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头颈癌。2009; 1: 39.
2009年12月16日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1758-3284-1-39
预防性维修识别码：PMC2803165型
PMID：20015401

MAGE-A作为口腔鳞癌诊断准确性的新方法：一例报告

菲利普·梅茨勒,通讯作者1,2 努尔·莫拉奥格鲁,三 斯蒂芬·施瓦兹,4 弗里德里希·纽卡姆,2 埃梅卡·恩肯克,2和尤塔·里斯2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

本病例报告的目的是介绍刷式活检和MAGE-A表达测量在口腔鳞状细胞癌（OSCC）诊断中的联合应用。

病例报告

我们报告一位49岁的男性患者，他被转诊到我们的科室，患有一种持续疑似的白斑。临床诊断后进行刷检和切口活检。组织病理学检查未发现恶性肿瘤。由于先前在口腔鳞癌中检测到的黑色素瘤相关抗原A（MAGE-A）的高流行率，因此使用实时RT-PCR对刷检材料进行了黑色素瘤关联抗原A（MAGE-A）表达分析。结果表明，MAGE-A3和A4的表达模式显著。因此，病变被完全切除，并确定为早期浸润性癌。

结论

这些结果强调了使用高表达率肿瘤标记物结合高灵敏度和高特异性检测系统进行刷检在口腔鳞癌早期诊断中的作用，特别是在广泛白斑中。

介绍

早期发现口腔鳞状细胞癌（OSCC）可将患者的五年生存率提高到80%左右。因此，早期诊断是降低发病率和死亡率的最有效途径。在常规随访中，肿瘤学家和头颈外科医师在长期观察期内，经常会遇到口腔粘膜的可疑甚至非可疑病变，尤其是肿瘤切除后或放疗后的凹陷区域。在过去的几十年里，辅助方法已经出现，以促进口腔癌前病变和恶性病变的诊断[1]. 迄今为止，切口活检和组织病理学评估是诊断可疑口腔病变最准确可靠的方法[2]. 组织病理学诊断和接下来的手术和/或放化疗方法取决于主观识别、确定模糊口腔病变的最合适部位和足够的采样。因此，切口活检可能有一些局限性，特别是在广泛的病变或没有组织病理学改变或分子改变临床证据的区域（如局部癌变）[三-5].

目前的文献显示了几种辅助取样和诊断技术，以获得关于口腔上皮恶性分化和转化的知识[1,6]. 在过去的十年里，口腔粘膜病变的刷式活检作为一种非侵入性细胞取样方法引起了人们的新兴趣，并开发了各种新的细胞学分析技术。尽管这种技术得到了广泛应用，但传统的脱落细胞学方法显示出79%至97%的有限敏感性和95.1%至99.5%的特异性[7]. 尽管以前已经做出了很有希望的分析努力，使用这种方法来最大限度地减少假阳性和阴性结果，但它仍然有一些缺点[7,8]. 然而，直到现在，口腔粘膜病变的恶性转化的早期检测，尤其是在明显无害的病变中，仍然是一个问题[9]. 因此，本病例报告旨在利用一种客观的高流行肿瘤标记物，结合高灵敏度和特异性的分子检测分析，促进口腔癌脱落细胞学的系统诊断。因此，本病例报告试图介绍刷子活检和MAGE-A表达测定联合应用诊断口腔鳞癌。

病例报告

一名49岁的患者在左口底口腔鳞状细胞癌（OSCC）手术后被送往埃朗根-纽伦堡大学口腔颌面外科，包括下颌骨部分切除、颈部解剖和局部重建。组织病理学检查显示pT1 pN0 cM0 G2 R0状态。由于侵犯深度低达3mm，因此未进行辅助放疗。患者在定期随访期间受到密切监测。五个月后，患者的左腭舌弓被诊断出白斑（图​（图1）。1). 未发现硬结。随后，用手术刀在最可疑的部位对病变进行了活检。切口活检的组织学检查显示角化过度和角化不全（以角质层细胞核保留为特征的增厚和角化），但无恶性病变（图​（图2）。2). 此外，使用商用细胞刷（细胞刷®加上GT，Medscan Medical AB，瑞典）。在中等压力下进行采样，并在整个病灶内永久旋转，以采集细胞。根据巴巴尼科劳的说法，通过细胞折叠、风干和染色，将刷子卷到载玻片上。以下标本的组织病理学分析显示上皮异型增生（不典型上皮细胞，多角形上皮细胞显示清晰的细胞质和同构的椭圆形小细胞核）（图​（图3）。三). 为了进一步准确地对脱落细胞学进行系统诊断，我们建立了一种高灵敏度的多标记实时RT-PCR检测方法，通过刷检检测OSCC相关MAGE-a基因。作为阴性对照，对健康的对侧口腔粘膜进行涂片。以下分子分析显示，与未测定MAGE-a表达谱的健康口腔粘膜相比，白斑中MAGE-A3和A4的表达显著增加（图​（图44和​和5）。5). 最后进行了手术切除和进一步的组织病理学检查，发现口腔粘膜早期浸润癌（图​（图66).

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角化过度和角化不全（H&E，油浸，放大630倍）.

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具有多边形上皮细胞的非典型上皮细胞显示出清晰的细胞质和同构的卵圆形小细胞核（巴氏染色，油浸，放大630倍）.

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实时RT-PCR、NOM*（正常口腔粘膜）分析MAGE-A3和-A4的表达；Rn表示随时间变化的原始荧光信号.

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实时RT-PCR、NOM*（正常口腔粘膜）分析MAGE-A3和-A4的表达；Rn表示随时间变化的原始荧光信号.

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早期癌症（H&E，油浸，放大400倍）.

材料和方法

RNA的分离

根据制造商的方案（AMS Biotechnology，Europe），使用RNA-Bee提取方法从通过细胞刷收获的细胞中提取总RNA。此外，根据制造商的说明，通过“芯片实验室”方法（生物分析仪2100；安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托）评估RNA的质量和数量。

使用One Step RT-PCR Kit（德国希尔登Qiagen）评估RNA质量，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）特异性引物扩增cDNA，并在2%琼脂糖凝胶上分析GAPDH-PCR产物。为了排除扩增基因组DNA序列产生的假阳性结果，而这些基因组DNA序列并没有通过DNA消化完全消除，从每个样本中纯化的RNA使用PCR的特定引物进行基因组GAPDH扩增测试。然后在2%琼脂糖凝胶上分析GAPDH-PCR产物。在随后的程序中，只分析了在RT-PCR中显示特定扩增产物的RNA分离，而基因组扩增没有可见带。所有切口活检和细胞学检查均由埃朗根-纽伦堡大学病理研究所进行。

反转录和实时PCR

根据制造商的协议，使用高容量cDNA档案试剂盒（Cat.4322171；Applied Biosystems，CA，USA）合成来自总RNA的cDNA。实时RT-PCR分析使用QuantiTect引物分析（Qiagen；MAGE-A3的[Hs_QT01841224 QuantiTeck引物分析]和MAGE-A4的[Hs _QT01-841225 QuantiTech引物分析]]）进行。对于归一化，使用GAPDH[Hs_GAPDH_QT000792471 QuantiTect Primer Assay]。mRNA的检测采用ABI Prism 7300序列检测系统（德国魏特施塔特应用生物系统公司）。QuantiTect TM SYBR®使用绿色PCR试剂盒（Cat.204143；Qiagen）进行PCR扩增。简单地说，每次PCR反应使用50 ng cDNA，总体积为25μl。用于实时PCR的循环条件如下：在95°C下初始变性/酶激活15分钟，然后在94°C下40个循环变性15秒，在55°C下退火30秒，在72°C下伸长率34秒。PCR后的熔融曲线分析验证了特定产物的扩增和存在。Ct值<33被推荐为靶基因表达阳性。所有反应均以三重态进行，并通过第二次分析进行验证。结果如图所示。​图4。4在PCR过程中，通过PCR后的熔融曲线分析来评估有助于荧光的不良副产物的形成。

讨论

尽管手术重建和放化疗方案不断改进，但早期发现和诊断口腔鳞癌仍是降低发病率和死亡率的最有效方法。

口腔临床检查在鉴别癌前病变和恶性病变方面不够敏感[7,10,11]. 迄今为止，通过手术刀活检和随后的组织学检查获取组织是诊断癌前和恶性口腔疾病的金标准。因此，应根据病变的组织病理学结果进行适当的临床干预。很明显，对可疑病变进行的切口活检在整个病变中的重复性有限[4]可能会导致或多或少的攻击性手术和/或放化疗方法。一些作者甚至描述了组织学诊断的观察者间和观察者内的变异性[12,13]. 因此，确定进一步的诊断工具对于获得任何可疑病变的最具代表性的分析仍然至关重要。

口腔细胞学作为一种辅助的非侵入性采样技术，在早期诊断和监测前驱病变和口腔癌方面越来越重要。广泛病变内的经上皮“现场定位活检”对于细胞学评估和进一步研究更为重要[14].

分子肿瘤标记物分析可以显著提高刷检法的诊断准确性，从而减少由于诊断材料不足而导致的假阴性诊断[7]. 恶性上皮转化被认为是多种遗传和表观遗传改变的过程，在肿瘤发生中起着重要作用。细胞变化发生在分子水平上，然后才出现在临床部位或病理组织学检查中，这使得它们成为诊断细胞发育和转化的重要补充工具[15,16]. 即使是高度异型增生也意味着已建立的恶性转化的预测性预后标记，而低度和中度异型增生仍有进一步恶性转化的未知风险[5]. 然而，这些实体也应该通过组织病理学和分子变化的结合来预测[17]确保正确的风险评估。通过早期干预，及早发现癌前和恶性分子细胞变化，可以降低治疗范围、发病率和死亡率。

在这项研究中，我们使用了MAGE-A3和A4编码基因，这些基因在各种肿瘤类型中表达，而在除睾丸、胎盘和胎儿组织外的所有正常组织中基因沉默[18]. 在目前的文献中，一些作者描述了MAGE-A抗原在口腔鳞状细胞癌中的多重表达[19-22]. 我们的研究小组描述了黑色素瘤抗原（MAGE-A1-A6和-A12）在口腔鳞癌中的高总和表达模式，超过93%[23,24]. 因此，这些对细胞恶性肿瘤高度特异的标记物的检测使其成为早期诊断和预后的潜在标记物，甚至成为免疫治疗的靶点。我们使用了实时RT-PCR分析，它甚至可以检测到少量MAGE-RNA[25,26]. 在本病例报告中，我们进一步将这些高度流行的肿瘤标记物与这种敏感的检测方法结合起来，使用刷子活检材料对口腔鳞癌进行早期诊断。

因此，该方法为早期检测高危OSCC患者（例如，在初步诊断后，吸烟和/或酗酒）提供了一种新的方法。此外，对于恶性转化率不可预测的明显无害的口腔病变的进一步诊断和治疗也有重要帮助[11]. 该方法可转移到所有其他肿瘤标记物和肿瘤实体，因为它代表了各种肿瘤筛查设置的一个有希望的替代方案。

通过识别高流行的肿瘤标记物，结合使用刷子活检材料的高灵敏度和特异性分子检测分析，发现可疑病变的恶性组织改变。

结论

对癌前病变和恶性病变组织病理学改变的单一形态学解释及其预测性恶性风险评估在未来将变得不足。客观技术，尤其是在相互矛盾的细胞病理学发现中，将有必要进一步了解上皮转化的等级和过程，以确保适当的临床治疗。因此，这种新方法可能是提高敏感性和特异性的第一步，甚至有助于客观地早期诊断少数恶性细胞。

相互竞争的利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

PM收集了组织样本并起草了手稿。NM进行了RT-PCR。SS对样本进行了组织学和细胞学检查。FWN参与了其设计。EN构思了该研究并参与了该研究的设计。JR进行了分子标记并进行了统计分析。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（DFG）的支持。

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