL4-Jun）以及野生型或突变型c-CrkII的表达载体共同转染，pSSRα表达载体编码野生型Cas（p130Cas）或其中c-Crk结合位点（也称为底物域）的Cas形式已删除（CasΔSD）或野生型Grb2（Grb2）。用荧光素酶作为报告基因分析GAL4-c-Jun（1–223）的转录活性。(C)将COS细胞与pSRα3-（HA）JNK1、pACT-c-CrkII（90 ng/孔）或pSSRα-p130Cas（500 ng/孔）共转染。将亲本pSRα3-质粒添加到转染混合物中，以保持DNA总量恒定。通过免疫复合物激酶测定JNK活性。使用的Cas-和Crk质粒的数量导致了滴定实验测定的JNK的次最大活化，这解释了与在A类和B类分别用抗c-CrkII、抗Cas和抗HA抗体通过免疫印迹分析c-CrkⅡ、Cas和HA标记JNK的表达水平。(D类)Cas的底物结构域是Cas与c-Crk结合所必需的。将COS细胞与编码野生型c-CrkII的表达载体，以及编码野生型Cas（p130Cas）的空pSSRα-载体或编码底物结构区缺失型Cas的pSSRβ-载体（CasΔSD）共转染。用抗c-CrkII抗体免疫沉淀含有相同数量蛋白质的裂解液，并用抗Cas抗体免疫印迹法研究Cas的共沉淀(左侧). 用相同的Cas抗体通过免疫印迹分析野生型和突变型Cas的表达水平，该抗体同样能很好地识别蛋白质的全长和截短形式(赖特).
Crk阻断EGF-、整合素和v-Src-诱导JNK激活的主要负形式。(A类)用pFR-Luc、pFA-c-Jun（1–223）（GAL4-Jun）和指示质粒转染HeLa细胞，并进行荧光素酶检测。Grb2 SH2m表示Grb2的显性阴性SH2突变体（R86K）。在转染表达质粒pSG-v-Src（v-Src）的细胞中评估v-Src-诱导的JNK激活。如有指示，EGF刺激按材料和方法. (B类)用pSRα3-（HA）JNK1（JNK）和所示质粒共转染COS-7细胞。将细胞直接溶解在培养皿上并进行免疫沉淀，或将细胞胰蛋白酶化并立即溶解（分离）或重新附着在涂有纤维连接蛋白（FN）的培养皿上。用免疫复合物激酶法研究JNK活性。(C)用pCMV5-（M2）JNK1（JNK）转染COS-7细胞并显示质粒，进行JNK免疫复合物激酶检测。用或不用EGF处理细胞(A类). 作为对照，通过表达pCMV5-（HA）MEKKΔ（MEKK△）来研究Crk突变表达对MEKK诱导的JNK活化的影响。(D类)用pSRα3-（HA）ERK2（ERK）和所示质粒转染COS-7细胞，并按照材料和方法用髓磷脂碱性蛋白作为底物，通过免疫复合物激酶法测定Erk活性。
c-CrkII由一个SH2和两个SH3域组成：虽然SH2域与酪氨酸磷酸化蛋白结合，N端SH3域识别细胞质蛋白中富含脯氨酸的基序，但c端c-Crk SH3域没有确定的结合蛋白或功能(23). 为了研究SH2和SH3结构域在c-Crk诱导的JNK活化中的意义，将突变型c-Crk与HA-JNK1共转染COS-7细胞。无功能SH2、c-CrkII-R38V的c-Crk突变体和无功能SH3、c-Crk II-W169L的c-Crk突变体均未增强JNK激活（图。A类). 同样，c-Crk的突变形式未能刺激c-Jun的转录活性（图。B类). 我们证实，在转染细胞中表达了类似数量的野生型和突变型c-Crk蛋白。这些结果表明，c-Crk的SH2-和SH3-结构域都是c-Crk增强JNK活性所必需的。
Crk将Cas连接到JNK路径。
c-Crk的SH2域的主要结合蛋白之一是酪氨酸磷酸化Cas（见上文）。为了进一步研究Crk SH2域参与在JNK激活中的作用，分别用Cas表达质粒和c-Crk表达质粒进行瞬时转染实验，并分析JNK激酶活性和c-Jun转录激活。Cas的单独表达水平比内源性蛋白高2倍，导致Cas-Crk复合物形成相应增加（图。D类)也刺激转染细胞中的JNK激活（图。B类). 与单独表达任一分子相比，Cas与c-Crk的共表达进一步增强了JNK的活化（图。C). 一些证据表明，Cas和Crk在JNK激活方面处于相同的途径。Cas的突变形式（CasΔSD），其中一个被称为底物结构域的区域被删除，不能与Crk相互作用（图。D类，参考。10). 当在COS-7细胞中表达时，CasΔSD没有诱导JNK激活（图。B类)CasΔSD也没有增强c-Crk诱导的JNK活化。此外，不能与Cas相互作用的c-Crk（c-CrkII-R38V）的SH2-突变形式在Cas诱导的JNK激活方面起主导负性作用（图。B类). 重要的是，这些结果表明，Crk可以作为连接酪氨酸磷酸化结合伙伴（如Cas）与JNK途径的中间产物，并进一步支持Crk SH2域参与JNK激活的重要性。
Rac是Cas和Crk诱导的JNK激活的下游介体。
在我们的研究过程中，我们在转染c-Crk或Cas表达质粒的细胞中观察到广泛的膜皱褶（图。A类). 小GTP-结合蛋白Rac被激活后，可以诱导膜皱褶的形成(24)表明Crk和Cas能有效激活Rac。事实上，Crk和Cas诱导的膜皱褶被Rac（Rac1N17）的主要负形式阻断（图。A类)，但不是通过其他GTP酶的显性阴性形式，例如RasN17（未显示）。该观察结果以及许多Crk SH3结合蛋白是小GTPase的激活剂这一事实表明，Crk可能作为酪氨酸磷酸化蛋白和小GTP结合蛋白之间的分子开关，特别是Rac，后者控制JNK通路的激活。因此，各种GTPase的主要抑制形式与c-Crk和HA-JNK1共转染，并测定JNK激酶活性。如图所示。B类Rac（Rac1N17）的显性阴性形式完全消除了Crk诱导的JNK活化。相反，显性负Rap1（Rap1N17）对Crk诱导的JNK激活的影响可以忽略不计。显性负性Rac也阻断了Cas诱导的JNK激活（未显示）。如前所述(4,5)，激活形式的Rac（Rac1V12）容易激活JNK（图。B类). 总之，这些发现表明，Crk可以有效地激活Rac，这反过来又是连接Crk和JNK激活的强制性中间步骤。尽管我们没有发现c-Crk会影响Ras-Erk通路的证据（图。D类)，显性负Ras（RasN17）的表达对Crk诱导的JNK激活有显著的抑制作用（图。B类). 因此，Crk需要一个功能性Ras分子通过Rac完全激活JNK。
(A类)c-Crk和Cas的表达以Rac-依赖的方式诱导膜皱缩。用编码绿色荧光蛋白的pEGFP-N1载体和空白对照质粒pSSRα-p130Cas或pCAGGS-c-CrkII共同转染Cos-7细胞(左侧)或使用pSRα3-Rac1N17(赖特)如图所示。转基因细胞被鉴定为绿色荧光蛋白的表达，并使用罗丹明结合的指骨样蛋白来可视化丝状肌动蛋白，如材料和方法。每个面板右上角的数字表示转染细胞显示膜皱褶的百分比。(B类)c-Crk通过GTPase Rac激活JNK。将pSRα3-（HA）JNK1（JNK）和pCAGGS-CrkII（CrkII。还显示了响应激活的Rac1（RacV12）表达的JNK激活。用免疫复合物激酶法测定JNK活性。
Crk将多个细胞刺激连接到Rac-JNK通路。
我们发现Crk可以将上游酪氨酸磷酸化蛋白（如Cas）连接到下游Rac-JNK通路，这促使我们研究Crk是否在调节JNK激活以响应细胞刺激方面具有先前未确定的作用。为了支持这一观点，许多诱导JNK激活的刺激也增加了Crk SH2域的参与。最值得注意的是，致癌v-Src和整合素的配体结合增强了Crk与酪氨酸磷酸化细胞质蛋白（如Cas）的结合(10,12,25–27)而配体激活的EGF受体可以直接与Crk的SH2域结合和结合(28,29). 在单独的研究中，所有这些刺激都被证明能有效激活JNK(4,5,30,31). 值得注意的是，还证明了v-Src和EGF刺激诱导的JNK激活可以被显性负形式的Rac和Ras阻断，其程度与我们在上文中观察到的Crk诱导JNK活化的程度相同(4,5). 为了确定c-Crk是否是从EGF受体、v-Src和整合素到JNK激活的信号级联中的必要中间产物，我们使用了上述Crk SH2-和SH3-突变体，这些突变体已被证明是Crk信号传导的特定显性负性抑制剂(7,15,18,22). 如图所示。v-Src的瞬时表达、EGF对细胞的刺激以及细胞与整合素配体纤维连接蛋白的粘附都刺激了JNK的激活。当Crk的SH2-或SH3-突变体在细胞中表达时，c-Jun的转录激活（图。A类)和JNK催化活化（图。C)对EGF刺激的反应被显著阻断。Crk突变体还有效地阻断了v-Src和整合素诱导的JNK通路的激活（图。 A类和B类). 为了验证显性阴性Crk结构的特异性，进行了几项对照实验。MEKKΔ的表达，它是JNK级联中上游激酶的激活形式，在Rac下游发挥作用(1–三)，引起JNK活性的显著增加，而这种活性没有被显性阴性形式的Crk阻断（图。C). 同样，当表达Crk的显性阴性突变体时，未观察到EGF诱导的Erk激活的影响（图。D类). 相反，相应的Grb2显性阴性突变体容易阻断EGF诱导的Erk激活（图。D类，另见参考。22)，但它们对v-Src诱导的JNK激活没有影响（图。A类)仅对EGF和整合素介导的JNK激活有中等影响（未显示）。总之，这些结果确立了Crk在连接各种不同细胞刺激与JNK激活方面的特定作用。
如上所述，一些激活JNK途径的细胞刺激物诱导Cas-Crk相互作用。因此，我们研究了酪氨酸磷酸化Cas是否是通过Crk连接整合素、EGF受体和v-Src到JNK途径的上游成分。为此，不能与Crk相互作用的Cas突变形式（CasΔSD）被用作显性负结构。如图所示。B类，CasΔSD的表达容易阻断整合素诱导的JNK激活。相反，CasΔSD的表达对v-Src或EGF诱导的JNK激活的影响可以忽略不计（图。A类)或EGF诱导的Erk激活（数据未显示）。总之，这些结果表明，Cas负责将整合素连接到Crk-JNK途径，而额外的Crk SH2-结合蛋白可能用于v-Src和EGF受体刺激的下游。
Crk SH3-结合蛋白在JNK激活中作用的表征。
为了深入了解Crk如何将上游刺激连接到Rac-JNK通路，我们研究了哪些Crk SH3-结合蛋白可以诱导JNK途径的激活。编码Sos、C3G和DOCK180的表达载体在COS细胞中表达，并通过JNK激酶分析和监测c-Jun转录激活来研究它们激活JNK通路的能力。如图所示。，Sos和C3G的表达容易诱导JNK途径的激活；其他研究人员最近也对Sos和C3G进行了类似的观察(32). 有趣的是，我们发现DOCK180的表达也导致JNK通路的强烈激活（图。)这表明这三种蛋白质中的任何一种在将Crk连接到JNK通路中都可能发挥作用。其他研究表明，Crk与DOCK180共表达，而不是与C3G或Sos共表达，导致JNK通路的协同激活，如JNK免疫复合物激酶分析所确定的（图。). 在一项更长期的c-Jun转录活性测试中，Crk与C3G共表达也证明了该途径的协同激活，而Sos再次共表达对Crk诱导的JNK途径激活没有任何影响（未显示）。缺乏特异作用于其中一个Crk SH3结合蛋白而非其他蛋白的显性阴性形式，这使我们无法直接确定它们在Crk信号传导中的作用。然而，我们发现显性负Rac是Sos和DOCK180诱导JNK活化的有效抑制剂，但它对C3G诱导JNK活化没有影响（数据未显示，另请参阅参考文献。32). 结合我们的发现，Rac是Crk诱导的JNK激活中的必需中间产物，我们的结果表明DOCK180或Sos，而不是C3G，可能将Crk连接到Rac-JNK途径。
Crk SH3域结合蛋白C3G、DOCK180和Sos激活JNK。用编码DOCK180、Sos或C3G的pSRα3-（HA）JNK1（JNK）和pCAGGS-表达载体转染COS细胞，同时表达或不表达野生型c-Crk II。如上所述，通过免疫复合物激酶分析测定JNK激酶活性，结果表示为与转染pSRα3-（HA）JNK1-载体和空pCAGGS-载体的细胞中观察到的JNK酶活性相比的折叠诱导。
讨论
衔接蛋白Crk是第一个确定的含有SH2/SH3的分子，但其在细胞内信号通路中的作用尚不清楚。田中的最新发现等。(17)提示了Crk分子和JNK途径之间的假定联系，我们在此报道的研究结果证实了这些观察结果。重要的是，我们的研究表明，从Crk到JNK途径的连接并不局限于外源性表达的Crk，但内源性c-Crk分子在通过小GTP-结合蛋白Rac将许多细胞刺激连接到JNK途径中具有生理作用。这些研究还表明，MAPK通路的模块化、保守性质可以扩展到序列性、三激酶级联之外：类似于Ras-Erk-pathway，其中Grb2通过交换因子Sos连接到小GTPase Ras，Crk可能在Rac-JNK通路上游具有类似的作用。
在以Crk依赖性方式激活Rac-JNK通路的刺激物中，EGF受体激活、致癌v-Src和整合素介导的细胞粘附。我们的结果表明，Crk的SH2结构域的作用是通过与酪氨酸磷酸化蛋白结合，将这些细胞刺激与Rac JNK途径连接起来。我们的研究进一步表明，酪氨酸磷酸化的Cas是通过Crk从整合素到JNK激活途径中的一个必要成分，而EGF受体激活和v-Src表达似乎采用了不同的机制。我们的初步数据表明，与几个酪氨酸磷酸化对接蛋白结合的Crk可能将这些刺激连接到Rac-JNK途径。在Grb2/Sos/Ras/MAPK途径中，Grb2将Sos转运到其底物Ras所在的质膜是一个重要事件。同样，Cas和其他潜在Crk SH2-结合分子的作用可能是将Crk定位在质膜附近，这可能是激活下游JNK途径所必需的。Crk作为JNK通路激活剂的作用可能不仅限于v-Src、细胞粘附和EGF刺激。酪氨酸激酶Pyk2最近被证明被肿瘤坏死因子α、紫外线照射和渗透压变化激活，并通过这些刺激作为JNK信号通路的上游介体(33). 活化Pyk2已被证明可诱导Crk SH2靶蛋白的酪氨酸磷酸化，如Cas(34–36)，Crk是否在Pyk2下游发挥作用，将这些压力信号与JNK通路耦合，还有待观察。
我们的研究结果表明，Crk通过其SH3-结合蛋白（可能是DOCK180或Sos）下游的信号级联作用到Rac-介导的JNK激活。DOCK180如何增强Rac活性尚待确定；有趣的是，初步结果表明，DOCK180可能对小GTP结合蛋白具有交换活性，因为其表达增加了细胞中的GTP/GDP比率（M.M.，未发表的数据）。Nimnual的最新结果等。(37)反过来表明Sos可能直接作为Rac的交换因子。Nimnual的研究等。还证明，Sos偶联Ras和Rac信号通路，因为Sos诱导Rac激活需要事先激活Ras；这种耦合可能解释了广泛观察到的JNK激活中Ras和Rac的需求。田中及其同事的研究强调了Crk SH3-结合蛋白C3G作为JNK途径激活剂的作用(17,32). 有趣的是，田中等。发现显性负Ras和显性负Rac都不能阻断C3G诱导的JNK激活。相反，C3G似乎通过涉及混合谱系激酶家族蛋白质的途径激活JNK(32). 在某些条件下，c-Crk是否通过Rac-independent C3G混合谱系激酶途径介导JNK活化尚待观察，另一方面，连接C3G混合谱系激酶信号级联的生理细胞刺激是什么。
Klemke的最新发现等。(38)已经证明，Cas-Crk信号复合物作为细胞迁移的“分子开关”发挥作用。这两种分子的过度表达导致细胞迁移增强，有趣的是，这被一种主要的负Rac形式所阻断。这些结果表明，Cas-Crk复合物下游的Rac活化不仅介导JNK活化，还介导细胞迁移。JNK激活与细胞迁移之间的潜在功能联系尚待研究。重要的是，克莱姆克等。发现Cas和Crk的显性阴性形式能够阻断整合素介导的触觉细胞迁移以及细胞因子诱导的迁移。这些发现进一步强调了Crk信号复合体在影响细胞运动、生长和分化的各种已知因素的作用中作为聚合点的作用。结合越来越多的证据表明JNK在许多生理和病理细胞过程中发挥作用(1–三)Crk信号复合体可能被证明是设计治疗策略的有用靶点。
致谢
我们感谢M.Russello提供的专家技术援助和B.Mayer提供的Grb2建筑。这项工作得到了美国国立卫生研究院（K.V.）CA71560拨款的支持。F.D.和M.G.-G.分别得到了美国-意大利癌症基金会和人类前沿科学计划的研究金支持。K.V.是生物医学领域的皮尤学者。
缩写
| 表皮生长因子 | 表皮生长因子 |
| 哈 | 血凝素 |
| JNK公司 | c-Jun N-末端激酶 |
| MAPK公司 | 丝裂原活化蛋白激酶 |
| SH2和SH3 | Src同源性2和3 |
工具书类
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