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致癌物。作者手稿；PMC 2010年1月5日发布。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2005年4月；24(18): 2992–3001.
数字对象标识：10.1038/sj.onc.1208483
预防性维修识别码：项目经理2800996
大厅：哈尔姆斯433166
PMID：15735710

人VE-cadherin启动子受到器官特异性调节，并在肿瘤血管生成中被激活

玛丽·海莱恩·普兰迪尼,1 英格·德雷尔,2 Stéphanie Bouillot酒店,1 苏希拉·本克里,1 托马斯·摩尔,2和菲利普·胡贝尔1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

血管内皮（VE）钙粘蛋白仅在正常血管和肿瘤血管的内皮连接处表达。在本报告中，我们描述了人类VE-cadherin启动子的转录活性。瞬时转染分析显示，位于–1135/-744和–166/-5碱基对的序列对内皮细胞中的启动子活性至关重要。我们发现近端区域的特定序列与Ets和Sp1家族成员相互作用。创建转基因小鼠，人类VE-cadherin启动子能够在胚胎中对LacZ基因进行正确的时空表达。在成人中，转基因在肺、心脏、卵巢、脾脏和肾小球中特异性强表达，而在其他器官（包括大脑、胸腺、肝脏和骨骼肌）的血管系统中弱表达或不表达。肿瘤移植物和Matrigel植入物中的新生血管有强烈的染色，表明在血管生成情况下启动子活性增强。此外，Matrigel和转染实验表明VE-cadherin启动子受到bFGF诱导。在中枢神经系统的血管外部位也发现了转基因表达，这表明沉默元件可能位于基因的其他部位。这些结果是解决VE-cadherin基因的器官和肿瘤特异性调节的第一步。

关键词：动物，抗原，CD，碱基序列，钙粘蛋白，遗传学，代谢，基因表达调控，肿瘤，生理学，人类，小鼠，小鼠，转基因，分子序列数据，肿瘤，遗传，代谢，新生血管，病理学，遗传学，新陈代谢，器官特异性，启动子区域，遗传
关键词：钙粘蛋白、内皮细胞、启动子区、肿瘤血管生成、转基因小鼠

简介

血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin，CD144）属于粘附受体钙粘蛋白家族(布雷维亚里奥等。, 1995;甘比纳，1996年;兰普尼亚尼等。, 1992). 该分子在血管组装中起着关键作用(卡莫利特等。, 1999;科拉达等。, 1999;科拉达等。, 2002;戈尔·福雷等。, 1999;廖等。, 2002)和内皮通透性(科拉达等。, 2001;高等。, 2000;戈奇等。, 1997;古利诺等。, 1998;霍迪克等。, 1999;Wong（王）等。, 1999). VE-cadherin具体位于内皮细胞间连接处(布赖尔等。, 1996;兰普尼亚尼等。, 1992)在成血管细胞的表面(Asahara公司等。, 1999;腮等。, 2001;西川等。, 1998). 这种跨膜蛋白是所有类型内皮细胞的通用标记物，早在胚胎第7.5天（E）小鼠胚胎血管母细胞中就检测到其表达(布赖尔等。, 1996;兰普尼亚尼等。, 1992).

VE-cadherin的内皮特异性转录活性可能位于小鼠基因上游2.5 kb序列内(戈尔等。, 1999). 该区域包含对其活性至关重要的Ets和Sp1结合位点(戈尔等。, 1998). 最近，我们使用该启动子驱动疱疹病毒-胸苷激酶基因在转基因小鼠内皮细胞中的表达(舞者等。, 2003). 胸苷激酶免疫组织学数据显示，转基因在肿瘤血管中高表达，但在正常组织中弱表达，心内膜除外。因此，注射胸腺嘧啶激酶底物更昔洛韦可以通过限制血管密度来抑制实验性肿瘤的生长。总之，这些特征证明了VE-cadherin启动子对靶向血管生成内皮的潜在效用。

鉴于使用VE-cadherin启动子靶向人类治疗基因，我们在体内外表征了人类基因的调控序列。我们的数据强调了构成性内皮基因的器官特异性调节的存在。此外，我们的结果表明了VE-cadherin基因转录控制的物种相似性和差异性，并指出了跨物种使用细胞类型特异性启动子的潜在局限性，例如在基因治疗策略中。因此，hVE-cadherin启动子可能是人类应用的更相关工具。

结果

序列分析

从人BAC-library中克隆了人VE-cadherin基因5′-区的4.8 kb Xho I片段。对完全测序片段进行的数据库搜索显示，VE-cadherin启动子序列位于第16号染色体上（DOE联合基因组研究所直接提交生产测序设施，加利福尼亚州核桃溪，注册号：AC012325.7号).

序列分析进一步揭示，与小鼠基因相比(胡贝尔等。, 1996)，人类VE-cadherin基因的5′-区被ATG密码子上游30 bp的内含子中断(图1A). 克隆片段的3′-Xho I位点位于剪接供体位点下游135 bp的第一内含子内。

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人VE-cadherin基因5′末端的物理图谱及转录起始位点的测定

（A）克隆了一个Xho I片段，包含人类VE-cadherin基因第一外显子5′-侧翼区约4.6 kb和第一内含子135 bp。Xho I限制位点由X表示。翻译起始位点位于第二外显子（ATG）内。用于转染的DNA片段的5′端位置(图2)和转基因(图5)研究表明。虚线表示与小鼠序列同源的域（900 bp）。（B）通过引物延伸确定转录起始位点。将设计在外显子1非编码链中的放射性标记寡核苷酸退火为人类胎盘RNA或酵母tRNA，并用逆转录酶延伸。结果产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。放射自显影术显示一个特征性的阶梯，主带（箭头）长57个碱基，对应于第一个ATG密码子上游的位置-93。

通过引物延伸定位转录起始位点。与cDNA序列的非编码链（起始密码子的37/-68位）同源的寡核苷酸被末端标记，退火为人类胎盘总RNA，并用逆转录酶孵育。在变性6%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分析延伸产物(图1B). 主带长57个核苷酸。该大小与cDNA序列中位于ATG上游93位的C处的转录起始位点一致。由于转录优先起始于a，因此位置-94的a很可能是真正的转录起始位点。该位点在启动子序列中被指定为+1。

VE-cadherin启动子的体外分析

为了鉴定与内皮特异性报告基因表达相关的启动子序列，将hVE-cadherin启动子片段从5′端-3499--166位克隆到荧光素酶报告基因质粒中。

通过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）和非内皮细胞（HeLa，HEK-293）的瞬时转染实验，分析这些启动子片段赋予的报告基因表达。编码荧光素酶的表达质粒动物海肾在每个实验中均纳入以使转染效率正常化。与无启动子pGL3碱性载体相比，hVE-cadherin构建物在内皮细胞中的荧光素酶活性分别是33-100（HUVEC）和60-120（BAEC）倍(图2). 相反，在HeLa和HEK-293细胞中，hVE-cadherin启动子的活性是背景的2倍(图2). 在HUVEC和BAEC中，当删除–1135/-744片段时，观察到报告活性降低，这表明该区域存在增强子元素。最短的启动子片段-166/-5保留了内皮细胞的特异性。有趣的是，小鼠和人类VE-cadherin启动子在BAEC和HUVEC中产生了可比较的报告活性(图2).

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瞬时转染法体外分析人VE-cadherin启动子

启动子的5′-缺失片段（来自指示的位置图1核苷酸-1），与荧光素酶基因连接萤火虫转染内皮细胞（HUVEC和BAEC）和非内皮细胞（HeLa，HEK-293）。在每次分析中动物海肾荧光素酶表达质粒被共转染，荧光素素酶报告值与控制荧光素酶活性正常化。“0”表示无启动子报告载体。hVE-cadherin启动子仅在内皮细胞中显示转录活性。赋予细胞类型特异性的活性位于HUVEC和BAEC的–166/-5区域，以及HUVEC的–1135/-744区域。用小鼠启动子（mVE-2248）转染可以比较人类和小鼠启动子转录活性。条形图表示至少2个（非内皮细胞）和4个（内皮细胞）独立实验的平均+/-扫描电镜（SEM），实验分为三次进行*第页< 0.05, **第页<0.001，根据学生t检验。

总之，这些数据表明，分离的hVE-cadherin序列具有内皮细胞特有的启动子活性。这种活性集中在两个区域，即近端166bp和–1135/-744结构域。

功能域中潜在转录因子结合位点的搜索

人类和小鼠VE-cadherin启动子在近端启动子区域具有高度同源性，在转录起始点上游高达900 bp。转染实验鉴定的两个功能域的序列同源性(图2)可能代表转录因子的保守结合位点。在–1135/-744区域中，同源结构域位于–929和–741位置之间(图3A). 为了确定潜在的转录因子结合位点，使用MatInspector软件对转录因子识别序列数据库（Transfac）进行同源性搜索(Quandt公司等。, 1995). 数据库搜索显示序列-908/-894（在图3A)代表几个锌指转录因子的假定结合位点。在近端区域，存在四个一致的Ets结合位点（注意EBS1-4）和一个推测的Sp1位点(图3B). 在小鼠序列中，两个Ets结合位点（粗体）和Sp1位点对转录活性至关重要(戈尔等。, 1998). 使用人类序列中的相应位点进行的电泳迁移率变化分析表明，与HUVEC核因子的结合能力相似（参见补充数据). 这些数据表明，Sp1位点以及EBS 2和3与人类内皮细胞中的特定转录因子相互作用，从而参与VE-cadherin基因转录。数据库搜索显示锌指转录因子的一致结合位点（在图3B). 这些CT盒可能代表内皮锌指蛋白-2（EZF-2）结合位点(Adachi&Tsujimoto，2002年). 事实上，这些元素位于Sp1位点附近，正如之前描述的“内皮细胞表达的清道夫受体”（SREC）启动子(Adachi&Tsujimoto，2002年).

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人和鼠VE-cadherin基因近端5′-区的比对

显示的核苷酸序列来自小鼠（附件：10887日元/MMCDH5E1）和人类VE-cadherin基因的5′-区。序列比对由Smith和Waterman算法执行(Smith&Waterman，1981年). 图中显示了显示转录活性的两个区域（-1135/-744和-166/-5）的同源域。间隙用连字符表示。转录起始位点被指定为+1。第一外显子核苷酸为粗体。强调了锌指转录因子（ZF）、Ets家族成员（EBS）和Sp1因子的假定识别位点。小鼠序列中的功能性Ets和Sp1位点在人类序列中保守，用粗体表示。

有趣的是，3.5 kb hVE-cadherin启动子既不包含Alu序列，也不包含CpG岛，而这两个序列都位于小鼠启动子内（分别位于–1012/-811和-1590/-1535位置）。已知这些类型的元素会干扰基因表达(Batzer&Deininger，2002年;休伊特等。, 1995;白石等。, 2002;Turker，2002年). 虽然这些元素的活性尚未在小鼠VE-cadherin启动子的背景下进行检测，但它们在人类启动子中的缺失可能具有功能意义。

VEcad-LacZ转基因小鼠的制备

用3.5kb hVE-cadherin启动子片段进行体内研究。将VEcad-LacZ表达构建物注入受精小鼠卵母细胞（CD1株）。使用LacZ探针通过Southern blot对新生儿进行基因分型，从而确定了6名转基因创始人。Southern blot分析表明，六个转基因株系至少代表五个独立的插入位点（未显示）。副本编号(表1)通过使用不同的Southern印迹比较连接带（视为一个拷贝）和其他带的强度来估计。

表1

VE-cadherin-LacZ转基因中LacZ的内皮特异性表达和转基因拷贝数

线路三1331515566
内皮表达一+−+++−
估计拷贝数b条226三>101
一通过E12.5胚胎的整体X-gal染色评估其表达。
b条通过比较Southern杂交中连接带和重复带的强度来评估拷贝数。

胚胎发育过程中LacZ的表达

LacZ的表达首先通过E12.5胚胎的X-半乳糖染色进行筛选。在六个转基因系中，四个系的脉管系统呈蓝色，如图4A二是非血管性表达（未显示）。数据汇总于表1通过对副矢状E12.5胚胎切片进行免疫荧光标记，进一步检测显示血管特异性X-gal染色的四个品系的β-半乳糖苷酶表达。β-半乳糖苷酶存在于整个血管系统，与内皮标记物CD31联合标记证明了这一点（参见补充数据). 高倍镜下，可以在所有器官的血管系统中发现β-半乳糖苷酶和CD31的共同分布（未显示）。在此阶段，在脑实质的某些区域也检测到微弱的β-半乳糖苷酶信号，表明LacZ的表达可能并不完全局限于血管系统（未显示）。

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LacZ在胚胎发育和成人器官血管系统中的表达

E12.5胚胎的全贴装X-gal染色（A）和E7.5（B）显示LacZ在胚胎的整个血管系统中表达。在成人中，X-半乳糖染色见于肺泡，但不见于支气管（C）在脾脏的整个血管系统中（D）和卵巢（E），在肾小球内皮细胞中（箭头位于（F、G）)，在一些肾小球外血管中（箭头（F）)在心内膜细胞（箭头）和一些心肌血管（箭头）中（H）.在肝窦内观察到微弱标记（箭头位于（一）). Lewis肺癌皮下移植（J）藏匿着大量X-gal阳性血管（箭头所示）。抗β-半乳糖苷酶免疫荧光共标记肿瘤切片（K）和抗CD31（左）抗体显示存在β-半乳糖苷酶阳性（箭头）和阴性（箭头）血管。（百万）植入后第3天（如箭头所示），血管侵入前，Matrigel塞边缘的血管（含VEGF和bFGF）出现强烈的X-gal染色（Matrigel内的小梁不是由内皮细胞形成的）。植入后第21天（N）在VEGF和含bFGF的Matrigel的新生血管中观察到X-gal染色（箭头所示）。含bFGF-基质与X-gal的共标记（O）和抗CD31（P）β-半乳糖苷酶阳性（箭头）和阴性（箭头）血管。含VEGF基质与X-gal的共标记（问）和抗CD31（右）显示所有血管均为β-半乳糖苷酶阴性。切片用曙红复染（C–J、M、N）和苏木精（J、M、N）b，细支气管；g、 肾小球；m、 Matrigel；是的，卵黄囊。棒材：1mm英寸（A）; 150μm英寸（B）; 50μm英寸（C，G–I，K，L，O–R），100μm英寸。

早些时候，在E7.5胚胎的卵黄囊中检测到LacZ染色(图4B)表明hVE-cadherin启动子从血管发育开始就处于激活状态，随后在整个发育中的血管系统中也处于激活状态。

成年转基因小鼠LacZ表达的血管和非血管部位

通过对三个转基因系（3、31和55）的组织进行X-gal染色，对成年小鼠的LacZ表达进行表征。三个小鼠品系的总体表达模式相似，但表达水平不同，其中31号品系具有最强的染色。野生型控件未显示任何标签（未显示）。在肺泡中观察到强烈表达，但在支气管中没有(图4C). 脾脏的血管系统中也有强烈的染色(图4D)，卵巢(图4E)、输卵管（未显示）和肾小球(图4F、G); 相反，肾小球外血管很少染色(图4F). 在心脏中，心内膜和一些心肌血管被标记(图4H). X-gal标记在肝窦中较弱，在其他肝血管中缺失(图4I). 肾上腺和皮肤中的一些内皮细胞被染色（未显示）。胸腺、骨骼肌和脑血管中缺乏LacZ表达（未显示）。

为了检测肿瘤血管生成中的启动子活性，对皮下植入Lewis肺癌的新生血管组织中转基因表达进行了评估。在所有检查过的肿瘤中，我们都能发现X染色的血管(图4J)肿瘤周边密度较高。这一发现表明VE-cadherin启动子可能被肿瘤细胞产生的血管生成刺激物重新激活。肿瘤切片用抗β-半乳糖苷酶联合免疫标记(图4K)和抗CD31(图4L)抗体。大量CD31阳性血管显示显著的β-半乳糖苷酶标记（箭头）；然而，其他一些则没有染色（箭头所示），表明转基因在肿瘤血管中的表达并不完整。为了确定哪种因子可以触发转基因表达，我们进行了非肿瘤血管生成试验。同样，分别在血管长入之前和之后的第3天和第21天建立并收获补充有bFGF和VEGF的Matrigel塞。第3天，在靠近塞子的肌肉血管中观察到强烈的X-gal染色(图4M). 第21天，在栓塞血管中发现LacZ表达(图4N). 这一特征表明，启动子上调不是由于缺氧，而是由于VEGF或bFGF从塞子扩散。为了区分这两种细胞因子，分别使用VEGF或bFGF或无VEGF（每种情况下n=6）进行塞入试验。在第6天收获塞子，以便在没有bFGF的情况下嵌入结缔组织。只有在Matrigel中添加bFGF时，才能发现X-gal阳性栓塞。含有bFGF的栓塞切片与X-gal的联合标记(图4O)和抗CD31(图4P)表明β-半乳糖苷酶在栓塞血管中部分表达。在含有VEGF的栓塞中，没有X-gal染色(图4Q)不能归因于缺乏血管向内生长，因为存在CD31阳性血管(图4R). 有趣的是，含有VEGF的栓塞周围的肌肉毛细血管也未被X-gal染色（未显示）。总之，这些数据表明，在这种血管生成模型中，需要bFGF来激活VE-cadherin启动子。

成人血管系统中LacZ的表达数据总结于表2这些数据表明，人类VE-cadherin启动子有能力在许多成人器官的血管系统中驱动报告基因表达。然而，转基因表达并没有延伸到所有血管，这与VE-cadherin的表达形成对比（参见补充数据). 在几个静止的（肺、肾、心脏、肾上腺和皮肤）以及血管生成的（卵巢、输卵管、肿瘤和Matrigel塞）血管中观察到染色。这些数据支持VE-cadherin启动子的器官特异性调节假说。此外，值得注意的是，启动子再激活发生在简单的血管生成模型中，如Matrigel塞试验，以bFGF依赖的方式。

表2

血管LacZ在转基因小鼠成体组织中的表达

表达式级别一
组织第3行第31行第55行
肺++++++++
脾脏++++++
卵巢+++++++++
输卵管+++++++++
肾：
 格洛默鲁利+++++++
 肾小球外血管−+−
心脏
 心内膜++++
 心肌血管−++
肝脏b条++−
肾上腺−+−
皮肤++−
胸腺−−−
大脑−−−
一在X-gal染色后的切片上估计水平，并将其分为高（++）、中（++）或低（+）表达水平。基本缺失信号表示为（−）。
b条正弦。

为了在体外检测bFGF对人VE-cadherin启动子的可能调节，在bFGF浓度增加的情况下，用–3499/-5启动子/荧光素酶构建物转染HUVEC。如图所示图5在0到10 ng/ml之间观察到启动子活性的剂量依赖性诱导。10 ng/ml bFGF的刺激是2.2倍。因此，这些结果证实了人VE-cadherin启动子对bFGF敏感。

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bFGF激活人VE-cadherin启动子

HUVEC由hVE-cadherin启动子（-3499/-5）/荧光素酶构建物在不同浓度的bFGF存在下转染，如下图所示。条形图表示两个独立实验的平均+/−SEM（一式三份）。数据显示bFGF对荧光素酶活性的诱导具有剂量依赖性*第页< 0.001.

尽管hVE-cadherin启动子在胚胎发育期间以及成年动物的大多数器官中表现出内皮特异性和正确的时间和空间表达模式，但在大脑中，即内侧缰核和小脑中，发现了一些血管外表达（未显示）。使用抗VE-cadherin抗体对小鼠大脑进行的免疫组织学分析证实，这些区域都没有血管外VE-cadherin定位（未显示）。因此，后面的数据表明转基因的异位表达与其基因组插入位点无关。

讨论

内皮细胞在许多生理过程中起着关键作用，也与多种疾病有关，包括肿瘤生长和转移(Carmeliet&Jain，2000年). 内皮细胞表现出形态异质性的事实多年来就已为人所知，但内皮分子多样性的程度只是最近才确定的(Cleaver&Melton，2003年;帕斯夸利尼等。, 2002;拉乔特等。, 1998). 同样，也可以定义血管、器官和疾病特异性标记物。然而，这种多样性起源的转录途径尚不清楚。在这项研究中，我们表明VE-cadherin的转录，一种被认为是所有类型内皮细胞的统一标记的蛋白质，实际上是沿着血管树进行差异调节的，并且在肿瘤诱导的血管生成中被激活。因此，可以想象，对该启动子的功能性分离可以鉴定特异性靶向肿瘤或单个器官的脉管系统的顺式活性元件。

转基因胚胎的LacZ表达模式与VE-cadherin mRNA的原位杂交数据一致(布赖尔等。, 1996). β-半乳糖苷酶活性在E7.5胚胎卵黄囊中VE-cadherin表达开始时显著存在，从而证明了启动子的时间调控。在六个含有VE-cadherin-LacZ构建物的转基因株系中，有四个以类似的表达模式表达转基因。这表明转基因表达的组织特异性是hVE钙粘蛋白启动子固有的，并且相对独立于转基因整合位点。

组织学数据显示，LacZ在成年小鼠不同器官中的表达存在差异。β-半乳糖苷酶活性在胸腺、骨骼肌和脑血管等组织中检测不到，即使经过长时间的孵育。此外，hVE钙粘蛋白启动子靶向器官的特定区域。例如，肾小球被强烈染色，而在肾小球外血管中几乎检测不到β-半乳糖苷酶活性。因此，我们的数据与内皮细胞受不同表型和遗传程序调节的概念一致。在Northern blot实验中，小鼠器官中VE-cadherin mRNA的水平高度可变(布赖尔等。, 1996). 然而，这些类型的研究不允许区分差异mRNA水平是由于血管化程度的变化还是内皮异质性。在小鼠组织中准确量化每个内皮细胞的内源性VE-cadherin（mRNA和蛋白质），可能会进一步了解VE-cadherin调节的这一方面。然而，转基因中可能缺少阻止转录灭绝的元素。例如，这些额外的调控序列可能位于上游或基因内区域。小鼠转录因子和人类顺式作用元件之间的错误相互作用不太可能是导致转基因淬灭的原因，因为这在所有内皮细胞类型中都是相似的。虽然血管树上的内皮异质性已有很好的记录，但对控制这种多样性的转录因子知之甚少。Aird等人(艾尔德等。, 1997)之前的报道称，von Willebrand因子受组织特异性顺式活性元件调节。有趣的是，其表达的血管图与本文报道的不同，这表明这两个基因在转录调控方面不同。

在胚胎血管生成过程中，VE-cadherin对原始血管系统的延伸是必需的(戈尔·福雷等。, 1999)这与它在膜突起激活中的作用一致(库克利斯等。, 2003). 因此，可能需要突然表达VE-cadherin来促进和维持血管外生长。有趣的是，β-半乳糖苷酶活性在血管生成情况下尤其高，即在卵巢、充满bFGF的Matrigel塞子、肿瘤和发育过程中。同样，小鼠启动子在肿瘤内皮细胞中表现出较强的活性(舞者等。, 2003). 我们在体内观察到hVE-cadherin启动子片段的血管生成反应性，这显然具有相当大的治疗价值。Matrigel分析和HUVEC转染数据表明，这些实验中使用的启动子片段对bFGF有反应。这种细胞因子可以诱导内皮细胞中几种转录因子的表达，如EGR1、Sp1和HoxD3(布德劳等。, 1997;哈奇吉安·柯林斯出版社，1997年;库尔茨等。, 2003). 此外，最近发现Ets转录因子参与bFGF诱导的血管生成(Pourtier-Manzanedo公司等。, 2003). 需要进一步的工作来确定在bFGF依赖性VE钙粘蛋白诱导中哪个途径被激活。然而，有理由推测VE-cadherin启动子的肿瘤激活也可能使用bFGF作为介质。

本研究中使用的启动子片段未能限制转基因在血管系统中的表达。事实上，中枢神经系统的某些区域被X-gal染色，而非转基因大脑没有，这表明这不是由于非特异性染色。这代表异位表达，因为VE-cadherin仅位于内皮细胞，没有证据表明神经细胞在前体阶段表达VE-cadherin。这一特征的一个可能解释是，3.5kb启动子序列缺乏控制总转录特异性的沉默元件，即使在人类环境中也是如此。如前所述，与小鼠基因相反，hVE-cadherin基因近端区域既没有Alu序列也没有CpG岛，这两种元素已知会减弱基因表达(Batzer&Deininger，2002年;休伊特等。, 1995;白石等。, 2002;Turker，2002年). 类似的调控元件或其他类型的沉默剂可能位于人类基因的其他地方。另一种可能的解释是，人和老鼠的神经细胞转录控制不同。例如，物种间转录控制的差异可能是由转录因子与Sp1位点的差异结合引起的(Call&Wolfe，2002年;帕尔默等。, 2001;赵等。, 2000). 物种特异性转录调控的例子有很多(阿波斯特等。, 2002;布朗纳等。, 2002;陈等。, 2002;彼得科夫斯基等。, 1999;Rehli，2002年;施等。, 1999)并主张在同源系统中使用启动子。这对于VE-cadherin启动子和小鼠来说尤其明显(戈尔等。, 1999)在转基因小鼠系统中分析了人类启动子（本研究）。基因治疗干预的固有挑战之一是将外源基因的表达引导并限制在疾病部位。实现这一点的一种方法是使用组织或细胞类型特异性启动子，例如使用内皮特异性启动物，这在希望支持或抑制血管生成的情况下可能有用。本文的结果支持hVE-cadherin启动子在基因治疗措施中的潜在用途，并强调了跨物种使用外源性启动子的局限性。本文中描述的hVE钙粘蛋白-LacZ小鼠也可能被证明有助于使用荧光分选技术分离表达β-半乳糖苷酶的血管或非血管群体(愤怒等。, 1991;诺兰等。, 1988). 由于脑血管系统中没有LacZ表达，因此也可以在出生后阶段对中枢神经系统异位部位的细胞进行分离，例如缰核。此外，hVE-cadherin启动子可能与人类在抗肿瘤治疗中的应用有关。

材料和方法

人VE-cadherin启动子的克隆与分析及质粒构建

用小鼠VE-cadherin启动子的2.5 kb片段筛选人类BAC-白细胞（Genbank登录Y 10887(戈尔等。, 1999)). 该筛查由Genome Systems Inc（密苏里州圣路易斯）进行。将阳性BAC克隆的4.8 kb Xho I片段亚克隆到pBluescript KSII（Stratagene）的XhoⅠ位点，并对两条链进行测序（MWG-Biotech，Ebersberg）。使用Smith和Waterman开发的软件对人和老鼠序列进行校准(Smith&Waterman，1981年). 为了确定假定的转录因子结合位点，使用MatInspector软件筛选Transfac数据库(Quandt公司等。, 1995)在现场http://www.genomix.de网站为了进行启动子分析，将一个3.5 kb的Sac I片段克隆到含有荧光素酶基因作为报告基因的pGL3basic（Promega）的SacⅠ位点。通过用Bam HI、Apa I、Msc I、Sma I和Pst I对质粒进行消化，并对载体进行重新分类，以分别获得构建物-1409、-1135、-744、-405和-166，从而对原始3.5 kb启动子片段进行多次缺失。

底漆延长件

用Trizol试剂从人足月胎盘中提取总RNA。30μg胎盘RNA或酵母tRNA在42°C下孵育16小时，其中0.02摩尔32来自第一外显子非编码链的P末端标记寡核苷酸：在65%甲酰胺、0.56 M NaCl和10 mM Tris pH 7中的5′-TGTGGCTGGAGGTTTCTTCCGTTGG-3′。然后，用上标逆转录酶进行逆转录。产品在含有8 M尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，以及由用Hae III消化的PBR322 DNA组成的放射性标记物。

细胞培养

BAEC的制备如前所述(戈尔等。, 1999). HEK-293和HeLa细胞是从美国型培养物收集中心获得的，H5V细胞是Vecchi博士慷慨赠送的礼物(加兰达等。, 1994). 如前所述，使用IA型胶原酶从新鲜脐带中分离出HUVEC(吉姆布罗内等。, 1978). 如前所述培养细胞。

瞬时转染和荧光素酶测量

瞬时转染分三次进行。至少对非内皮细胞进行了两项独立实验，对HUVEC和BAEC进行了至少四项实验。无启动子的pGL3基本载体用作模拟对照。根据制造商的方案，用ExGen 500（Euromedex）转染内皮细胞。为了激活bFGF，在收获前24小时将细胞因子加入培养基中。用脂质体转染非内皮细胞。转染后48小时收集细胞，使用Promega的双荧光素酶测定系统在光度计（Lumat LB 9507，EG&G）中测量荧光素素酶活性。报告者的荧光素酶值被归一化为内部控制的荧光素酶活性。

VEcad-LacZ转基因小鼠的制备及Southern blot分析

为了在VE-cadherin启动子的控制下产生表达LacZ基因的转基因小鼠，我们创建了一个包含3.5 kb VE-cadherin启动子片段、来自质粒CMVβ（Clontech）和LacZ的SV40剪接供体和受体序列的质粒。简单地说，将3.5 kb的VE-cadherin启动子片段作为FspI/XhoI片段克隆到质粒ΔE1B（Microbix，Toronto，Canada）的EcoRV/XhoI位点。随后，将CMVβ的SV40剪接供体/受体和LacZ盒作为Xho I/Sal I片段插入。从质粒序列中分离出来的转基因用于具有CD1遗传背景的小鼠的转基因（德国科隆Memorec）。用LacZ探针进行Southern blot基因分型。转基因系通过与野生型CD1回交保持杂合。

胚胎和组织的β-半乳糖苷酶染色

采集胚胎或成人器官，并使用既定程序用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）染色。如图所示，成人组织用石蜡包埋，5μm切片，并用曙红或核固红（均来自Sigma）进行复染。

Matrigel塞植入术

Matrigel塞试验基本上按照所述进行(帕萨尼蒂等。, 1992)，进行了一些修改。给麻醉小鼠皮下注射0.25 ml Matrigel（Becton Dickinson），补充125 ng bFGF或12.5 ng VEGF或两者（均来自Pepro Tech Inc.）。如图所示，在植入后第3天、第6天或第21天处死小鼠，并按照成人组织X-半乳糖染色所述采集和处理塞子。

肿瘤模型

Lewis肺癌细胞是从C57Bl6背景中建立的，因此使用转基因CD1/C57Bl 6 F1杂交小鼠来防止肿瘤排斥。Lewis肺癌细胞按说明植入(舞者等。, 2003). 当肿瘤体积达到500mm时处死小鼠三对切除的肿瘤进行石蜡或组织包埋。

免疫标记

用兔抗β-半乳糖苷酶（Rockland）和大鼠抗CD31在冷冻切片上进行肿瘤免疫标记(维奇等。, 1994)抗体，然后是花青3-缀合的抗兔IgG（Jackson Laboratories）和alexa 488缀合的抗大鼠IgG（Molecular Probes）抗体。如前所述，用胰蛋白酶处理后，用上述抗CD31抗体对X-gal处理过的Matrigel塞子石蜡切片进行染色，以揭开抗原的遮蔽(戈尔·福雷等。, 1999).

补充材料

1

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2

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三

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致谢

这项工作得到了能源原子委员会和国家研究所的资助。补充信息可在Oncogene的网站上找到。

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