哺乳动物系统发育的非中性替代率检测

模拟研究

我们进行了两种类型的模拟实验，以评估phyloP中实现的测试的假阳性率和威力。在第一个“参数”系列实验中，我们从“中性”和“选定”的系统发育模型中生成合成比对，然后根据phyloP评分测量不同大小元素的区分程度。在这些实验中，中性位点是根据ENCODE区域36个谱线比对中的四重简并（4D）位点估计的系统发育模型生成的（方法）。通过按因子缩放所有分支，从该模型生成所选模型ρ（所有分支案例）或按因子在子树中的分支λ（子树案例），用于各种选择ρ和λ（方法）。因此，模拟方案反映了与测试本身相同的假设，预计会对绝对性能产生一些乐观的估计。然而，这对于比较不同方法在已知的、精确描述的条件下的相对性能是有用的。为了补充这些参数实验，我们还进行了一系列无模型、非参数自举实验，分别从4D和第二密码子位置（CDS2）位置绘制“中性”和“选定”对齐列。（之所以选择CDS2位点，是因为这些位置的所有核苷酸替换都是非同义的。）这些模拟对核苷酸替换过程所需的假设较少，但其有用性取决于CDS2站点在选择的更广泛的基因组位点中的代表性。此外，它们仅适用于所有分支测试，而不适用于子树测试。在所有实验中，我们计算了1000个中性和1000个选定基因组元件的phyloP得分，跟踪假阳性率（FPR）、真阳性率（TPR）、假发现率（FDR）和运行时间。我们使用这些统计数据和接收机工作特性曲线（AUC）下的面积来总结性能。

这些实验最引人注目的结果是，这四项测试在各种场景下都具有几乎相同的能力(图1;表2; 补充表S2–S13），尽管其基于的统计原则截然不同。这对于非参数和参数模拟都是如此。当信号较强时，可能会出现类似的功率水平，但在弱守恒或加速度下，也会出现高一致性。不同方法之间的唯一主要差异是针对特定于亚树的养护，对于这种养护，LRT方法的功率略高于SCORE方法，而SCORE法的功率又高于SPH方法，尤其是对于短元素（补充表S2–S4）。SPH方法还显示，在强保守性的情况下，基于减少物种集的所有分支测试的功率略有降低（补充表S9），这可能是由于SPH方法使用的测试统计数据的高度离散性（见讨论）。在所有其他情况下，这些方法基本上无法区分。

表2。

phyloP单侧全分支测试ROC曲线下的面积

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图1。

受试者操作特征（ROC）曲线显示在phyloP中实施的所有分支测试的假阳性率与真阳性率：（红色）LRT、（绿色）SCORE、（蓝色）SPH和（紫色）GERP。单个图显示了3-bp模拟数据集的结果(顶部)或1-bp(底部)从具有一系列偏差的模型生成的元素ρ从中性利率ρ=1.0（列）。

其次，这四种方法的绝对功率水平——这36种哺乳动物的系统发育——似乎相当不错。参数模拟表明，在强守恒的情况下（按因子进行全分支缩放ρ=0.1）或加速度(ρ=3.3），单个核苷酸的选择可以合理可靠地确定，例如，TPR为90%（对于ρ=0.1）或92%（对于ρ=3.3），每元素FPR为5%（AUC分别为0.97和0.99）。在更适度的保护水平（例如。，ρ=0.3，在相位cons元素中观察到的平均值）(Siepel等人，2005年)，单个核苷酸的能力较弱，但对于3-bp元件，在5%FPR下可以实现97%的TPR（AUC=0.99）。同样，在3 bp元件中以两倍于中性速度的加速度加速时，在5%FPR下可实现87%的TPR（AUC=0.97）。对于10-bp的元件（约为典型转录因子结合位点的大小），可以通过良好的能力检测到更温和的约束或加速（例如。，ρ=0.7，AUC=0.94或ρ=1.43，AUC=0.96）(表2). 在50 bp时，仅可可靠地检测到约10%的偏离中性速率（数据未显示）。检测能力随着ρ相对于中性值减少或增加ρ=1，但加速比守恒更快。这种行为似乎是由完全不变位点（无替换）的边界效应引起的，尽管这些位点具有完美的保守性，但在零模型下，这些位点通常具有不可忽略的概率，限制了测试区分极端保守性和中性的能力。对于不同的元素长度，非参数实验中的功率与在ρ= 0.5.

我们试图将这些FPR（针对每个TPR）转换为预测的FDR（预测的假阳性元素的预期分数），这在基因组学的应用中特别有意义。如果所选站点的比例为γ，然后

用于FPRα和TPR（1−β)（补充第S2.8节）。什么时候？γ很小（正如人们认为在哺乳动物基因组中一样），相对较小的FPR仍然可以为固定的TPR产生较大的FDR，这主要是因为从中提取假阳性的位点池比从中提取真阳性的位点库大得多。然而，预测FDR并不简单，因为γ是未知的，被选择的站点遵循一些未知的选择场景分布，每个场景都有自己的TPR。然而，我们能够通过两种间接方法获得作为TPR函数的FDR的粗略估计，重点是全分支轻轨的情况。首先，我们使用CDS2位点作为被选择位点的代理，估计TPR(秒)，用于分数阈值秒，作为得分≥的CDS2元素的分数秒第二，我们通过将满分分布分解为中性成分和选定成分，并计算TPR，来估计待选地点的phyloP得分分布(秒)（补充第S2.8节）。我们使用了最大似然估计γCDS2情形和混合分解情形的下限估计。这些计算表明，如果单核苷酸元素受到与CDS2位点相似的选择性影响，则半数以上的元素可以用FDR≈5%检测到(图2). 然而，如果要检测到绝大多数1-bp元素，则必须容忍更高的FDR（例如，检测到1/bp元素的三分之二时，FDR≈50%，检测到80%时，FDR≈80%）。如果考虑受较弱选择性影响的更广泛的元素类别（如混合物分解方法所推断），则功率稍弱，对于1-bp的元素，在5%FDR下的TPR为～30%，在50%FDR下为～40%。3 bp元素的功率显示出类似的总体模式，但远高于感兴趣范围内1 bp元素的功耗，约有一半（混合物）和四分之三（CDS2）的元素可在5%FDR下检测到。虽然这些估计值明显存在很大的不确定性，但它们表明，当前的比对信息充分，可以在低FDR条件下检测到大量的1到3 bp元素，但绝大多数元素并不存在。随着更多序列数据可用，功率将提高。

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图2。

全支线轻轨的预计FDR。基于1-bp和3-bp元素的两种间接方法对假发现率（FDR）与真阳性率（TPR）的估计。（CDS2）根据第二密码子位置估计平均TPR；（混合）平均TPR是通过将全基因组得分分布分解为对应于中性和选定位点的组分来估计的。详细信息见补充章节S2.8。

我们的第三个主要发现是，子树测试（仅限LRT、SCORE和SPH）的功率大大低于全分支测试，但如果考虑到足够大的子树，则对于稍长的元素确实具有合理的功率。在我们的实验中，我们考虑了三个不同的分支，它们具有不同的物种数量和分支长度：灵长类（14个物种，短分支）、格利尔类（5个物种，长分支）和月桂目（10个物种，较长分支）分支(图3). 在所有情况下，单个核苷酸的功率都很低，除了极端的键特异性加速（子树重缩放因子λ=10）（补充表S2–S4）。在3个基点时，权力会因适度到强烈偏离中立而得到改善(λ≤ 0.3,λ≥3.33），但总体上仍较差(图3). 然而，功率提高了10个基点，元素得到了适度的保护(λ=0.3）显示与3-bp元件的全分支测试相比的功率ρ=0.5（灵长类动物；AUC为0.93–0.95）或ρ=0.3（月桂酸盐；AUC为0.98–0.99）。可以预见的是，月牙形目动物的能量通常最高，灵长类动物的能量最低，而纹状体分支介于两者之间。

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图3。

子树ROC曲线。(左侧)本研究中使用的系统发生树，其分支长度与4D位点估计值成比例。突出显示了三个子树：（褐红色）灵长类、（金色）闪光类和（蓝色）月桂色。(赖特)灵长类动物在分支特异性选择下应用于3-bp和10-bp元素的LRT（红色）和SCORE（绿色）子树测试的ROC曲线(顶部)和劳拉西亚人(底部). （SPH方法表现不佳，GERP方法不支持子树测试。）以下情况显示了结果ρ=1.0和λ=0.3，意味着利益集团以大约三分之一的中性速度发展，而树的其余部分则以中性速度发展。

为了进一步检查我们的结果对建模假设的敏感性，我们将phyloP应用于另外两组合成比对，并以更真实的方式进行了模拟。首先，我们在允许站点间速率变化的模型下生成数据(杨1994)，分别使用AR和CDS2站点估计的中性和选定站点的参数（补充第S2.7.1节）。其次，我们放宽了这样的假设（由phyloP中的所有子树测试得出），即感兴趣子树中的所有分支都使用一种替代率，而所有其他分支都使用另一种，方法是在数据生成期间向分支长度缩放因子引入各种数量的“噪声”（补充部分S2.7.2）。我们将phyloP应用于这些比对，并精确地测量了其性能，如上所述（即，测试没有改变以反映新的假设）。这些实验表明，参数实验中的简化确实会在一定程度上夸大功率的绝对估计值，但总的来说，这种影响并不显著，相对性能基本上不受影响（补充部分S3.5.1和S3.5.2）。

最后，我们对性能的其他几个方面进行了比较和评估，包括运行时间、双侧与单侧测试、考虑物种子集的效果以及报告的准确性P（P）-值。LRT和GERP方法的运行时间具有可比性，而SCORE方法要快得多，而SPH方法要慢得多，在某些情况下慢了一个数量级以上。其他实验的结果与预期基本一致（补充章节S3.3–S3.7；补充表S6–S14）。

ENCODE区域分析

通过模拟数据确定phyloP在一系列实际参数设置中表现相当好，然后我们将该方法应用于实际生物数据。在这里，我们再次使用了44个ENCODE区域的对齐方式(Margulies等人，2007年)（见方法），这是目前公布的最大的哺乳动物比较基因组数据集。

首先，我们分析了各类场所的phyloP得分分布，重点介绍了LRT方法和三种测试——灵长类和格列斯分支的全分支测试和子树测试。这些分数是通过在“CONACC”模式下运行phyloP得出的，该模式对预测的保守性产生正分数，对预测的加速度产生负分数（参见方法）。在全分支情况下，我们计算了单核苷酸得分，但对于威力较小的子树测试，我们在10-bp的滑动窗口中计算得分。我们考虑了各种注释类型，包括已知的蛋白编码基因和非编码RNA（ncRNAs）、未知功能的假定转录片段（Un.TxFrags）、序列特异性调节因子结合区（RFBR-Seqsp），以及ChIP/ChIP-identified regions（TFBS）内预测的转录因子结合位点。对于蛋白编码基因，我们分别考虑了编码区（CDS；位置CDS1、CDS2和CDS3）、5′和3′非翻译区（UTR）、5’和3′侧翼区（分别位于5′UTR上游200 bp和3′UTR下游）和内含子。为了进行比较，我们还考虑了假定保守的相控子元素和假定中性祖先重复序列（AR）的得分。

各部门分数的分布按注释类别显示出明显的差异，通常以预期的方式(图4A; 补充图S6）。例如，CDS1和CDS2位点因高保守性得分而高度富集，CDS2位置比CDS1位点稍微保守，而CDS3位点和位于5′UTR、5′侧翼、3′UTR和3′侧翼的位点（按降序排列）因高得分而呈现明显但较温和的富集。非蛋白编码功能元件（ncRNAs和TFBS）显示了CDS1/CDS2位点和UTR之间的保守性中间层水平，内含子、基因间和AR位点的总体分布都非常相似。联合国。如前所述，TxFrag位点未显示出明显的限制富集(2007年ENCODE项目联盟). 有趣的是，CDS3位点是唯一一类表现出快速进化位点过多的类别，很可能是由于编码区中超变异CpG的富集所致(Eöry等人，2009年). 基本phyloP得分也可以通过相同类型元素的平均值，在功能元素的各个位置进行汇总。蛋白质编码基因和转录因子结合位点的这种“保护谱”突出了这些元素的几个已知特征(图4B; 补充图S5），进一步验证了phyloP分数在数据中捕捉到有生物学意义的信号。

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图4。

各部门得分的分布。(A类)基于LRT方法和ENCODE区域的36个物种多重比对，不同注释类别位点的phyloP评分的累积分布函数（CDFs）。正值表示守恒，负值表示加速（CONACC模式）（见方法）。曲线显示了第一、第二和第三密码子位置（CDS1、CDS2、CDS3）、5′和3′UTR、非编码RNA（ncRNAs）、预测转录因子结合位点（TFBS）、由相位子识别的保守元件、基因间位点和祖先重复序列（AR）。（其他注释类别参见补充图S6。）(B类)ENCODE区域52个预测NRSF结合位点内的平均保守性得分与基因组位置的关系。使用TRANSFAC中的基序预测ChIP/芯片峰的结合位点（FDR=20%）（补充第S2.9节）。为了进行比较，显示了图案的序列徽标表示。注意信息内容和跨主题位置的跨物种保护之间的一般相关性（参见Moses等人，2003年). (C类)每个注释类所选站点的估计分数。课程包括来自A类，加上基因的5′和3′侧翼区域、序列特异性调节结合区域（RFBR-Seqsp）、未知功能的推测转录片段（Un.TxFrags）、内含子位点和非保守非基因（NCNG）位点。这些是通过简单的混合分解方法（见方法）计算的下限估计值，应视为近似值。相对于AR分布，所有类别都显示出单侧Mann-Whitney对保守位点的高度富集U型测试(P（P）≈0）除了3′侧翼，内含子，Un。TxFrags和NCNG类别（所有P（P）≈ 1).

通过将每个注释类的分数分布分解为“中性”和“选定”组件，可以获得经历长期选择性约束的站点分数的下限估计值（方法）。通过这种方法，我们估计ENCODE地区5.3%的所有遗址显示出保护迹象，这与以前的研究结果非常一致(Chiaromonte等人，2003年;Lunter等人，2006年;2007年ENCODE项目联盟). 此外，我们估计约三分之二的CDS1和CDS2位点在限制条件下进化，约三分之一的ncRNA位点，四分之一的CDS3位点，五分之一的TFBS位点，以及12%–16%的UTR和5′侧翼区域的位点(图4C). 毫不奇怪，对于phastCons元素，受约束场地的估计比例最高（87.4%）。与之前的调查结果一致(Asthana等人，2007年)我们估计，phastCons元件或注释CDS、UTR和ncRNAs之外的碱基有不可忽略的部分（1.3%）是保守的，这表明许多未注释的功能位点可能仍然存在，即使在ENCODE区域内。总的来说，这些估计分数与最近基于完全不同的方法对人类和鼠类基因组进行的全基因组成对分析的估计值非常一致(Eöry等人，2009年).

与所有分支得分的分布不同，灵长类分支的子树得分在不同注释类型中的分布非常相似，这表明该分支和树的其余部分之间进化率相等的零假设相当成立(图5A). 然而，glires分支在子树得分分布上显示出更显著的差异(图5B)，这表明分支特异性选择有增加的趋势。特别是，CDS、相位cons、5′UTR和5′侧翼等级（按降序排列）显示出明显的向更高的glires分数转移。如果对比对应用了一系列严格的过滤器，这一趋势成立，表明这不是缺失数据或非正交比对的伪影（补充第S2.10节）。观察到的灵长类和胶质分布之间的差异似乎也不是由于这两个分支的力量差异造成的（补充部分S3.8）。功能元素中向更大的glires-subtree分数的转变似乎是由负选择的增加而不是正选择的减少所驱动的，因为在glires子树外部以中性速率或低于中性速率进化的位点，这种变化最为强烈（补充图S8）。这种转变的一个可能解释是，由于格利尔群岛的有效种群规模较大，选择的强度增加了(Keightley等人，2005年; 另请参见Kosiol等人，2008年).

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图5。

灵长类和胶质分支的子树得分分布。通过灵长类的子树测试计算出的选定注释类分数的累积分布函数（CDF）(A类)和闪光(B类)分支。如前所示，显示了通过轻轨方法计算的CONACC分数，但在这种情况下，分数是在10个基点的滑动窗口中计算的。在这两个图中，大多数分布与双侧Mann-Whitney的AR分布显著不同U型即使曲线看起来非常相似，也要进行测试，因为数据集通常很大（例外情况是A类和5′侧翼和TFBSB类).

最后，我们使用谱系特异性phyloP评分来测试ENCODE区域内保守（因此可能具有功能）元素的加速进化，再次将重点放在灵长类和glires谱系上。我们使用相位编码和严格对齐质量过滤器来识别一组16449个用于灵长类分析的保守区域和19498个用于glires分析的保守区（参见方法）。使用子树LRT对灵长类或闪光类相对于树的其余部分的谱系特异性加速度进行评分。在FDR≈5%时，我们确定了216个灵长类加速区（PAR）和3529个格列尔加速区（GAR）。这两个加速区域列表在基因组位置上大体相似，但在GENCODE基因的编码序列中，PAR的比例稍大（7.4%对4.5%）。已知和预测的RNA基因重叠9个PAR和83个GAR。补充表S15-S16和补充图S9中描述了最显著加速的PAR和GAR。有趣的是，格列雷谱系在很大的标称范围内显示出明显的加速区过剩P（P）-值阈值，再次表明在该分支中增加选择的可能性。然而，元素起始集的差异、子树测试的能力以及人参考比对中的不对称也可能促成这种观察。

路线和中性模型

使用TBA程序对44个ENCODE区域进行对齐(布兰切特等人，2004年)，如所述Margulies等人（2007年），但使用了一组扩展的序列（2008年6月冻结；33只安氏哺乳动物与之前分析的21只）。使用PHAST中的phyloFit程序，从这些定线中的4D位置估计中性模型。估计后，对模型进行了调整，以保持估计的核苷酸交换性，但确保平稳分布等于全基因组平均值（补充第S2.6节）。模拟实验和实际数据分析使用了相同的中性模型。

仿真

使用PHAST中的phyloBoot程序，参数模拟基于从系统发育模型正向采样生成的排列柱。中性比对列（用于评估假阳性率）由估计的中性模型生成，选定的比对列（用于评估真阳性率）由该模型的版本生成，其中所有分支都由参数缩放ρ，或通过参数缩放感兴趣子树中的分支λ。对于两者ρ和λ，考虑了以下一组比例因子：{q个/10, 10/q个:q个ε {1,3,5,7,9}} = {0.1,0.3,0.5,0.7,0.9,1.11,1.43,2.00,3.33,10.00}. 模拟数据不包含对齐间隙或缺失数据。在某些情况下，数据是通过站点间的速率变化生成的（补充第S2.7.1节），或通过在标度因数中添加“噪音”生成的，因此它们与子树测试的假设不完全匹配（补充第S2.7.2节）。非参数实验基于从祖先重复序列（中性）和第二密码子位置（选定）的列集合中替换（也使用phyloBoot）绘制的对齐列。

ENCODE区域的注释

蛋白质编码基因注释基于GENCODE集合中的408个非重叠基因(Harrow等人，2006年). ncRNAs由来自ENCODE区域的8个特征良好的结构和调节RNA组成(鼻涕虫70[也称为U70型],斯诺拉36A[也称为ACA36公司],斯诺拉56[也称为ACA56公司],MIR192型,密尔194-2,196B英里,MIR483型、和H19型). RFBR-Seqsp和Un。TxFrag注释来自ENCODE项目联盟（2007年）。通过我们自己的方法，使用三种可获得ChIP-ChIP数据和结合基序的转录因子（22个MYC[也称为c-MYC]、52个REST[也称为NRSF]和21个STAT1位点）预测特定的TFBS位点（补充部分S2.9）。对于AR，我们提取了RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org)与先前确认为安第斯哺乳动物祖先的重复科和类相对应的注释(2002年小鼠基因组测序协会). 在所有情况下，注释都是在人类（hg18）基因组坐标中定义的，然后映射到多重比对。

选定场址分数的估算

采用与Chiaromonte等人（2003年），但基于经验累积分布函数（CDF）而不是估计的密度函数。具体来说，每个注释类的phyloP分数分布一假设为中性成分和选定成分的混合物，F类_一(S公司) = (1 −π_一)克(秒) +π_一H（H）_一(秒)，其中F类_一是类中所有站点的CDF一（分数的函数秒),克是中立发展站点的CDF，H（H）_一是所选站点的CDF，以及π_一(0 ≤π_一≤1）是类别中站点的分数一正在选择中。由于非负性H（H）_一,F类_一(秒) ≥ (1 −π_一)克(秒)对所有人来说秒，所以的下限π_一由提供

这个下限是通过将AR和每个注释类的所有站点替换为经验CDF来估算的一对于克和H（H）_一分别排除最小得分（<−1.5），因此估计界限不是由经验CDF（反映稀疏数据）的最左尾数决定的。由于各种原因，这些估计值应被视为粗略的，例如，它们可能会受到AR和各种注释类在基本构成、替换模式或缺失数据量方面的差异的影响。然而，它们与通过完全不同的方法获得的估计值非常一致(Eöry等人，2009年).

我们感谢Elliott Margulies为ENCODE区域提供了多序列比对和估计的中性模型；Jim Booth建议将分数测试作为似然比测试的替代方法；希拉姆·克劳森（Hiram Clawson）在UCSC基因组浏览器中建立了新的保护轨道；David Haussler和Jim Kent在轨道开发中提供反馈和支持；安德烈·马丁斯帮助分析转录因子结合位点。这项工作得到了国家普通医学科学研究所（GM82901拨款）以及阿尔弗雷德·斯隆基金会、戴维·帕卡德和露西尔·帕卡德基金会和国家科学基金会（DBI-0644111拨款）的早期职业奖的支持。