美国国家科学院院刊。2010年2月2日;107(5):1864年至1869年。
用于低剂量体内基因沉默的类脂质材料
,a、,1 ,b、,1 ,b中,c(c) ,b条 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,一 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,d日 ,a、,b条和b、,c、,2
凯文·T·洛夫
一麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139,
克里·马洪
b条马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所,马萨诸塞02139,
克里斯托弗·莱文斯
b条马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所,马萨诸塞02139,
c(c)马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿童医院危重护理医学部麻醉科,邮编02115
凯瑟琳·怀特黑德
b条马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所,马萨诸塞02139,
威廉·奎伯斯
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
J.罗伯特·多金
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
秦六月
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
威廉·坎特利
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
刘良琴
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
蒂莫西·拉西
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
玛丽亚·弗兰克·卡梅内茨基
d日Alnylam制药公司,地址:300 Third Street,Cambridge,MA 02142,
叶嘉宁
一麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139,
雷内·阿尔瓦雷斯
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
迪纳·W.Y.Sah
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
安东尼·德福格罗尔斯
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
凯文·菲茨杰拉德
d日Alnylam制药公司,地址:300 Third Street,Cambridge,MA 02142,
维克托·科特利安斯基
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
Akin Akinc公司
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
罗伯特·兰格
一麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139,
b条马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院David H.Koch综合癌症研究所,邮编02139,
丹尼尔·安德森
b条马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所,马萨诸塞02139,
c(c)马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿童医院危重护理医学部麻醉科,邮编02115
一麻省理工学院化学工程系,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139,
b条马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院大卫·H·科赫综合癌症研究所,马萨诸塞02139,
c(c)马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿童医院危重护理医学部麻醉科,邮编02115
d日Alnylam Pharmaceuticals,Inc.,马萨诸塞州剑桥市第三街300号,邮编:02142,
1K.T.L和K.P.M为这项工作做出了同等贡献。
由马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院Alexander Klibanov编辑,于2009年9月17日批准(2009年9月份16日收到供审查)
作者贡献:K.T.L.、K.P.M.、K.F.、V.K.、A.A.、R.L.、A.F.和D.G.A.设计的研究;K.T.L.、K.P.M.、C.G.L.、C.A.W.、W.Q.、J.R.D.、J.Q.、W.C.、L.L.Q.、T.R.、M.F.-K.、R.A.、D.W.Y.S.和K.N.Y.进行了研究;K.T.L.、K.P.M.、C.G.L.和D.G.A.分析数据;K.T.L.、K.A.W.、W.Q.和D.G.A.撰写了这篇论文。
自1998年Fire和Mello发现RNA干扰(RNAi)以来(1)和2001年Tuschl及其同事的siRNAs(2),已经为其在人类中的治疗应用做出了相当大的努力(三). 传递面临的最重大挑战包括siRNA分子的相对较大尺寸(~13kDa)和负电荷,以及它们对体内酶降解的敏感性(4,5). 在一些应用中,无载体的裸siRNA的有效传递可能是可能的(6,7). 然而,向包括肝脏在内的许多组织的系统递送需要载体来提供siRNA的保护和运输到感兴趣的细胞。为此,已经开发了各种利用天然和合成材料的载体系统(8–15). 阳离子脂质是研究最为深入的siRNA传递合成材料之一。迄今为止,这些材料中最先进的例子证明了通过静电相互作用将siRNA结合并浓缩成纳米复合物的能力,并将有效载荷穿过细胞膜传递到靶细胞的细胞质中(16,17).
此前,Akinc等人(2008)报告了一种高通量组合方法,用于siRNA递送应用的新材料合成和发现(15). 利用Michael加成化学创建了一个结构多样的氨基烷基丙烯酸酯和丙烯酰胺材料库,称为“类脂质”,然后对其在体内外转染细胞的能力进行分析。初步研究的主要候选者被证明能够促进多种细胞靶点和动物物种的序列特异性敲除,包括小鼠、大鼠和非人类灵长类动物。尽管前景看好,但使用这些材料进行传递需要siRNA剂量大于1 mg/kg才能在体内实现高水平的基因沉默(18). 这种剂量与稳定核酸脂质颗粒(SNALP)制剂所需的剂量相当,这是另一种在非人类灵长类动物中显示出siRNA递送实用性的递送系统(14). 为了显著扩大基于脂质的配方的治疗潜力,具有改进疗效的不同材料将非常有用。
结果和讨论
组合环氧衍生类脂化合物库的合成。
为了确定越来越有效的输送材料,我们采用了独特的合成策略,快速建立了一个基于环氧化合物化学的类脂化合物库。该库由不可降解的氨基醇组成,由极性含胺的头部基团和非极性碳氢化合物尾部组成。化合物的合成是通过胺底物有效地开环环氧化物来实现的(). 这种合成策略特别适合于平行合成和高通量筛选,因为反应可以在无溶剂的情况下进行,不需要保护/脱保护步骤,并且合成的材料可以在无需净化的情况下用于基于细胞的筛选。与之前的方案相比,这种综合策略的一个优点是(15)反应通常在3d内完成。使用这种一步法,创建了一个包含126个类脂质化合物的库,并在无需进一步处理的情况下在细胞中测试反应产物。
环氧衍生类脂化合物库的合成(A类)合成组合文库时使用了端环氧烷基链和含胺单体(B类)通过高效开环将环氧化合物添加到胺中可以实现库成员的并行合成
脂质体介导的siRNA体外传递。
在荧光素酶表达的Hela衍生细胞系中,以高通量方式在体外筛选类脂物质。这些细胞经过基因改造,可以稳定表达这两种报告蛋白firefly萤火虫和动物海肾荧光素酶(15). 在这些实验中,将抗萤火虫萤光素酶siRNA与脂质体以2.5∶1、5∶1、10∶1和15∶1的重量比复合,并在生长介质的存在下与细胞孵育。缺乏萤火虫荧光素酶表达减少雷尼利亚减少被认为是siRNA介导的沉默。雷尼利亚作为脂质相关毒性的内部控制,对其表达进行了监测。在没有不良反应证据的情况下也进行了细胞毒性试验(图S1)在这一筛选中,鉴定了许多促进荧光素酶沉默的化合物,包括三种沉默率超过90%的化合物(A类). 为了便于图形表示,只显示了5∶1重量比数据。有趣的是,从这些结果中,出现了许多结构-活性关系。就尾部长度而言,表现最好的15个结构中有7个具有长度为14个碳的尾部。此外,没有尾巴长度小于12个碳的化合物介导的沉默大于30%。关于胺头组,胺113存在于前两个表现化合物和前15个表现化合物中的三个中。虽然C14尾部和胺113的聚合很明显,但并非所有含有这些结构的化合物都表现出沉默活性。例如,C8-113和C14-116均不促进体外基因沉默,这表明胺基和尾长的优化组合对于传递活性是必要的。
类脂化合物库的体外筛选。在荧光素酶表达的Hela衍生细胞系中筛选类脂化合物。(A类)抗萤火虫荧光素酶siRNA与类脂化合物复合,并在生长介质中与细胞孵育。通过比较治疗组和未治疗对照组中检测到的蛋白水平来确定萤火虫荧光素酶的相对表达。(B类)低剂量siRNA(s.d。,n个 = 4)
为了研究小剂量siRNA的体外疗效,进行了一项剂量反应,其中细胞暴露于滴定浓度的含siRNA的脂质复合物。将siRNA与细胞以5至50纳克(ng)的剂量孵育,脂质与siRNA的比例保持恒定为5∶1(wt∶wt)。从这些实验中,确定了三种化合物,在每孔5 ng的siRNA剂量下,有助于70%以上的沉默(B类).
小鼠肝细胞体内siRNA的传递。
虽然体外给药实验有助于识别具有体内给药潜力的化合物,但我们发现,它们对识别最有效的体内给药化合物没有很高的预测性。为了评估基于环氧基的类脂化合物在促进体内siRNA传递方面的效用,采用小鼠因子VII基因沉默模型(15,18). 静脉注射含有抗凝血因子VII的siRNA的类脂化合物。因子VII是评估肝细胞特异性递送的一个有用的基因靶点,因为该蛋白仅在肝实质细胞中产生,分泌到血液中使蛋白质易于定量,并且具有相对较短的血浆半衰期(15).
从最初的体外筛选中分离出12种性能最好的类脂化合物,并对其体内性能进行了纯化和评估。对于体外实验,siRNA和类脂化合物的简单络合足以形成颗粒和细胞传递。然而,在静脉给药期间,屏障(如与血清蛋白的静电相互作用、免疫系统细胞的吸收以及脾和肺等区域的聚集)会抑制肝细胞的给药。为了提高脂质颗粒的血清稳定性,配方中使用了二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和聚乙二醇(PEG)(15). 在体内筛选实验中,以类脂化合物∶DSPC∶胆固醇∶PEG的恒定重量比配制类脂化合物,并通过尾静脉注射给小鼠一次3 mg/kg总siRNA的剂量。在实验期间,还对小鼠的体重进行了监测,因为体重下降可能表明类脂颗粒治疗相关的毒性。不同配方的平均粒径不同,从65 nm到250 nm不等。。从这个筛选中,发现三种化合物在给药剂量下有助于完全沉默(A类). 虽然这些结果证明了环氧类脂化合物能够有效降低肝细胞中的蛋白质水平,但对前三种化合物C16-96、C14-110和C12-200进行了剂量反应实验,以研究低剂量下沉默的效力(B类–D类). 三种受试脂质中的每一种都实现了剂量依赖性基因沉默,其中一种化合物C12-200的效力比LNP01高出两个数量级(18),根据先前的丙烯酰胺和丙烯酸酯类脂质材料库优化的肝脏给药配方。以1 mg/kg的剂量给药配制的对照siRNA,以确认基因沉默的特异性(D类).
在小鼠体内沉默因子VII。A类)纯化来自体外筛选的表现最好的类脂,配制用于血清稳定性,并静脉注射给C57BL/6小鼠。小鼠通过尾静脉注射单次注射3 mg/kg总siRNA,并在注射后72 h对因子VII水平进行量化。B类–D类)体内筛选的前三类脂质的剂量反应实验;C16-96号(B类),C14-110(C类)和C12-200(D类). 通过体重损失测量,未观察到脂质相关毒性(E类). (日期:。,n个=3或4*P(P) < 0.005, **P(P) < 0.001; t检验,单尾)
也许低剂量给药最重要的优点是显著减少了将小干扰RNA运输到靶点所需的载体材料数量。C12-200的效力比LNP01提高了几百倍,这意味着给药的siRNA药物和脂质制剂材料都减少了。如果在人类中效价也有类似的提高,这将导致注射的siRNA剂量从100毫克以上减少到1毫克以下,同时也会减少给药制剂辅料。通过有效降低诱导沉默所需的siRNA和配方材料的剂量,由此产生的脂质相关耐受性应大大提高。这一概念得到了小鼠耐受性分析的支持,在小鼠中,在1 mg/kg剂量下,没有观察到任何毒性迹象,比有效剂量高几个数量级(E类,).
表1。
剂量 | 高度(U/L) | AST(U/L) | ALP(单价) | 胆红素(dL |
0毫克/千克 | 42.3 ± 6.0 | 90.7 ± 15.0 | 183.0 ± 8.9 | 2±0.0 |
0.06毫克/千克 | 40.7 ± 4.6 | 74.0 ± 12.8 | 219.3 ± 35.3 | 2 ± 0.0 |
0.02毫克/千克 | 47.3 ± 10.1 | 103.3 ± 11.8 | 178.7 ± 46.5 | 2±0.0 |
0.2毫克/千克 | 52.0 ± 6.2 | 161.0 ± 66.2 | 229.0 ± 46.4 | 2 ± 0.0 |
0.6毫克/千克 | 40.7 ± 6.8 | 102.3 ± 15.1 | 201.3 ± 37.4 | 2 ± 0.0 |
1毫克/千克 | 37.0 ± 7.8 | 77.7±25.5 | 123.3 ± 25.6 | 2 ± 0.0 |
接下来,我们研究了C12-200配方siRNA介导的基因沉默的持久性。小鼠接受0.1或1 mg/kg配方siRNA的单次静脉注射,并监测40天以上的血清因子VII水平(). 在这两种剂量下,在24小时内观察到完全沉默,蛋白质水平分别在0.1和1 mg/kg剂量的20和35天内恢复到基线水平。这些结果表明,较大的siRNA剂量可能导致较长的作用持续时间,进一步突出了以有效剂量的较高倍数给药的潜力。
通过监测因子VII蛋白水平超过40天来研究C12-200介导的沉默在体内的持续性。我们给小鼠单次注射1或0.1 mg/kg siRNA,并在不同的时间点采集血样,以定量血清蛋白水平。(日期:。,n个=3)
低剂量功效使体内多基因沉默。
由于C12-200实现了高效的基因沉默,我们假设单次静脉注射可以沉默肝脏中的多个基因,同时保持在先前实验确定的耐受范围内。可以预见,调节多个基因的能力可能为已经确定多个基因靶点的疾病提供一种强有力的治疗方法(14,19). 为了研究这种方法的可行性,将针对可能具有治疗意义的肝靶点、因子VII、载脂蛋白B、PCSK9、Xbp1和SORT1的siRNA序列汇集在一起,并用C12-200配制。ApoB、PCSK9、XBP-1和SORT1都是参与胆固醇稳态代谢途径的基因,这些基因的突变与敲除小鼠模型或人类遗传关联研究中胆固醇水平的改变有关(20–23). 载脂蛋白B在胆固醇从肝脏转运到血浆中起作用,PCSK9在胆固醇从血浆清除回肝脏中起作用;XBP-1与胆固醇合成有关,而SORT1的机制作用尚不清楚(20–23).
沉默这五个特定基因本身并不能提供任何协同治疗效果;然而,同时沉默所有五个基因是一种原理证明,参与相似或不同信号通路的多个基因可以通过单次给药选择性沉默。在本实验中,小鼠接受单次静脉注射C12-200配制的siRNAs池,并在给药后72小时采集肝组织以分析mRNA转录水平。通过将每种siRNA的剂量从0.2 mg/kg滴定到0.005 mg/kg来研究剂量依赖性沉默效应。在每种siRNA 0.2 mg/kg的剂量下(总siRNA剂量为1 mg/kg),观察到所有五个基因的沉默率超过65%(). 与上述耐受性研究一致,未观察到任何不良副作用。
用C12-200配制的混合siRNAs单次注射可同时沉默五个肝细胞基因靶点。我们给小鼠注射了单剂量,剂量分别为0.2和.005 mg/kg/siRNA。注射后72小时,采集肝组织以分析基因转录水平。(日期:。,n个 = 5).
据我们所知,这是体内同时存在siRNA介导的五个肝靶点沉默的最早报告。考虑到C12-200介导的传递的效力,我们假设更多的基因可以被混合的siRNA产物同时沉默。从治疗的角度来看,这可以实现更复杂的治疗方法,沉默多个靶点可以提高治疗效果(24). 例如,这种策略在治疗病毒感染(如丙型肝炎病毒(HCV))时可能特别有用,在这种病毒感染中,快速进化的病毒基因组对于单一序列的siRNAs来说是难以捉摸的。事实上,这一想法已经在体外得到证实,利用内核糖核酸酶前体siRNA和编码短发夹RNA的逆转录病毒载体对HCV基因组的多个区域进行传递(25). 这种多靶点方法也可能允许采用不同的策略来治疗多因素疾病,如代谢综合征、癌症或涉及多种基因和途径的传染病。
研究C12-200介导的细胞传递机制。
为了研究C12-200颗粒内化的机制,将标记有Alexa-Fluro®647的非特异性抗GFP siRNA输送至HeLa细胞,以观察siRNA的摄取和细胞内转运。在这些实验中,在已知通过不同内吞途径进入细胞的标记物存在下,将C12-200配制的siRNA与HeLa细胞孵育。如所示A类,标记的siRNA与液相标记物右旋糖酐共定位,但不与转铁蛋白或霍乱毒素B共定位,后者分别是网格蛋白和小窝介导的内吞标记物。这表明C12-200颗粒可能通过大胞饮作用机制被内吞(26,27). 这种摄取途径的特征之一是膜皱褶和肌动蛋白重排(28)在施用颗粒后15分钟内在HeLa细胞中观察到(B类). 此外,使用我们的输送系统检测了大胞饮抑制剂5-N-乙基-N-异丙酰胺(EIPA)和肌动蛋白聚合抑制剂细胞抑素D对颗粒摄取的影响(26). 这两种化合物都剂量依赖性地抑制siRNA的摄取(C类,D类)这进一步表明,大多数C12-200形成的siRNA可能通过大胞饮作用进入细胞。据报道,在某些细胞类型中,大松果体的液体含量不与降解途径融合(29,30). 我们假设,C12-200非功能沉默可能通过避免溶酶体降解而增强,溶酶体降解是通过经典内吞途径进入细胞的药物递送载体所遇到的常见问题(31).
C12-200-siRNA颗粒通过大胞饮作用诱导细胞摄取。(A类)用C12-200配制的荧光标记siRNA与HeLa细胞在存在各种内吞途径标记的情况下孵育。含有siRNA的颗粒与标记的葡聚糖共定位,葡聚糖是一种已知通过大胞饮作用进入细胞的液相标记物(白色箭头)。(B类)肌动蛋白纤维的荧光标记显示膜皱褶(白色箭头所示)和肌动蛋白重排,这是HeLa细胞暴露于C12-200-siRNA颗粒后15分钟内通过大胞饮作用摄取的标志性指标。(C类,D类)细胞预先暴露于EIPA和细胞分裂素D(分别为大胞饮作用抑制剂和肌动蛋白聚合抑制剂)会以剂量依赖的方式减少C12-200-siRNA颗粒的摄取。(同上。,n个 = 3, ***P(P) < 0.005; **P(P) < 0.01; *P(P) < 0.05
非人类灵长类动物C12-200介导沉默的研究。
为了进一步研究这些材料的潜力,C12-200是用特异于转甲状腺素(TTR)的siRNA配制的,并在非人类灵长类动物中进行了沉默评估。TTR是一种主要在肝细胞中合成的血清蛋白。虽然淀粉样变性TTR突变很少见,但它们是某些人群的特有基因,可影响周围神经和心脏,分别导致家族性淀粉样多发性神经病和家族性淀粉状心肌病。目前,唯一的疾病改良疗法是肝移植。C12-200-siRNA介导的突变型TTR沉默是治疗TTR淀粉样变的潜在途径(32). 非人类灵长类动物注射C12-200-TTR siRNA后,在0.3 mg/kg、0.1 mg/kg和0.03 mg/kg剂量下产生了高水平的特异性敲除(). 据我们所知,这种配方提供了迄今为止在灵长类动物中报道的最有效的击倒。
C12-200对非人灵长类动物的疗效。食蟹猴(n个=3/组)接受PBS或0.03、0.1或0.3 mg/kg siTTR,在C12-200中配制,通过头静脉静脉输注15分钟(5 mL/kg)。给药后48小时从动物身上采集肝脏活检。TTR公司mRNA水平与GAPDH公司测定肝脏样品中的mRNA水平。数据点代表组平均值±s。d日
我们认为,开发安全有效的siRNA运载工具是基于RNAi疗法持续发展的重要组成部分。随着C12-200等高效材料的鉴定,拓宽治疗指数、持续基因沉默和多靶点治疗疾病的方法可能会实现。
方法
类脂化合物合成。
库中的化合物是通过烷基环氧化物与一些胺反应合成的。添加基底计量量的环氧化合物,以增加比给定胺单体可能的总尾巴少一条的产品比例。胺(1当量,通常为1毫摩尔(mmol))和环氧化物([N个−1]当量,其中N个是二级胺的数量加上胺起始材料中的二级胺数量×一级胺数量)添加到含有磁力搅拌棒的2mL玻璃瓶中。密封小瓶,将反应加热至90°C并搅拌2.5 d。用MALDI-TOF质谱对选定的粗反应混合物进行了表征(表S1); 光谱显示,混合物主要含有N个和[N个−1]预期的尾随产品。粗反应产物用于体外筛选;产品组可以通过在硅胶上用梯度洗脱CH的色谱法,通过脂尾的数量来分离2氯2至75∶22∶3 CH2氯2/甲醇/氨水4OH(水)。
类脂质siRNA制剂。
用于体内筛选的脂质siRNA制剂由脂质、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质制成,如前所述(15,18). 脂质、胆固醇(MW 387,Sigma-Aldrich)和mPEG2000-DMG(MW 2660,由Alnylam合成)的储备溶液(15)分别在浓度为100、20和100 mg/mL的无水乙醇中制备。组合组分,得到重量分数52∶20∶28。然后将乙醇混合物添加到200 mM醋酸钠缓冲液(pH 5)中,同时搅拌以自发形成空脂质体。将浓度为10 mg/mL的siRNA溶于50 mM醋酸钠中,以10∶1总脂质∶siRNA的重量比添加到空脂质体中,并在37°C下培养30分钟。然后在3500 MWCO透析盒(Pierce)中针对PBS对配方进行75分钟的透析。交换缓冲液后,使用每种配方的样品进行颗粒表征。采用改良的核糖核酸酶分析(Invitrogen)定量小干扰RNA的包封程度(33)并且通过动态光散射(ZetaPALS、Brookhaven Instruments)测量平均粒径。
C12-200-siRNA制剂采用Jeffs等人的方法制备(34)简单地说,C12-200、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和mPEG2000-DMG在90%乙醇中以50∶10∶38.5∶1.5的摩尔比溶解。将siRNA(或siRNA池)溶解在浓度为0.4 mg/mL的10 mM柠檬酸盐、pH 3缓冲液中。乙醇脂质溶液和siRNA水溶液通过装有双泵头的蠕动泵以等效体积流量泵送,并在“T”形接头中混合。以总脂质与siRNA之比7∶1(wt∶wt)将脂质与siRNA结合。针对PBS(155 mM NaCl,3 mM Na)透析自发形成的C12-200-siRNA制剂2高性能操作4,1 mM千赫2人事军官4pH7.5),以去除乙醇并交换缓冲液。该配方的平均粒径为80 nm,siRNA包封率约为90%。
体内因子VII与小鼠多基因沉默。
动物研究中使用的所有程序均由动物护理和使用机构委员会批准,并符合适用的地方、州和联邦法规。C57BL/6小鼠(Charles River实验室)用于siRNA沉默实验。注射前,在PBS中以siRNA浓度稀释配方,以便给每只小鼠注射0.01 mL/g体重的剂量。通过尾静脉注射给药。48或72小时后,测量体重增加/减少,并通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉,以通过眼眶后出血收集血样。用血清分离管(Falcon tube,Becton Dickinson)分离血清,并通过显色分析法(Biophen FVII,Aniara Corporation)分析因子VII蛋白水平。使用PBS注射小鼠的样品构建标准曲线,并通过比较治疗组和未治疗PBS对照组来测定因子VII的相对表达。
在多基因沉默研究中,评估了用C12-200配制的五种siRNA池或以荧光素酶为靶点的对照无关siRNA处理的小鼠的肝脏中的因子VII、ApoB、PCSK9、XBP-1和SORT1 mRNA水平。将冷冻肝组织研磨并制备组织裂解物。使用分支DNA分析(QuantiGene试剂系统,Panomics)测定裂解液中归一化为GAPDH的因子VII、ApoB、PCSK9、XBP-1和SORT1 mRNA水平。将C12-200配方的五种siRNA池处理的小鼠中的靶/GAPDH水平归一化为C12-200配制的荧光素酶对照siRNA处理的小鼠的相应靶/GAPDH水平后,绘制出靶/GAPTH水平。
siRNA摄取和显微镜检查。
HeLa细胞购自ATCC。Alexa-Fluo®488标记的右旋糖酐、转铁蛋白、霍乱毒素和卵磷脂购自Invitrogen。将细胞接种在96 well板(Grenier)中过夜,然后用C12-200配方Alexa-647标记的siRNA孵育15分钟至3小时。在用Hoescht进行核染色之前,在纳米粒子孵育的最后15分钟期间添加标记的货物。在一些实验中,EIPA或细胞分裂素D(Sigma-Aldrich)在与持续存在药物的C12-200颗粒孵育之前与细胞预孵育1小时。为了检查肌动蛋白皱褶,将细胞血清饥饿1小时,然后在无血清培养基中添加颗粒物15分钟。细胞固定在4%的多聚甲醛中,用0.1%的皂苷渗透,并用Alexa-Fflor®488指骨苷染色。使用Opera旋转圆盘共焦系统(Perkin Elmer)采集所有图像,并使用Acapella软件(Perkin-Elmer)分析数据。