PDGF-A与纤维连接蛋白的相互作用揭示了硫酸乙酰肝素在细胞定向迁移中的关键作用爪蟾原肠形成

摘要

胚胎发育需要一系列广泛的协调细胞运动，这些运动是在适当的时间将细胞带到正确的位置以构建生物体所必需的。要以定向方式移动，细胞必须能够检测并响应细胞外信号移动，延伸前缘突起，如跛足，产生牵引力和力量，并平衡与相邻细胞和细胞外基质（ECM）的附着和分离。纤维粘连蛋白是两个独立参与这些过程的因素(1)和血小板衍生生长因子（PDGF）(2).

纤维连接蛋白是脊椎动物细胞外基质的主要成分，对各种发育中胚胎的细胞迁移至关重要。例如，纤维连接蛋白缺失小鼠胚胎在妊娠早期死亡，发育缺陷表明中胚层迁移和粘附失败(三). 纤维连接蛋白对早期两栖类胚胎的肠系膜细胞迁移也至关重要。所有胚胎细胞运动的第一个阶段称为原肠胚形成，它通过一系列高度编排的细胞重组来组织基本的身体计划。在爪蟾，原肠胚形成前出现纤维连接蛋白原纤维网(4–6)并为前肠系膜细胞的迁移提供基质，而后这些细胞有助于面部和头部的肌肉组织，是原肠胚形成期间最先移动的细胞之一。在一些两栖动物中，注射纤维连接蛋白或αvβ1整合素抗体（作为纤维连连接蛋白受体）或合成肽（包括与纤维连蛋白（Arg-Gly-Asp）的细胞结合域相对应的氨基酸序列），在原肠胚形成开始之前进入囊胚腔会抑制这种细胞迁移，在某些情况下会完全阻断原肠胚的形成(4,7,8).

PDGF信号提供的引导线索引导肠系膜前移行(9). PDGF受体-α（PDGFR-α）由迁移的中胚层细胞表达，而配体PDGF-A由为这种迁移提供表面和ECM的外胚层细胞表达(10). 通过破坏受体或配体阻断PDGF信号传导，导致这些细胞的迁移方向随机化，尽管细胞仍然能够移动(9).

PDGF-A有两种形式，一种长形式包括带正电荷的羧基末端保留基序，另一种短形式则没有(9,11). 该基序使PDGF-A与ECM结合，如果没有ECM，PDGF-A-就会从分泌部位扩散(9,11). 该基序进一步被证明与硫酸乙酰肝素蛋白多糖相互作用(11–13)但其与纤维连接蛋白的关系尚不清楚。

最近研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）是生长因子PDGF/VEGF家族的一员，直接与纤维连接蛋白结合(14–17). 肝素显著增强了这种结合(14,15,18)，其作用是修改纤维连接蛋白的结构，潜在地揭示了以前掩盖的VEGF结合位点，即使在去除肝素后，这些位点仍然可以结合VEGF(14). 我们证明PDGF也直接与纤维连接蛋白结合，并且这种相互作用取决于用肝素对纤维连接蛋白进行预处理。使用已建立的胚胎分析，我们表明，肠系膜前细胞的定向迁移需要硫酸乙酰肝素，并且在ECM沉积期间它是特别必要的。这些数据表明，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在原肠胚形成期间PDGF-AA-纤维连接蛋白相互作用的协调中发挥作用。

结果

肝素增强PDGF-AA-纤维连接蛋白结合。

为了检测PDGF-AA和纤维连接蛋白之间的相互作用，¹²⁵进行I-PDGF-AA结合测定。简言之，纤维连接蛋白以足以形成单层的浓度吸附在多聚树表面上，用肝素处理或不使用肝素处理，然后用¹²⁵I-PDGF-AA.绑定¹²⁵提取并定量I-PDGF-AA。在没有肝素治疗的情况下，PDGF-AA与纤维连接蛋白的特异性结合最小(图1一个)，测定水平与缺乏纤维连接蛋白的微孔相似(图1C类). 然而，用肝素预处理纤维连接蛋白显著增加PDGF-AA-纤维连接到蛋白结合(图1一个，1μg/mL肝素和图1C类，100μg/mL肝素）。的绑定¹²⁵I-PDGF-AA与肝素处理的纤维连接蛋白有效地被过量的未标记PDGF竞争，表明这种相互作用的特殊性质(图1一个).

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图1。

用肝素预处理纤维连接蛋白可增加PDGF-AA与纤维连连接蛋白的结合(一个)的绑定¹²⁵I-PDGF-AA在存在或不存在过量（1μg/mL）PDGF-AA-40 nM纤维连接蛋白的情况下，在pH 7.5下进行测试，不使用（FN）或使用（FN/Hep）用1μg/mL肝素预处理纤维连接蛋白。对照（Con）孔包括¹²⁵在不存在过量生长因子的情况下的I-PDGF-AA。(B类)未经（实线）或经1μg/mL肝素预处理（虚线）的吸附的纤维连接蛋白（40 nM）与0.35 nM至34.5 nM孵育¹²⁵I-PDGF-AA和确定的数量界限(年轴）。注意PDGF-AA有效地自我竞争，其与纤维连接蛋白的结合最大可达0.42 nM，但肝素预处理将其增加至1.07 nM。(C类)在不使用或使用100μg/mL肝素预处理纤维连接蛋白的情况下，检查PDGF-AA在pH 5.5–7.5的条件下与纤维连连接蛋白结合。微孔中不含纤维连接到蛋白（-FN；白色条）、纤维连接蛋白（FN；灰色条）或预处理纤维连接蛋白（FN/Hep；黑色条）。(D类)的绑定¹²⁵在pH值为7（白色条）、8（灰色条）或9（黑色条）的条件下，在0.1–100μg/mL的肝素浓度范围内检测I-PDGF-AA对纤维连接蛋白的作用。(E类)在不进行（−）或（+）1μg/mL肝素预处理的情况下，检测PDGF-AA与三个纤维连接蛋白片段（40 kDa、70 kDa和120 kDa）的结合。在等摩尔浓度（40 nM）下使用全长纤维结合蛋白（FN-FL）和所有纤维结合蛋白片段。无纤维连接蛋白（−FN）。数据代表了至少两个独立的实验。

对PDGF-AA与纤维连接蛋白在一定浓度范围内结合的分析（在有或无肝素预处理的情况下）显示出经典的饱和动力学，肝素预治疗后最大结合增加(图1B类). 这个K_d日PDGF-AA与纤维连接蛋白结合的数值分别为1.51±0.36 nm和1.35±0.14 nm。这些数据表明，肝素预处理导致纤维结合蛋白上新生PDGF结合位点的暴露或产生。这与之前观察到的VEGF-A与纤维连接蛋白结合的情况类似(14,18). PDGF和VEGF是同一蛋白质结构家族的成员，以前的研究表明，VEGF-A与纤维连接蛋白的结合在酸性pH下增强。VEGF-fibronectin相互作用的pH控制可能反映了重要的细胞外调节机制，因为已知pH变化与组织损伤有关，疾病状态和发展(19,20). 因此，我们研究了PDGF-AA与纤维连接蛋白的结合是否受到pH值的调节。在5.5到9的pH值范围内，PDGF-AA与纤维连蛋白的结合分析显示没有显著变化(图1 C类和D类). 重要的是，在碱性pH条件下，PDGF-AA结合电位没有降低。这一点很重要，因为PDGF引导的肠系膜细胞在富含纤维连接蛋白的ECM上的迁移发生在原肠胚形成期间的基本细胞外条件（pH 8.4）下爪蟾莱维斯(21–23). 因此，PDGF-AA与纤维连接蛋白的相互作用可能发生在发育过程中爪蟾胚胎。

为了进一步评估PDGF-AA-纤维连接蛋白结合对肝素的依赖性，进行了更广泛的剂量-反应分析。增加PDGF-AA-纤维连接蛋白结合所需的最低肝素浓度为1μg/mL(图。1D类). 较低的肝素浓度不会产生可测量的效果，而较高量的肝素（10-100μg/mL）不会进一步增强结合(图1D类). 这些数据表明，PDGF-AA只有在纤维结合蛋白上的结合位点被肝素修饰后才能与纤维结合蛋白结合(14,18).

肝素酶III随机定向中胚层迁移。

接下来，我们研究了肝素介导的PDGF-AA-纤维连接蛋白相互作用是否在PDGF-AA引导细胞定向运动的成熟体内系统中发挥作用(24,25). 在早期开发期间爪蟾胚胎，即最终形成面部和头部肌肉组织的细胞（肠系膜前细胞）经历一段定向迁移期。这些细胞（中的灰色细胞图2一个)在胚孔唇（BL）进入胚胎（退化）；图2一个)然后向动物极迁移（AP；图2一个). 这种定向运动可以通过转移天然细胞迁移底物（富含纤维结合蛋白的ECM）到组织培养皿中在体外重现(图2一个)将迁移的肠系膜细胞的外植体放在胚胎中BL和AP位置中间的基质上(图2B类) (24,25). 肠系膜外植体将向其正常方向移动，即向AP的位置移动。我们以前的工作表明，PDGF信号为这种定向运动提供了指导线索，可能是由于PDGF-AA在表达PDGFR-α的肠系膜细胞迁移的基底层中的滞留(9,10).

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图2。

肝素酶III治疗扰乱胚胎肠系膜细胞的定向迁移。(一个和B类)头部肠系膜细胞定向细胞运动的体外试验。(一个)条件基质的制备。第10级的矢状剖面示意图非洲爪蟾胚胎。移除支持肠系膜细胞在体内迁移的细胞片（囊胚腔顶）（短箭头表示分离），并将基质面朝下放置在组织培养皿上。组织的位置和方向标记在盘子上。2小时后，将组织从沉积的ECM中取出。(B类)定向迁移分析。在第10.5阶段解剖前肠系膜（圆）的外植体，并将其放置在囊胚腔唇（BL）和动物极（AP）标记之间的中点ECM上。立即记录外植体位置，1小时后记录。(C类)迁移试验后，对条件底物进行纤维结合蛋白免疫细胞化学。(D类)肠系膜前外植体的RT-PCR分析。(E–G公司)绘制1小时后每个肠系膜外植体的位置，所有起始位置叠加在原点上。积极的年数值表示向动物极点移动，即正常的迁移方向。(E类)控制(F类)在整个实验中包括0.1U/mL肝素酶III。(G公司)ECM沉积后立即用0.1 U/mL肝素酶III处理45分钟。(H（H）)中的数据条形图E–G公司运动方向：动物极（黑色条）、囊胚唇（灰色条）、侧向（在年轴，但>15μmx轴线；阴影条），停止（在两个轴上移动小于15μm；白色条）。(我)微注射载体、乙酰肝素酶III或热失活乙酰肝素酶III后，囊胚腔内无凋亡细胞（黑色条）或有凋亡细胞（阴影条）的图形。死胚（白色条）。所有实验至少重复三次。[比例尺，10μm(E类; 应用于框架C–E类.)]

为了检测PDGF-AA引导的肠系膜运动是否需要内源性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），体外定向迁移试验中包括降解硫酸乙酰肝素酶链的肝素酶III。简单地说，在没有或存在0.1 U/mL肝素酶III的情况下，将用于肠系膜前迁移的天然基质转移到组织培养皿中。此外，在没有肝素酶II的情况下沉积的基质立即用0.1 U/mL肝素酶Ⅲ处理45分钟。前肠系膜外植体（环状组织图2B类)在10.5阶段（体内通常发生定向迁移的阶段）解剖并分别放置在BL和AP标记中点的基底上。立即记录每个外植体的位置，1小时后再次记录，并评估移动的方向和距离（见下文）。时间推移显微摄影也用于监测外植体。在所有ECM处理条件下，外植体在其整个圆周周围延伸细胞质突起，如跛足(图S1). 向前移动之前，外植体后缘的突起立即塌陷。在塌陷的5分钟内，细胞质突起再次延伸到外植体周围。

为了确认每种基质的正确沉积，在迁移试验后立即用纤维连接蛋白抗体进行免疫细胞化学(图2C类). 在有或无肝素酶III治疗的情况下，纤维结合蛋白原纤维的类似网络沉积(图2C类). 从缺少此网络的子数据中获得的数据被丢弃。

早先研究表明，在囊胚期向囊胚腔微量注射肝素酶III可以抑制中胚层的形成(26). 为了证实原肠胚期肝素酶III治疗没有类似的影响，对在没有或存在肝素酶Ⅲ的情况下培养的前肠系膜外植体进行RT-PCRXbrachyury公司(Xbra公司; 泛中胚层标记），腱蛋白（背中胚层标记），以及鹅科动物(全球供应链; 前中胚层标记物）在未经处理的和经肝素酶III处理的外植体中相似，表明该组织在这些条件下保持其中胚层特性(图2D类).

正如预期的那样，在定向迁移分析中，大多数对照外植体朝着正常方向移动，朝向动物极（72%）。其余的对照外植体要么向错误的方向移动，即横向移动（15%），要么远离动物极（7%），要么停滞（6%）(图2 E类和H（H）和表S1). 相反，在整个实验过程中，肝素酶III治疗随机化了外植体的移动方向(P（P）=0.004），只有44%的人向动物极点移动。在剩下的外植体中，26%移离动物极，20%横向移动，10%停滞(图2 F类和H（H）和表S1). 有趣的是，当ECM在转移到组织培养皿后用肝素酶III处理时，大多数外植体向正常的动物方向移动（60%；图2 G公司和H（H）和表S1)，在统计学上与对照外植体相似(P（P）= 0.37). 在肝素酶III存在下沉积的基质上定向肠系膜细胞迁移的随机性，而不是沉积后处理基质时，与我们的体外数据一致，表明硫酸肝素稳定地修饰纤维连接蛋白，以揭示PDGF-AA的结合位点。

为了研究硫酸乙酰肝素的缺失是否阻断PDGF信号传导，检测了肝素酶III诱导迁移的肠系膜前细胞凋亡的能力(图2我). 先前的研究表明，体内PDGF信号的抑制导致肠系膜细胞凋亡死亡(10,27). 在第6.5阶段将肝素酶III微量注射到囊胚腔中，在此阶段之前的研究中胚胎中出现了最严重的缺陷（参考文献。26和图S2），与对照组相比，没有造成死亡细胞数量的显著差异(P（P）>所有处理之间的比较为0.2）。

讨论

本文提供的数据表明，PDGF-AA可以直接与纤维连接蛋白结合。肝素显著增强了这种相互作用，表明肝素治疗后纤维结合蛋白上PDGF-AA结合位点增加。重要的是，我们在体外实验中发现，从天然ECM中去除硫酸乙酰肝素会导致肠系膜细胞迁移紊乱。然而，只有在ECM沉积期间清除硫酸乙酰肝素时，才会发生无序迁移。这些发现表明，PDGF-AA与富含纤维连接蛋白的ECM相互作用并在原肠胚形成过程中引导细胞迁移的能力可能由暴露PDGF-AA结合位点的纤维连连接蛋白中硫酸乙酰肝素介导的改变所控制。与此模型一致，体内清除硫酸乙酰肝素不会导致肠系膜细胞凋亡，这表明PDGF-AA信号没有被破坏，而是其定位被破坏。这些数据也与我们之前的研究结果一致，即长型PDGF-AA的过表达通过其羧基保留基序与ECM结合，破坏了正常的引导线索，并导致间充质细胞迁移方向的随机性，而短型PDGF-AA的过表达，从分泌物部位扩散(9).

完整早期肝素酶III治疗爪蟾胚胎通过微注射进入囊胚腔，已被证明扰乱中胚层细胞的运动，胚胎发育有原肠胚形成缺陷(26). 类似地，在肝素酶III中培养假定的背轴中胚层外植体抑制组织的会聚伸展运动(28). 然而，在这两种情况下，这些治疗也抑制了中胚层的诱导(26,28)这发生在原肠胚形成的细胞重组开始之前，因此很难区分对细胞运动的任何直接影响。据认为，这种中胚层诱导抑制是由于成纤维细胞生长因子（FGF）信号的中断(26,28)，需要HSPG(29–31). 在我们的实验中观察到的肠系膜外植体的无序迁移似乎不太可能是由于中胚层形成的中断，因为组织在原肠胚期被肝素酶III处理。FGF信号传导在这些阶段的中胚层维持中发挥作用(32)但RT-PCR分析表明，外植体保留了中胚层标记的表达(图2D类)，以及他们在ECM上迁移的能力(图2C类)原肠胚期肠系膜细胞的特征性行为(33,34).

将肝素酶III注入小鼠的囊胚腔爪蟾原肠胚形成开始的第10阶段的胚胎改变了囊胚腔顶部的纤维连接蛋白纤维(35)是通过条件培养基引导肠系膜细胞迁移所必需的(36). 此外，在缺乏硫酸乙酰肝素合成的细胞中，纤维连接蛋白纤维生成受到不利影响(37). 然而，在我们的分析中，在存在或不存在肝素酶III的情况下沉积的基质之间没有差异(图2C类). 这种明显的不一致性可能是由于注射的肝素酶的局部高浓度与溶液中发现的相比。例如，在微注射显性阴性Syndecan-1或-2 mRNA的胚胎中，也有报道称囊胚腔顶ECM存在缺口(38). 缝隙出现在mRNA浓度最高的注射部位，但没有与mRNA扩散场完全重叠（见图1D类参考文献。38).

胚泡期的FGF信号传导也被认为有助于为胚胎中迁移的间充质细胞建立指导线索(36)，在原肠胚形成开始时就已经存在(24,36). 我们的实验开始于指导线索确定后的第10+阶段(36). 此外，将天然ECM放在培养皿上后用肝素酶III处理的实验并没有破坏肠系膜细胞的定向迁移(36).

纤维结合蛋白是一种模块化蛋白质，具有高度的构象灵活性，可以在球状和更广泛的形式之间转换(39–41). 从球状到更广泛形式的转变可以通过包括肝素/硫酸乙酰肝素治疗在内的因素介导(14). 肝素/硫酸乙酰肝素处理产生的延伸构象是稳定的，不需要继续治疗来维持(14,18). 因此，在体外迁移试验中，一旦天然ECM在内源性硫酸乙酰肝素的存在下沉积到培养皿中，纤维连接蛋白就可能已经呈扩展形式，其中显示了生长因子结合位点(14). 然而，当基质沉积期间存在肝素酶III时，它会消化硫酸肝素，并可能阻止含有延伸形式纤维连接蛋白的基质的形成。基质沉积后肝素酶III治疗并没有破坏肠系膜细胞体外迁移的方向(36)，进一步表明PDGF-AA在该试验中直接与纤维结合蛋白相互作用，而不是通过HSPG，因为在这种情况下，肝素酶III会降解HSPG导致HSPs释放HS-bound PDGF-AA(43).

综上所述，这些数据支持一种模型，即原肠胚期外胚层细胞分泌的PDGF-a与胚泡顶ECM中HSPG修饰的纤维连接蛋白结合，以指导肠系膜细胞在胚胎发育过程中的定向迁移爪蟾原肠胚形成。PDGF-AA与纤维连接蛋白相互作用的动力学需要考虑，因为从基质中结合和释放的动力学可能最终负责控制细胞活化。参与这一过程的天然HSPG尚不清楚，需要进一步研究，但有几个HSPG表达于爪蟾原肠胚形成过程中组织特异性模式的胚胎，包括Syndecas-1和-2[在外胚层中表达(44)]Syndecan-4、Glypican-4和Biglycan[在外胚层和中胚层表达(44–47)]. 尽管这些热休克蛋白在肠系膜细胞迁移中的作用尚未被研究，但它们通过与ECM分子、生长因子、，细胞因子和趋化因子(38,48–51). 例如，如上所述，Syndecan-1或-2的敲除破坏了囊胚腔顶ECM并导致纤维沉积间隙(38). 此外，Syndecan-4和Glypican-4都是会聚延伸所必需的，会聚延伸是原肠胚形成期间细胞运动的另一种重要形式。Syndecan-4也在神经嵴细胞的定向迁移中起作用(45,46,52). 在这些情况下，Syndecan-4和Glypican-4通过调节平面细胞极性（PCP）途径发挥作用，该途径在会聚延伸期间参与极化基质沉积(53). 更令人信服的是，这些研究表明，当Syndecan-4或Glypican-4被敲除时，胚胎会发育成前部缺陷，这表明肠系膜细胞的迁移也可能受到影响，使其成为未来研究的潜在对象。

硫酸乙酰肝素链的特殊结构组成可能提供了额外的控制元素，正如我们之前所指出的，肝素/硫酸乙酰肝素介导的纤维连接蛋白的调节取决于多糖的长度和硫酸化模式(14). 因此，通过调节所涉及的酶阵列来局部控制硫酸乙酰肝素的生物合成可能是这一过程的关键组成部分。无论如何，本研究提供了强有力的证据，证明硫酸乙酰肝素和HSPG可能通过控制囊胚顶富含纤维连接蛋白的ECM内PDGF-AA的沉积来调节定向细胞运动。

材料和方法

补充材料

致谢。

脚注

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