浮游菌-微绒毛膜菌-Chlamydiae Superphylum的分隔细菌具有膜衣样蛋白

MC结构和膜弯曲

在为数不多的已知分隔细菌细胞中，MC-like蛋白的存在令人震惊。事实上，在细胞膜附近发现了一种这样的蛋白质，这加强了MC蛋白质结构在维持细胞分隔中的重要性，支持了原互变异构体假说，从而支持了它赖以生存的折叠分配[3],[13]引人注目的是，随着真核生物的出现，单个MC折叠，即β-螺旋桨和SPAH的数量急剧增加[25],[26]然而，严格来说，正是这种特殊顺序的结构域组合与真核生物和（如我们现在报告的）PVC内膜系统唯一相关。β螺旋桨与SPAH域的组合没有明显的特征支持这种作用。这两个重复结构域被认为对其序列的变化具有鲁棒性，允许其组成重复快速失去序列相似性，允许蛋白质在保留折叠核心的同时修改其功能[27]的确，尽管他们有共同的祖先[3],[4]我们有结构信息的两个包被囊泡MC，即网格蛋白和Sec31，在三级结构、多重聚合模式和笼状结构方面显示出巨大差异。网格蛋白和Sec31β-螺旋桨以及SPAH结构域在结构上是不同的。在网格蛋白笼中，形成笼边缘的SPAH结构域的灵活性及其相互作用的灵活性使得形成各种大小的笼[28]相反，对于COPII保持架而言，形成保持架顶点的β螺旋桨模块之间的相互作用角是导致最大尺寸变化的原因[29]这说明了两个MC系统自与最后一个真核生物共同祖先分化以来所实现的多级多样性和极端变异，同时保留了核心MC结构。

Nup还是Coatomer？

MC是真核生物中两种复合物的一部分：核孔和包被囊泡。核孔复合物桥接由一个紧密弯曲的单膜形成的双层膜，而囊泡覆盖在单膜囊泡周围。gp4978不太可能是隐叶七叶树因为它与单个膜相关(图5).

MC和分区

与大多数原核生物不同，大多数PVC成员是分隔的细胞[20]。我们在现有的两种Lentisphaera蛋白质组中的一种中检测到了MC-like蛋白质，拟南芥，其中已报告分区，但在瓦登维奇瓦利斯据我们所知，在V.蒸汽同样的观察结果也适用于Verrucomirobia，据报道，在我们检测到MC样蛋白的三个物种中存在区室化：黄色条杆菌,微小Pedosphaera parvula，以及棘状疣状瘤菌 [20]四种基因的基因组^第个疣状疣状瘤菌（Verrucomicrobium），其中有分区的报道，德容氏前列腺杆菌，不可用。我们还不知道我们所研究的疣状疣状瘤菌的分区状态分析，在该分析中我们没有检测到MC-like蛋白。在衣原体中，我们分析了三个可用的完整蛋白质组，但没有检测到任何MC样蛋白。再一次，衣原体中还没有分区的报道。唯一一个我们没有检测到MC样蛋白并且被分隔的平霉菌是anammox斯图加提恩库埃尼菌虽然MC-like蛋白的缺失可能是基因组信息不完整的结果，但anammox异常可能与该隔室的特定存储和遏制功能有关。Anamox具有区别于其他浮游菌的独特特征[22]包括存在醚键脂类。因此，除了anammox的显著例外斯图加蒂安K·MC-like蛋白的存在与细胞分裂状态之间存在相关性。这种模式表明，PVC最后一个共同祖先已经拥有MC，并且如前所述被分隔开[20]没有MC样蛋白基因的PVC蛋白质组可能代表了基因缺失的情况，就像斑尾鱼一样，斑尾鱼的专性细胞内寄生生活方式导致了大量的基因缺失[30],[31].

原共聚体假说假设，在原真核生物中进化出一种简单的含MC的涂层模块，作为弯曲膜或稳定弯曲膜的机制[3]MCs和分区之间的相关性可以解释为支持原共沸物假说，当然也可能是由于收敛进化。

收敛与发散演化

已知结构域融合/裂变通过结构域亚基的重组促成了新蛋白质的诞生[32]考虑到MC结构的简单性和大多数蛋白质组中单独发现的大量两个组成域(表S1)，真核细胞和细菌MC蛋白可能是分别出现的，即通过聚合进化。事实上，在细菌和真核MC之间没有检测到显著的序列相似性。虽然这似乎表明这两组蛋白质是不相关的，但值得注意的是，在长期进化过程中，序列相似性往往会丢失（例如，FtsZ和tubulin或MreB和actin）。事实上，尽管有共同的起源和显著的结构相似性，但真核细胞之间没有检测到序列相似性[4]因此，序列相似性的缺失对于这两组蛋白质的起源没有任何信息。相反，蛋白质结构的相似性是两组之间可能存在关系的第一个迹象，因为折叠结构的会聚是一个罕见的事件[32],[33]此外，靠近可变膜的定位相似性是支持真核生物和隐叶七叶树MC。因此，PVC MC可能与真核生物有关，可能是由于真核生物的横向基因转移事件。然而，对细菌开放阅读框的密码子用法和GC含量的分析没有发现任何证据表明最近发生了横向基因转移。

PVC中MC检测的意义

40多年前，人们提出了真核生物内膜系统的自体起源[34],[35]并得到最近证据的支持[36],[37].内膜系统的原核同源物明显缺乏[36]与线粒体和叶绿体的情况相反，它们是内共生事件的结果。以前曾报道过浮游菌和真核生物内膜系统之间的形态学相似性[19],[21]. The隐叶木霉内层包膜在拓扑结构上是与真核细胞核膜最接近的细菌类比物，因为它是一个真正折叠的单膜，是胞质内膜的内陷[38]其他人使用基于序列的搜索分析了浮游菌和真核生物之间的关系，但结果相互矛盾[39]——[43]据我们所知，这项工作代表了首次利用结构信息将PVC超类群与真核生物联系起来的分析。我们的结果提供了真核生物和细菌内膜系统之间这种中间物的分子鉴定，表明PVC细菌超类群对真核发生有显著贡献。

域检测

我们首先在所有蛋白质组中搜索包含一个或两个MC特异结构域的蛋白质。HHSearch对所有序列进行折叠预测[16]，默认参数使用2005年10月版本的SCOP70数据库，可从HHSearch网站获得。如果折叠检测e值在40多个位置上<1，我们认为蛋白质中可能存在一个结构域。手动筛选结果列表。所有原子模型都按照前面的描述进行了构建和评估[3],[13]在许多蛋白质组中观察到这两个结构域在基因库中的高浓度。然后我们搜索包含两个MC结构域的蛋白质。虽然在大多数蛋白质组中都可以找到由β-推进器和SPAH结构域组成的蛋白质，但这些蛋白质在浮游菌蛋白质组中所占比例较高。最后，我们筛选了具有MC结构的蛋白质，并要求β-螺旋桨结构域位于SPAH结构域的N末端。

论域检测的灵敏度和特异性

虽然我们的单域检测协议几乎肯定会产生大量假阴性，但我们预计，随着已知具有这种结构的大多数真核生物蛋白质得到恢复，这个比率会很低。由于我们的目标是最大限度地提高检测灵敏度，所以我们没有努力将假阳性检测率降到最低。我们预计所有物种的假阳性率都是相似或相同的，我们没有理由认为PVC蛋白的假阳性比率会高于其他生物体的蛋白。

基因组DNA的生成

隐叶七叶树在液体PYGV培养基中生长[46]OD～0.2，通过离心收集细胞。～通过添加200µl破胶缓冲液（2%Triton X-100、1%SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris-Cl pH 8.0和1 mM EDTA）、200µ1苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）（Sigma，P3803）和200µl玻璃珠来溶解100µl颗粒细胞。在添加200µl TE（10 mM Tris-Cl pH 8.0+1 mM EDTA）之前，将该溶液剧烈旋转3分钟。将该溶液以14000 rpm离心5分钟。将水层转移到新鲜试管中。添加等量的氯仿，短暂旋转，然后以14000 rpm旋转5分钟。将水层转移到新鲜试管中。向试管中添加1mL 100%乙醇，倒置混合，并在-20°C下放置30分钟。然后将样品在4°C下以14000rpm旋转15分钟以沉淀DNA。用500µl 70%乙醇清洗颗粒，并将试管再旋转5分钟。去除乙醇后，将试管留在室温下干燥。干燥后，将颗粒重新悬浮在200µl水中。

ORF的PCR扩增

放大隐叶七叶树采用ORF标准分子生物学协议。简言之，根据制造商的规范，使用AccuPrime Pfx DNA聚合酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增每个ORF。每个反应中使用100 ng基因组DNA作为模板。由Integrated DNA Technologies合成的引物设计为在每个ORF中设计5′Nde I限制和3′Eco RI限制位点，用于亚克隆目的。用于扩增gp4978基因的引物为：

5′gggattccatatgctcgctaccttctcgcatgcg和5′gtcggattctattactcttcaacggtctcaagctcgtcagg.

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上运行，从凝胶中切除预期大小的条带，凝胶纯化（MP Biomedicals，Geneclean II Kit），然后将TOPO克隆到PCR-Blunt II-TOPO载体（Invitrogen，Carlsbad，CA；K2800-20）。阳性克隆首先通过Eco RI限制性消化验证。具有预期带型的克隆使用覆盖整个ORF的内部基因特异性引物进行测序。已鉴定出一个克隆，其中未发现氨基酸改变突变。

然后使用Nde I和Eco RI限制酶将ORF亚克隆到pSKB2-His10细菌表达载体中。这引入了一个用于纯化的N-末端10-组氨酸标签。pSKB2-His10质粒的候选插入物在ORF的5′端和3′端进行测序，以确保正确插入质粒pSKB2-His10–ORF 4978。

重组表达与纯化

质粒转化为大肠杆菌BL21（RIL）细胞。培养5 ml过夜培养物，用于接种1 l LB培养基和抗生素（最终浓度为50µg/ml卡那霉素和25µg/ml氯霉素）。将这些1 l培养物在30°C下培养至外径0.6，此时添加IPTG（最终浓度为1 mM），并将温度降至25°C。诱导培养物在收获前培养4小时。

收集6 l诱导细菌，并用蛋白酶抑制剂将其重新悬浮在裂解缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl）中，然后通过微流控进行裂解。在Ti50.2转子中以20000 rpm的转速将所得裂解液旋转35分钟，以使碎片颗粒化。收集上清液，并添加咪唑至最终浓度为5 mM。将裂解液与8 ml预先清洗的TALON金属亲和树脂（Clonetech，Mountain View，CA）在4°C下培养4小时。培养后，将溶液倒在柱上收集树脂。然后用5柱体积的裂解缓冲液、20柱体积的5 mM咪唑裂解缓冲液和5柱体积20 mM咪唑啉裂解缓冲液清洗树脂。然后通过在树脂上通过2个柱体积的洗脱缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl和500 mM咪唑pH 8.0）洗脱结合蛋白。然后将洗脱液与裂解缓冲液进行广泛透析，以去除咪唑。透析后，以牛血清白蛋白（BSA）为标准，用Bradford法测定蛋白质浓度，用SDS-PAGE电泳测定纯度。

有限蛋白质水解

我们稍微修改了前面描述的协议[23]将100µg纯化的gp4978添加到900µl消化缓冲液（100 mM Tris-HCl（pH 8.5）和0.01%SDS）中。添加胰蛋白酶（11418025001；罗氏诊断，印第安纳波利斯，IN），使蛋白酶与标记蛋白质的重量比为1∶200。添加蛋白酶后，将样品置于37°C下，并在每个时间点去除100µl等分试样。通过添加12µl 100%TCA，立即对每个时间点的样品进行TCA沉淀。离心沉淀蛋白质片段后，将样品在90%丙酮中洗涤一次，然后再悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中。样品在4%–20%三甘氨酸凝胶上进行考马斯染色和Western blot分析。为了确定哪些gp4978蛋白水解酶片段具有完整的N-末端10-His标记，使用抗-His抗体（1∶3000稀释度的Sigma单克隆抗多组氨酸产品#H1029）进行了Western blot分析。

抗原注射和亲和纯化

使用上述注射方案将纯化抗原注射到兔子体内（宾夕法尼亚州丹佛市科文斯免疫服务公司）[47]每只动物对注射的抗原都表现出良好的免疫反应，在最后的终末出血之前进行了两次生产性出血。

为了进行亲和纯化，使用了一只兔子终末出血的抗血清。如前所述进行亲和纯化[47]亲和纯化后，浓缩抗体洗脱物，并用Western blot对全细胞裂解物和纯化的重组蛋白进行分析。

我们感谢A.Sali（加州大学旧金山分校）、M.P.Rout和B.T.Chait（纽约洛克菲勒大学）以及J.Fuerst（澳大利亚昆士兰大学）的支持和宝贵的讨论。