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《美国病理学杂志》。2010年1月；176(1): 353–368.
数字对象标识：10.2353/ajpath.2010.090482
预防性维修识别码：项目经理2797896
PMID：20008141

表达早老素1相关家族性阿尔茨海默病突变的转基因小鼠的年龄相关血管病理学

米盖尔·加马·索萨,*† 丽塔·德·加斯佩里,*† 安妮·罗彻,‡§ 雅典娜·王庆中,‡ 威廉·詹森,‡ 弗洛雷斯,‡ 吉塞尔·佩雷斯,*† 詹姆斯·施梅德勒,† 达拉·迪克斯坦,‡ 帕特里克·R·霍夫,‡∥和格雷戈里·埃尔德†**††*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

中的突变早老素1（PS1）基因是家族性阿尔茨海默病（FAD）最常见的病因。除了老年斑、神经原纤维缠结和神经元丢失外，阿尔茨海默病（AD）还伴有血管病变。我们在两个PS1 FAD突变转基因小鼠系中描述了年龄相关的血管病理学，该病理学模拟了AD中血管病理学的许多特征。该病理学在微血管中尤为突出，微血管的血管变得稀薄和不规则，出现了许多异常环状血管和弦状血管。体视学评估显示海马微血管减少，并伴有海马萎缩。血管变化不呈亲刚性。然而，尽管缺乏亲合力，皮质表面的穿透血管在形态上常常异常，有时会发生微出血。血管基底膜相关抗原的免疫染色改变是微血管病的早期特征，与血管基底膜增厚和内皮细胞改变有关，这些改变在超微结构上可见。有趣的是，尽管FAD突变转基因在两种小鼠系的神经元中都有表达，但在血管内皮细胞或胶质细胞中没有检测到表达。因此，这些研究对神经-血管信号在AD相关血管病理发病机制中的作用具有启示意义。

虽然大多数阿尔茨海默病（AD）病例是零星发生的，但有些病例是以常染色体显性模式遗传的，称为家族性AD（FAD）。这些病例在临床和病理上与散发性疾病相似，但典型的发病年龄更早。三个基因的突变淀粉样前体蛋白(应用程序),早老素1(第1阶段)、和早老素2(第二阶段)已知会导致FAD，1PS1的突变是早期发病病例最常见的原因。2

除了老年斑、神经原纤维缠结、神经元和突触丧失外，AD还伴有血管病变。在这种病理学中最常见的形式，即嗜胶性淀粉样血管病（CAA），淀粉样蛋白沉积在血管壁上，软脑膜和新皮质动脉和小动脉受影响最大。3,4然而，血管病理也发生在微血管中，导致微血管密度降低和断裂。5微血管分支较少，出现细萎缩血管，称为弦血管，而其他血管则扭结成环。尽管唐氏综合征患者表现出类似的血管病理学，但AD患者微血管病理学与认知功能下降的原因和关系尚不清楚，这种血管病理学在没有老年斑块和神经纤维缠结的年轻患者中也存在6认为血管变化可能先于神经纤维缠结和老年斑块的发展。血管病理学也发生在人类PS1和PS2相关的FAD病例中，似乎大体上与散发病例中发现的病理学相似。2

尽管人类FAD病例相对罕见，但其已知的遗传病因学使其成为转基因动物建模的理想工具，并且存在许多FAD突变株系。APP或APP/PS FAD突变小鼠中出现了嗜软性血管沉积。7–12目前还没有关于单独表达PS1-FAD突变体的模型中的血管病理学的描述。在这里，我们描述了两个PS1 FAD突变转基因小鼠系的微血管病理学。虽然病理学缺乏CAA，但它模仿了AD相关血管病理学的许多其他特征。在这两个品系中，尽管突变的转基因在神经元中表达，但在血管内皮细胞或胶质细胞中未发现可检测的表达，这表明神经-血管信号在病理发展中起作用。

材料和方法

转基因小鼠

表达野生型人类的转基因小鼠第1阶段在神经元特异性烯醇化酶（NSE）启动子的控制下，cDNA或包含P117L FAD突变的cDNA是通过原核注射产生的，之前已经有过描述（表1）.13,14这些小鼠是在C57BL/6×DBA F上生成的1杂交背景，通过对C57BL/6小鼠的繁殖而保持。如前所述进行基因分型。14

表1

研究的小鼠组

应变转基因研究的年龄观察到的病理学
PS1 PAC野生型Tg含人P1噬菌体人工染色体第1阶段4至28个月无
PS1 PAC M146V变压器含人P1噬菌体人工染色体第1阶段用M146V FAD突变改造4至33个月-与年龄相关的微血管病理学（变薄、不规则、串状血管）
-微血管长度缩短
-皮质穿透血管的非嗜酸性病理
-基底膜相关抗原的异常免疫染色
-血管基膜增厚
-海马萎缩
-树枝状结构改变
PAC小鼠的非Tg同胞无4至37个月无
NSE-PS1野生型Tg人类野生型第1阶段NSE启动子控制下的cDNA4至22个月无
NSE-P117L试验人类第1阶段NSE启动子控制下含有P117L FAD突变的cDNA4至24个月类似于PS1 PAC M146V
NSE小鼠的非Tg同胞无4至24个月无

Tg，转基因。

表达野生型人类的转基因小鼠第1阶段从P1噬菌体人工染色体（PAC）中，使用克隆RP1-54D12（204 kb；登录号AC 006342）产生包含整个人类第1阶段转录单位（>75kb；15). 创始人是通过注射C57BL/6×C3H F产生的1如前所述的卵母细胞。16

为了产生表达M146V FAD突变的PAC转基因小鼠，使用Ali Imam等人描述的Rec A介导的同源重组系统对54D12克隆进行了改造。17一个1.6 kb的片段（核苷酸135630–137240），包含第1阶段利用引物对5′-GGAGACCAAGGTGGGCAGAT-3′和5′-TGGAGCCCTAGCCTTCTATT-3′从PAC 54D12 DNA中扩增出外显子6，并亚克隆到pCR2.1载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。M146V FAD突变（ATG到GTG密码子改变）是通过使用Quikchange试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）将54D12克隆（对应于PS1 mRNA的653核苷酸）中136459处的A残基突变为G而引入的以及互补的诱变引物集5′-CAGGAGAGTCATCACACATGACACT-3′和5′-AGTGTCATTGTCGTGAGCGGATAACATTCAC-3′。通过核苷酸序列分析确定存在M146V突变。

M146V突变通过使用pDF26载体（来自荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学的A.M.Ali Imam和F.Grosveld博士）的同源重组引入54D12 PAC克隆。该载体含有氯霉素抗性基因（Cm对)，一个rpsL+计数器选择等位基因（StpS公司)，一种对温度敏感的复制起始蛋白（RepAts），是复制的起源和recA基因大肠杆菌通过XhoI-HindIII消化从pCR2.1载体上切下突变的1.6-kb片段，并将其亚克隆到pDF26的XhoI-HindIII位点（产生质粒pDFPS1M146V），将其转化为大肠杆菌在30°C下选择XL蓝色细胞（Stratagene）和氯霉素耐药克隆。将pDFPS1M146V阳性克隆的质粒DNA转化为大肠杆菌携带Kan的DH10细胞对PAC 54D12。在含有卡那霉素和氯霉素的平板上选择双转化子（pDFPS1M146V/PAC54D12），温度为30°C，然后转移到新鲜卡那霉酸/氯霉素平板上，并在43°C（非允许温度）下培养过夜。为了通过recA活性选择携带pDFPS1M146V的重组克隆整合到PAC54D12的同源区，通过Southern blot分析（使用携带上述1.6-kb片段的第1阶段外显子6序列作为探针）。阳性克隆在43°C下在含卡那霉素的培养板上培养过夜，以便能够切除整合的载体序列。在这些重组事件中，原始拷贝或包含修饰的M146V突变的靶向序列被留下。在43°C下，在卡那霉素/链霉素平板上进一步选择切除的载体PAC克隆，只允许切除pDF-rpsL的细菌克隆生长+矢量序列。对含有M146V突变的PAC克隆（PACPS1M146V）的鉴定如下：含有第1阶段用引物对5′-TGACAGAATACCACACAT-3′和5′-TCCATAACTACTGACCAGG-3′从单个PAC克隆中扩增出感兴趣的外显子6序列（参考PAC 54D12的核苷酸136351-136600），用BspHI消化，琼脂糖凝胶电泳分析。M146V突变是通过外显子6中两个BspHI限制位点中的一个缺失检测到的。约50%的克隆检测到M146V突变。如前所述，分离并分析了两个单独突变的PS1PAC M146V克隆的DNA。16将纯化的DNA在10 mmol/L Tris-HCl中的浓度调节为1μg/ml，pH7.5，0.5 mmol/LEDTA，30 nmol/L精胺，70 nmol/L-精胺，0.1 M NaCl，并通过原核注射C57BL/6×C3H F产生转基因小鼠1卵母细胞。通过PCR/BspHI限制性内切酶分析对尾部DNA进行基因分型，在18个婴儿中确定了5个创始人。使用上述引物对尾部活检的基因组DNA进行PCR，然后进行BspHI消化，以确认野生型或M146V突变等位基因的存在，从而进行常规基因分型。通过对C57BL/6小鼠进行繁殖来维持系。

这个第1阶段−/−使用的小鼠是Shen等人生产的小鼠。18这些动物是在混合遗传背景下饲养的，并通过饲养C57BL/6野生型小鼠来维持。如Shen等人所述，通过PCR确定基因型。18动物被安置在12小时的光/暗循环中，并接受食物和水随意由于所有品系的遗传背景都是混合的，所以选用非转基因同窝繁殖的后代作为对照。所有方案均由James J。彼得斯退伍军人事务部医疗中心和西奈山医学院按照公共卫生服务局关于实验动物人道护理和使用的政策以及国家卫生研究院关于实验动物护理和使用指南进行。

组织加工

成年小鼠用150 mg/kg氯胺酮和30 mg/kg甲苯噻嗪麻醉，用4%冷多聚甲醛在PBS中经心灌注处死。灌注后，取出大脑，在4%多聚甲醛中固定48小时，转移到PBS中，并在4°C下保存至切片。使用Leica VT1000 S振动仪（德国威兹拉Leica）切割50微米厚的冠状切片。

组织学和免疫组织化学

使用标准方法进行H&E染色。按照Schmidt等人的描述进行硫黄素S染色。19在游离漂浮切片上进行免疫组织化学染色。对于免疫荧光染色，所用的主要抗体为兔多克隆抗胶原蛋白IV抗血清（1/500；Chemicon International，Temecula，CA）、兔多克隆抗血清（1/100；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）、兔多克隆抗纤维连接蛋白抗血清（1:400；Sigma Aldrich）、，一种大鼠单克隆抗perlecan抗血清（1:500；Neomarkers，加利福尼亚州弗里蒙特）、一种兔多克隆抗aβ抗血清（1/200稀释；Chemicon International）和一种小鼠单克隆抗β-III微管蛋白（TuJ1，1/500；Covance Research Products，宾夕法尼亚州丹佛）。用Tris-缓冲盐水（TBS；50 mmol/L Tris-HCl、0.15 M NaCl（pH 7.6）和0.15 M氯化钠）/0.1%Triton X-100/5%山羊血清（TBS-TGS）封闭切片1.5小时，并在室温下在TBS-TGS中应用一级抗体过夜。在PBS中洗涤1小时后，在TBS-TGS中用物种特异性AlexaFluor二级抗体结合物（1/400；分子探针，Burlingame CA）孵育2小时，检测免疫荧光染色。用1μg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚对细胞核进行复染。在PBS中清洗后，使用Gel/Mount（加利福尼亚州福斯特市Biomeda）将切片安装在幻灯片上。仅用二级抗体孵育的切片作为对照。

采用与前述方法类似的方法，在胃蛋白酶消化的组织上进行IV型胶原的免疫过氧化物酶染色。20用10%甲醇/1%过氧化氢在PBS中预处理切片10分钟，用PBS洗涤，并用1 mg/ml胃蛋白酶（Dako、Carpintia、CA）在3%乙酸中处理50分钟，温度为50°C。在PBS中洗涤后，如上所述施用第一抗体，然后施用山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（1/300，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）两小时。在pH 7.6的50 mmol/L三咪唑缓冲液中使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）进行染色。切片安装在载玻片上，过夜干燥，用0.5%甲酚紫复染5分钟，然后用分级系列乙醇溶液脱水（70、85、90、100%各1分钟）。然后用Americlear（Fisher，Tustin，CA）处理载玻片1分钟，然后用二甲苯处理1分钟，并用Cytoseal 60覆盖载玻片（Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI）。

使用AxioVision 4.3版程序（Zeiss，Thornwood，NY）、连接到DXC-390 CCD相机（Nikon，Melville，NY。固定脑的未染色切片在尼康SMZ1500立体显微镜上拍摄，该显微镜配备了倾斜相干对比照明系统，并连接到SPOT RT数码相机（密歇根州斯特林海茨）。使用Adobe Photoshop 7.0（加利福尼亚州圣何塞，Adobe Systems）对数字图像进行颜色平衡。

现场杂交

对于就地杂交后，将大脑植入OCT化合物中（Tissue Tek，Elkhart，in）。将15个微米厚的低温恒温器切片风干1至2小时，并将其固定在PBS-焦碳酸二乙酯中的4%多聚甲醛中。切片在室温下用1 mg/ml蛋白酶K处理5分钟，并在多聚甲醛中再固定20分钟。用PBS-二乙基焦碳酸酯多次洗涤后，在三乙醇胺存在下用醋酸酐对切片进行乙酰化。然后将切片在50%甲酰胺、5×生理盐水柠檬酸钠、5×登哈特溶液、250μg/ml酵母RNA和500μg/ml鲱鱼精子DNA中预杂交2小时，并在70°C下与400 ng/ml热变性（80°C）地高辛标记的反义RNA探针杂交16小时。为人类做准备第1阶段-特异性探针我们扩增了一个跨越人类核苷酸1891-2315的片段第1阶段3′非翻译区（登录号NM_000021号)，人类和小鼠之间同源性很低的区域第1阶段引物为5′-ACTACCAGATTTGAGGGACG-3′和5′-GGCACACAGAGTGTATG-3′。将产生的424 bp人类PS1 DNA产物克隆到pDrive载体（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）。在地高辛标记的尿苷三磷酸以及其他核苷酸和T7 RNA聚合酶的存在下，用XhoI线性化质粒制备反义人特异性cRNA探针。将载玻片在70℃的0.2×生理盐水柠檬酸钠中清洗1小时，然后在室温下用50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）和0.15 M NaCl（TBS）清洗。在室温下用10%热灭活山羊血清在TBS中封闭载玻片，并在4°C下用1/250稀释的抗地高辛抗体孵育过夜（瑞士巴塞尔罗氏）。用TBS多次洗涤后，在碱性磷酸酶缓冲液（0.1 M Tris-HCl（pH 9.5）、0.1 M NaCl、50 mmol/L MgCl）中平衡载玻片20.01%吐温-20和0.25 mg/ml左旋咪唑）染色30分钟，然后用0.4 mg/ml硝基蓝四唑氯化物和0.19 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸在同一溶液中在4°C下染色72小时。

西方印迹法

为了测定PS1水平，将大脑在10体积的含有HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Pierce，Rockford，IL）的放射免疫沉淀分析缓冲液（50mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）、0.15M NaCl、1mmol/L EDTA、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠和0.1%SDS）中匀浆。样品以15000 rpm离心20分钟，并收集上清液。使用BCA试剂分析（Pierce）测定蛋白质浓度。蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在不煮沸的情况下装入SDS-PAGE凝胶。凝胶被印在聚偏二氟乙烯膜上（Millipore，Billerica，MA）。用50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）、0.15 M NaCl、0.1%吐温-20（TBST）和5%脱脂奶粉封闭印迹，并用识别人类PS1 N末端片段（NTF）的小鼠单克隆抗体NT.1（1/2000）或鼠单克隆抗体33B10（1/3000）进行探测，识别人和小鼠PS1 C末端片段（CTF），然后用辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG进行二次检测。使用ECL+试剂（GE Healthcare Bio-Sciences，Piscataway，NJ）和CL-Xposure胶片（Pierce）对条带进行可视化。

为了对基底膜相关蛋白进行印迹，将每只动物的一个大脑半球在50 mmol/L磷酸钠（pH 7.6）、150 mmol/L-氯化钠（NaCl）、1 mmol/L-EDTA、1%Triton、0.25%脱氧胆酸钠、0.5%补充有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物I和II（Sigma-Aldrich）的SDS缓冲液中均质。匀浆以14000 rpm离心20分钟，然后去除超抗原。如上所述测定蛋白质浓度，为了进行印迹，在7.5%的SDS-PAGE凝胶上运行每个样品50μg的蛋白质，并将其印迹到聚偏二氟乙烯膜上。对于IV型胶原蛋白分析，将样品与不含巯基乙醇的Laemmli缓冲液混合，并且在加载到凝胶上之前不要煮沸。如上所述，将膜封闭1小时，并在4°C下用在封闭溶液中稀释的一级抗体孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶结合抗兔IgG进行二次检测（1/5000在仅含1%脱脂奶粉的封闭溶液中；GE Healthcare Bio-Sciences）。使用ECL+试剂（GE Healthcare Bio-Sciences）对条带进行可视化，并暴露于HyBlot CL胶片（新泽西州梅图琴市丹维尔科学公司）和/或使用柯达成像站4000R成像。根据需要，用Re-blot plus strong（Millipore）剥离污渍，并进行复制。所用的主要抗体为兔多克隆抗纤维连接蛋白（1/3000；Sigma-Aldrich）、兔多克隆抗层粘连蛋白（1/500；Sigma Aldrich。使用兔多克隆抗β-微管蛋白（1/3000；Abcam）作为负荷对照。使用Image Quant TL软件（GE Healthcare Bio-Sciences）进行定量，并将β-微管蛋白水平归一化。

立体分析

使用振动棒（徕卡）在连续50μm厚的冠状切片上切割大脑。选择每六个切片，从1到6之间的随机切片开始，并如上所述对IV型胶原进行免疫染色。为了减少偏差，所有分析都是对基因型盲法进行的。为了进行体视学分析，首先使用Zeiss Axioplan 2显微镜和StereoInvestigator软件（MBF Bioscience，Williston，VT）在低倍镜（×2.5）下观察IV型胶原免疫染色切片，以勾勒海马边界。然后使用软件的Space Balls探针检查血管面积和长度21–24使用×40油蔡司平面Apochro物镜，1.0 n.a。使用的随机取样网格的尺寸设置为x个=310微米，年=300μm，使用半径为15μm的半球。在组织的顶部和底部设置一个0.5μm的保护区，以避免在受损的切割表面进行计数，而剩余的组织厚度表示分隔器高度；平均断面厚度为18.3μm。体视学软件在整个感兴趣区域内系统地随机放置采样网格。血管长度密度是根据血管系统和半球之间的交点总数（计数交点的平均数=335）计算得出的，使用从Space Balls方法的描述中导出的以下公式，并使用组织加工后描绘区域的面积和截面厚度：

VLD（VLD）=2×Σ/秒×(D类X（X）×D类Y（Y）×t吨)2×π×第页2×1V（V）

其中VLD表示毛细管长度密度，∑是大脑半球和微血管的交点总数，D类X（X）和D类Y（Y）半球中心中点之间的距离x个-和年-轴，t吨组织学处理后的实际平均切片厚度，第页半球的半径和V（V）所调查的组织体积。在对处理过的组织使用体视学技术时，组织体积的变化总是令人担忧的。在这项研究中，组织切片是在切割后不久和染色前安装的，这样可以最大限度地减少x个–年指示。22收缩z（z）-方向可以是实质性的；体视学软件通过定期测量真实断面厚度并使用该系数计算总血管长度和海马体积来对此进行校正。

超微结构分析

电子显微镜使用的方法已在前面描述过。25简单地说，嵌入技术遵循了所描述的程序26研究血管的超微结构。对每个基因型的小鼠进行麻醉，并如上所述用含0.125%戊二醛的4%多聚甲醛灌注。将组织取出并在同一灌流液中固定过夜。然后取下大脑，用振动棒切割250μm厚的冠状切片，并解剖出相应的皮质块。如其他地方所述，对试样进行冷冻替换和低温埋入。26–28将切片浸泡在4%的溶液中进行冷冻保护d日-葡萄糖，随后甘油浓度增加（在磷酸盐缓冲液中从10%增加到30%；v/v）。在通用冷冻系统KF80（奥地利维也纳Reichert-Jung）中，将各部分迅速投入由液氮（−190°C）冷却的液态丙烷中。将样品浸入低温替代AFS装置（奥地利维也纳莱卡）中溶解于无水甲醇中的0.5%乙酸铀酰中（−90°C，24小时）。以4°C/h的步长将温度从−90°C升高至−45°C。用无水甲醇洗涤后，在−45℃的温度下用Lowicryl HM20树脂（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州华盛顿堡）渗透样品。在−45°C下用紫外线（360 nm）聚合48小时，然后在0°C下聚合24小时。在Reichert-Jung超薄切片机上用金刚石刀切割超薄切片（70 nm），并用Coat-Quick胶粘笔（电子显微镜科学）将其安装在镍网格上。在JEOL 1200 EX电子显微镜（日本东京）上进行超微结构分析，并使用先进的CCD相机（马萨诸塞州丹弗斯高级显微镜技术）进行成像。使用Adobe Photoshop 7.0生成电子显微镜图像，并调整亮度和对比度。

统计程序

结果以平均值±SEM表示。对于所有比较，方差的相等性首先通过Levene检验进行评估。由于没有发现任何差异显著(P（P）>0.05，Levene统计）采用单向方差分析进行比较，然后采用Tukey诚实显著性差异（HSD）检验对所有组对进行多次比较，或使用未配对的Student’st吨-两组比较时的测试。使用GraphPad Prism 4.0（GraphPad-Software，加利福尼亚州圣地亚哥）或SPSS 16.0（SPSS，伊利诺伊州芝加哥）程序进行统计分析。

结果

表达人野生型或M146V FAD突变体的PAC转基因小鼠的制备第1阶段

表达人类野生型的转基因小鼠第1阶段使用包含人类的P1人工染色体（PAC）克隆（54D12）生成第1阶段转录单位。为了创建表达FAD突变体的转基因小鼠，使用Rec-A介导的同源重组用M146V PS1 FAD突变修饰PAC54D12克隆。我们选择了两个品系的小鼠（一个野生型和一个FAD突变型）进行研究，根据Western blotting判断，这些小鼠在大脑中表达的人类PS1水平相似，并且基于就地杂交。在图1成人大脑提取物的免疫印迹显示，印迹有识别PS1 NTF的人类特异性抗体NT.1或识别PS1 CTF的抗体33B10。NT.1在两个转基因株系中都发现了一条在非转基因大脑中未见的独特带（图1A）.用33B10进行蛋白质印迹（图1B）是针对小鼠和人类中相同的PS1蛋白区域生成的，14在野生型和FAD突变株系中，PS1的表达水平与非转基因大脑相比，转基因大脑中的PS1表达水平大约高出两到三倍。另外值得注意的是，人类CTF主要取代了小鼠PS1，这与小鼠CTF的区别在于其移动速度较慢（图1C）.

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PS1-PAC野生型和PS1-PAC-M146V转基因小鼠的转基因表达。对2个月大的非转基因（非Tg）同窝对照、人类PS1 PAC野生型转基因（PS1 Wt-Tg）或PS1 PAC-M146V转基因小鼠（M146V）的提取物（50μg蛋白质）进行Western blotting。答：用NT.1检测印迹，NT.1是一种人类特异性抗体，可识别约30 kDa的人类，但不能识别小鼠NTF。注意非转基因大脑中缺乏免疫反应。B类：用抗体33B10检测印迹，该抗体可识别约20 kDa的小鼠和人类PS1 CTF。注意PS1 PAC野生型和M146V突变株系中的可比表达水平，以及转基因株系中总PS1 CTF与非转基因株系相比的升高。抄送：重复使用33B10进行吸液，蛋白质含量较少（25μg）。注意，小鼠（Mu）CTF与人类（Hu）CTF的区别在于其迁移速度稍快，而在转基因系中，人类蛋白已在很大程度上取代了小鼠。

我们通过以下方法分析了成年PS1 PAC转基因小鼠的转基因表达模式就地使用人类特异性cRNA探针和地高辛检测系统进行杂交。在PS1野生型和FAD突变型转基因系中，人类转基因在所有脑区表达，并显示出与成年小鼠脑内内源性PS1类似的神经元表达模式。29海马体中的标记示例如所示图2.

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PS1 PAC转基因小鼠的转基因表达。现场使用来自该基因3′非翻译区的人特异性PS1反义cRNA探针对2个月龄成年动物进行杂交。图示为PS1 PAC野生型转基因海马的矢状截面(一)，PS1 PAC M146V转基因(B类)和一个非转基因的室友控制(C类). 注意非转基因对照脑中缺乏杂交信号(C类)以及转基因动物中颗粒细胞和锥体细胞层的显著标记(一和B类). 比例尺：100μm。

要测试第1阶段PAC转基因可挽救胚胎致死性第1阶段无效突变小鼠(第1阶段−/−)我们将PS1-PAC野生型和PS1-PAC-M146V系的转基因培育到小鼠上第1阶段−/−背景。野生型和FAD突变型转基因都挽救了第1阶段null突变体。获救的成年动物看起来大小正常，有生育能力，与非转基因同窝动物几乎没有区别。这些结果证实了野生型和FAD突变型PAC转基因在小鼠中的功能性，也与其他报告一致，即PS1 FAD突变株可以挽救小鼠的胚胎致死性第1阶段-空鼠标。30,31

PS1 FAD突变转基因小鼠的年龄相关性微血管病理

人类AD的血管病理学包括CAA，主要见于小动脉和小动脉，以及伴有血管磨损的大脑微血管的显著改变和各种异常血管的出现。5为了确定PS1 FAD突变小鼠是否表现出血管病变，我们检测了PS1 PAC M146V转基因小鼠以及在NSE启动子控制下表达PS1 P117L FAD突变的小鼠。NSE系是先前开发的，并表达了包含P117L FAD突变的人类cDNA。14作为对照，我们生成了表达由相同启动子驱动的野生型人类PS1 cDNA的株系。根据Western blotting和就地杂交。14像其他PS1 FAD突变小鼠一样，32NSE-P117L FAD突变小鼠Aβ42水平升高，Aβ42/40比率增加13与非转基因和NSE-PS1野生型转基因小鼠进行比较，表明P117L突变转基因的功能。

最初，我们使用IV型胶原免疫染色来观察血管形态。在年轻的PS1 FAD突变M146V或P117L小鼠（6个月或以下）中，我们没有发现异常。然而，我们一致观察到M146V和P117L FAD突变小鼠的血管病理学随年龄增长而变化。PS1 PAC M146V转基因小鼠海马的病理示例如所示图3与对照组相比，FAD突变小鼠的微血管通常较薄且不规则。此外，许多绳状容器（例如，图3H)观察到其他血管出现扭结或扭曲形态（例如，图3G). 变薄和不规则以及线状和扭曲的形态都很容易让人联想到AD中的血管病理学。5这些变化广泛存在于皮层和皮层下区域。我们一直在1岁或1岁以上的小鼠中观察到一定程度的这种病理学，而在年龄较大的小鼠中这种病理学变得更加明显。在非转基因对照和人PS1-PAC野生型转基因小鼠之间，没有观察到随着衰老的形态学差异。

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PS1 PAC M146V转基因小鼠中与年龄相关的血管改变。28个月龄非转基因对照大鼠海马抗胶原蛋白IV免疫过氧化物酶染色切片(一和D类)，27个月大的PS1 PAC M146V转基因(B类,E类、和G–J型)和28个月龄的PS1 PAC野生型转基因(C类和F类)老鼠。注意FAD突变体中的微血管变薄(B类和E类). FAD突变体微血管的高倍图像如所示G–J型。扭曲和扭结的容器用箭头(G公司)，字符串状容器由箭头(H（H）). 比例尺：100μm，A–C; 50微米，D类和E类; 20微米，G–J型.

我们还在NSE-P117L转基因小鼠中观察到类似的年龄相关血管病理学（图4）这种病理学在大于1岁的NSE-P117L转基因小鼠中一直可见，而在年龄匹配的非转基因同窝小鼠或NSE-PS1野生型转基因小鼠中未发现。虽然在正常血管中有时可以看到一些轻微的不规则现象（例如，图4C)这些变化从未达到PS1 FAD突变血管的不规则程度，使得PS1 FAD-突变小鼠的两个品系在形态学上很容易与对照组区分开来。

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NSE-P117L FAD突变小鼠的微血管病理学。2年非转基因小鼠内嗅皮层抗胶原IV免疫过氧化物酶染色微血管(一)，NSE-P117L转基因(B类,D类、和E类)和NSE-PS1野生型转基因(C类)老鼠。注意FAD突变体中血管表面的不规则性(B类).箭头在里面D类和E类指向FAD突变体中发现的线状血管。比例尺：50μm，A–C; 25微米，D类和E类.

衰老PS1 PAC M146V转基因小鼠微血管减少和脑萎缩

血管丢失是AD微血管病变的标志。5为了确定在PS1 PAC M146V转基因小鼠中观察到的血管病理学是否伴随着微血管减少，我们对15个月或更大的PS1 PAC-M146V和PS1 PAC野生型转基因小鼠以及非转基因同窝小鼠的海马IV型胶原免疫抑制微血管进行了体视学评估控制。如所示图5与对照组相比，FAD突变体的总血管长度降低了40%至45%：在非转基因和PS1 PAC野生型转基因小鼠中，总血管长度分别从772±130厘米（SEM）和720±43厘米下降到了FAD突变小鼠的430±28厘米(F类2,12= 7.646,P（P）= 0.007,P（P）<0.05，PS1 PAC M146V与PS1 PAC野生型转基因小鼠和非转基因同窝对照，Tukey HSD）。FAD突变体的平均微血管面积减少了25-30%，但这种差异没有达到统计学意义(F类2,12= 2.863,P（P）= 0.096). 各组之间的微血管密度差异<20%(F类2,11= 0.890,P（P）= 0.43).

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PS1 PAC M146V转基因小鼠海马微血管长度减少。对PS1 M146V PAC小鼠海马的血管参数进行体视学评估(n个=7，年龄范围为15至33个月，平均24.4±2.6个月），并与非转基因（Non-Tg）同胞对照组进行比较(n个=4，年龄范围28-37个月，平均32.5±1.8个月）和PS1 PAC野生型转基因（PS1Wt-Tg）小鼠(n个=4，年龄范围18-28个月，平均22.5±2.6）。单向方差分析显示，各组在年龄上没有显著差异(F类2,12= 3.462,P（P）= 0.06,P（P）>0.07所有比较，Tukey HSD）。数据以总血管长度表示(一和B类)和面积(C类和D类)每个海马(C类和D类)以及微血管密度(E类和F类). *P（P）=0.01与非Tg和P（P）=0.03与PS1 Wt Tg（Tukey HSD）。

血管长度减少而血管密度没有任何变化，这表明伴随着海马萎缩，事实上，M146V FAD突变小鼠经常可见脑萎缩，包括年龄最大的小鼠海马粗大萎缩（图6）定量分析表明，与非转基因和PS1 PAC野生型转基因小鼠的混合对照组相比，FAD突变组的海马体积减少了约30%(图6;P（P）=0.012，未配对t吨-测试）。虽然脑萎缩的基础仍有待深入研究，但病理学的一个方面似乎是FAD突变动物的树突状结构磨损。这种损耗在新皮质大锥体神经元中最为明显。在图7共聚焦显微镜观察到一只7.5个月大的M146V FAD突变小鼠和对照小鼠的新皮质β-III微管蛋白免疫染色切片。在FAD突变体中，树突结构明显改变。虽然不可能推断出直接的因果关系，但PS1 PAC M146V转基因小鼠的微血管病变似乎与实质性脑萎缩有关。

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PS1 PAC M146V转基因小鼠中与年龄相关的脑萎缩。3岁非转基因儿童未染色固定脑冠状切片(一)和M146V PAC转基因同窝小鼠(B类)如图所示。显示了侧脑室（LV）、第三脑室的背侧（D3V）和腹侧（V3V）部分。C类和医生：同一小鼠的海马体积分析图5M146V FAD突变小鼠的平均海马体积比两个对照组均低30%，单向方差分析显示组间差异显著(F类2,12= 3.921,P（P）=0.049），尽管后测没有达到统计学显著性(P（P）>0.09，Tukey HSD）。然而，如果两个对照组（非Tg和PS1 Wt-Tg）没有差异(P（P）=1.00），作为对照组，海马体积(D类)在M146V FAD突变小鼠中*P（P）=0.012，与对照组（未配对t吨-测试）。

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PS1 FAD突变小鼠树突状结构改变。显示了一只10个月大的非转基因小鼠的新皮质共焦激光扫描显微镜图像(一)，以及7.5个月大的PS1 M146V PAC(B类)和PS1 PAC野生型转基因(C类)老鼠。用抗体Tuj（红色）对切片进行β-III微管蛋白免疫染色，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚核染色（蓝色）进行复染。注意FAD突变体中的树突（其中一个由箭头)看起来又矮又瘦。比例尺：20μm。

PS1 FAD突变小鼠的血管病理学不是嗜同性细胞

CAA涉及淀粉样蛋白在血管内的沉积。它是人类AD中最常见的血管病理学形式。为了确定PS1 FAD突变小鼠的血管病理是否与嗜胶粒性改变有关，我们进行了硫黄素S染色（图8）我们在不同年龄段的M146V或P117L FAD突变小鼠中均未发现嗜肝细胞的变化，尽管在CRND8转基因小鼠中出现了明显的嗜肝细胞变化33作为阳性对照纳入。我们还没有发现PS1 FAD突变小鼠血管中的免疫染色有任何Aβ沉积的证据（数据未显示）。

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在PS1 FAD突变小鼠中，血管病理学不是嗜同性的。Nomarski-损坏(一和C类)或硫黄素S染色(B类和D类)15个月龄NSE-P117L FAD突变转基因小鼠的切片(一和B类)或一只1岁的CRND8转基因小鼠(C类和D类)如图所示。安箭头在里面B类表明NSE-P117L FAD突变小鼠皮质表面有一个非固定的穿透血管，根据大小可能是小动脉。来自CRND8转基因小鼠的硫黄素S染色血管显示为阳性对照(D类). CRND8小鼠的淀粉样斑块由箭头在里面D类。比例尺：100μm。

有趣的是，尽管缺乏亲合力，但在FAD突变小鼠中，最容易发生CAA的皮层表面穿透血管的形态通常异常。H&E染色的穿透性皮质血管示例如所示图9FAD突变系中的这些血管，根据其大小推测为小动脉，通常表现为“破裂”外观或与血管周间隙增宽相关的“血管内血管”图像（图9，C–E）微出血是CAA常见的特征，有时也会观察到（图9F）有趣的是，对“双筒状”或“血管内血管”外观的描述也被用来描述人类AD中发现的硫黄素S染色的嗜软性血管的外观。34,35然而，这里描述的血管没有表现出嗜软性或Aβ沉积的免疫组织化学证据。

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PS1 FAD突变小鼠穿透皮层血管的组织学异常。所示为NSE-PS1野生型转基因的H&E染色切片(一)或NSE-P117L FAD突变(B–F类)老鼠。B类：皮质表面血管周围空间异常扩张的表现为箭头.微血管C类和D类血管周围间隙异常扩张，出现“血管内血管”或“双管”外观D类含有血栓(箭头).电子邮箱：双筒容器的高倍视图，内部线缆由箭头和容器外壁箭头.传真：有出血迹象的血管。容器的轮廓由箭头.一个箭头表示含铁血黄素的单核细胞和多形核白细胞浸润的区域。比例尺：50μm，A–D; 25微米，E类和F类.

基底膜相关蛋白改变PS1 FAD突变动物微血管的免疫染色

血管基底膜的改变被认为是AD微血管病变的早期特征。36血管基底膜的状态可以通过膜相关抗原的免疫染色来评估。然而，包括IV型胶原在内的许多抗原的染色仅在正常成年小鼠的灌注固定材料中发生不一致。20,37,38我们最近发现，如果在免疫染色之前进行胃蛋白酶消化步骤，成年小鼠脑血管系统的广泛染色可以用IV型胶原和其他抗原实现，20用于上述IV型胶原染色的方法。

然而，有趣的是，即使没有胃蛋白酶消化，带有IV型胶原和珍珠糖等抗原的PS1 FAD突变小鼠的大脑中也出现了血管染色。在图10PS1 PAC M146V突变株和NSE-P117L转基因株中的IV型胶原血管染色示例。与非转基因或野生型人类转基因品系相比，尽管缺乏胃蛋白酶处理，但血管染色在含有IV型胶原的FAD突变转基因品系中均显著。在图11NSE-P117L FAD突变转基因、NSE-PS1野生型转基因和年龄匹配的非转基因小鼠中显示了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖perlecan海马的免疫染色示例。在NSE-P117L脑内可见广泛的珍珠糖血管染色。相反，在非转基因或NSE-PS1野生型转基因动物中几乎没有检测到perlecan免疫反应性。

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未经胃蛋白酶预处理，PS1 FAD突变小鼠IV型胶原血管染色异常。图示为海马IV型胶原免疫染色（绿色）(一和B类)或内嗅皮层(C类和D类)15个月大的非转基因(一)或NSE-P117L(B类)以及10个月龄的PS1野生型PAC(C类)或M146V PAC(D类)转基因小鼠。切片用核染色（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚，蓝色）进行复染。注意FAD突变转基因小鼠血管系统的显著标记(B类和D类). 比例尺：100μm。

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在未经胃蛋白酶预处理染色的PS1 FAD突变小鼠中，用perlecan进行异常血管染色。一个15个月大的非转基因小鼠海马体中显示出抗珀利康免疫染色(一)，NSE-PS1野生型(B类)，和NSE-P117L转基因(C类). 注意NSE-P117L转基因动物的显著血管染色(C类). 比例尺：100μm。

PS1 FAD突变转基因小鼠基底膜相关蛋白的未改变水平

PS1 FAD突变小鼠基底膜相关蛋白的微血管免疫染色增强可能归因于基底膜相关蛋白质表达增加或血管基底膜重组导致抗原表达改变。为了确定FAD突变小鼠大脑中血管膜相关蛋白的总水平是否发生改变，我们通过Western blotting比较了NSE-P117L FAD突变和非转基因对照小鼠的纤维连接蛋白、层粘连蛋白和IV型胶原的水平。如所示图12在FAD突变的大脑中，我们没有发现纤维连接蛋白、层粘连蛋白或IV型胶原的总水平有任何差异。结合上述相同抗原的免疫染色特性改变，这些观察结果表明PS1 FAD突变小鼠的血管基底膜发生重组。

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PS1 FAD突变小鼠脑匀浆中细胞外基质相关蛋白的未改变水平。答：通过Western blotting法测定19至26个月龄NSE-P117L FAD突变小鼠大脑半球提取物中纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（Lam）和IV型胶原（Col IV）的水平，n个=8）和它们的非转基因同窝对照（wt，n个= 6). 转基因对照组的平均年龄（24.8±0.74个月）和非转基因对照组（24.0±0.73个月）没有差异(P（P）=0.74，未配对t吨-测试）。这个箭头在层粘连蛋白面板中显示了～200kDa的形式。在相同的印迹上依次进行纤维粘连蛋白和层粘连素的印迹，然后探测β-微管蛋白作为负荷对照。由于用于IV型胶原定量的样品无法煮沸，因此分别对这些样品进行电泳，并用β-微管蛋白重新处理。所示的β-微管蛋白面板用于纤维连接蛋白和层粘连蛋白正常化。B类：中斑点的量化一结果与β-微管蛋白（tub）水平标准化。两组之间没有统计学上的显著差异（未配对t吨-测试）。

PS1 FAD突变转基因小鼠微血管病理的超微结构分析

为了确定上述免疫染色结果是否反映血管基底层的改变，我们用电子显微镜（EM）检查了PS1 FAD突变转基因小鼠大脑皮层的微血管。图13显示了10至11个月大的PS1 PAC M146V或NSE-P117L FAD突变转基因小鼠的大脑微血管，以及非转基因窝鼠对照组或携带PS1 PAC-野生型转基因小鼠的脑微血管第1页−/−背景。非转基因和人类中的微血管第1阶段野生型转基因显示出典型的神经血管超微结构，具有圆形管腔、完整的内皮细胞和光滑的毛细血管壁（图13，A和B）尽管在10-11个月大的小鼠中，光照水平下的血管改变通常不明显，但在这两种FAD突变系中，许多异常的血管轮廓都很明显（图13，C–F）光圈经常丧失，毛细血管壁有不同程度的退化。此外，内皮细胞核扭曲和肿胀，有时细胞核周围出现明显的白色晕圈（图13，E和F）.

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10至11个月龄PS1 FAD突变转基因小鼠脑血管病理的超微结构分析。非转基因同卵双胞胎的前额叶皮层可见横切面毛细血管(一)，一只携带PS1 PAC野生型转基因的小鼠培育到PS1上−/−背景(B类)，PS1 PAC M146V FAD突变株(C类和D类)，或NSE-P117L FAD突变(E类和F类). 微血管一和B类管腔呈圆形，内皮细胞完整，毛细血管壁光滑。内皮细胞核（N）表示为B类.C类和医生：注意管腔圆度的扭曲和内皮细胞核的改变，它们看起来既扭曲又肿胀。注意内皮细胞核周围的晕形成E类和F类毛细血管管腔中存在无定形材料，毛细血管壁也有不同程度的退化(箭头在里面E类和F类). 周围的神经细胞似乎完好无损。比例尺：2μm。

通过光学显微镜观察，弦状血管通常表现为较大血管之间的异常连接血管，血管之间可能延伸30μm或更大（图3）据我们所知，尚未对弦血管的超微结构相关性进行描述。我们搜索了可能代表弦状血管的血管轮廓。尽管弦状血管相对稀少，但我们能够观察到一些可能代表弦状血管形成早期阶段的轮廓（图14）。在中的三个示例中的两个图14微血管之间可见异常的桥接结构。图中，两个横向切片的微血管通过包含两个内皮细胞核的变形过程连接（图14A），而在另一个（图14B）一条相对正常的微血管通过短桥与退化的微血管相连。可以看到其他纵向切割的微血管，其中包含退行性狭窄（图14C）这也可能代表了弦船的早期阶段。

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PS1 FAD突变转基因小鼠的异常血管形态。图中所示为M146V FAD突变小鼠前额叶皮层的微血管图13.答：两条横切面上的微血管通过包含两个内皮细胞核的畸形过程相连（表示为星号).B类：相对正常的微血管出现在底部图像的边缘通过一个短桥连接到一个非常畸形的微血管（由箭头)其可以表示原始字符串容器。抄送：纵向切割的微血管包含退化段和狭窄（由箭头). 显示一个畸形的内皮细胞核（N）。每块面板周围的神经膜似乎完好无损。比例尺：4μm in一和C类; 3μm英寸B类.

上面显示的带有基底膜相关蛋白的PS1 FAD突变动物微血管的免疫染色改变也表明血管基底膜发生了改变，事实上，在这两个品系中，血管基底膜都明显增厚和断裂。NSE-P117L线基底层增厚的示例如所示图15有趣的是，尽管有明显的微血管病变，但周围的神经膜似乎完好无损(图13-15).

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NSE-P117L FAD突变转基因小鼠血管基底膜增厚。非转基因窝友对照组的前额叶皮层可见横切面微血管(一)和NSE-P117L FAD突变体(B类). 基底层表示为星号在两个面板中。请注意P117L-FAD突变体中基底层的增厚外观以及内皮细胞细胞核（N）中染色质结构的改变。在PS1 PAC M146V FAD突变株中也进行了类似的观察。比例尺：500 nm。

FAD突变基因的神经表达

NSE-P117L的病理学很有趣，因为NSE转基因似乎在非神经元细胞中不表达。这方面的证据来自我们之前的就地在杂交研究中，我们观察到了NSE驱动的转基因的神经元特异性表达模式。14我们还检测了人类PS1-PAC转基因小鼠成年大脑中PS1的表达。虽然与人类特异性cRNA探针杂交显示了广泛的神经元表达，但我们观察到脑血管内或周围没有表达（图16）此外，即使我们放宽杂交条件，使人类探针与内源性小鼠PS1发生交叉反应，我们仍然没有发现血管杂交（数据未显示）。这些就地关于小鼠PS1表达的发现与大多数其他关于PS1在正常成年大脑中定位的研究一致，这些研究报道了一种基本上神经元特异性的表达模式，在非神经元细胞中没有可检测的表达。29,39–41

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PS1 PAC转基因小鼠血管中缺乏转基因表达。现场用人特异性PS1反义cRNA探针进行杂交。PS1 PAC野生型转基因小鼠皮层表面杂交的示例。请注意，深层皮质层的细胞中存在较强的杂交，而层I的微血管中缺乏杂交，其中两个由箭头.比例尺：50μm，一; 25微米，B类.

因此，这些研究表明，PS1-FAD突变体的有限神经元表达可能足以诱导血管病理。该模型的一个预测是，位于白质等区域的微血管不应发生病理变化，因为这些区域不存在转基因表达。正如预期的那样，无论是PS1 PAC M146V还是NSE-P117L FAD突变转基因小鼠，白质血管均未显示病理学改变。在图17图中显示了一只两岁PS1 PAC M146V转基因小鼠胼胝体中的白质血管示例。在白质中，与邻近海马体中的畸形血管相比，微血管显示正常。NSE-P117L FAD突变小鼠白质中的微血管也显示正常（数据未显示）。总之，这些观察结果表明，PS1 FAD突变体破坏了成人大脑中的神经-血管信号传导。他们还表明，白质中的血管重塑可能由不涉及PS1的不同调节机制控制。

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PS1 FAD突变小鼠白质缺乏微血管病理学。在一只2岁的PS1 PAC M146V转基因小鼠中，显示了抗胶原蛋白IV免疫过氧化物酶染色的微血管与Nissl复染相结合。注意胼胝体（CC）的正常血管轮廓。相比之下，海马的方向层（SO）中存在明显的异常血管分布。在地层中，扭结(箭头)并且变薄了(箭头)微血管显示。比例尺：50μm。

讨论

血管病理学是AD的一个一致特征。在这里，我们表明两个PS1 FAD突变转基因小鼠系产生了与AD血管病理学相同的血管病理学特征。尽管在其他AD转基因模型中描述了血管病理学，这些模型过度表达与APP相关的FAD突变或APP与PS1或PS2 FAD突变的组合，7–12据我们所知，本报告首次描述了仅表达PS-FAD突变的小鼠的血管病理学。

病理学的几个特征值得评论。首先，病理学不是亲缘性的。CAA是AD中最常见的血管病理，尽管其严重程度可能高度可变，但CAA在一定程度上存在于几乎所有尸检病例中三在人类PS1 FAD病例中也有不同程度的表达。2缺乏亲合力可以解释为PS1 FAD突变小鼠的血管病理可能与淀粉样蛋白生成的改变无关。然而，它也可能表明可溶性Aβ低聚物42除了Aβ沉淀外，还可能对血管有毒。尽管PS FAD突变小鼠不会产生淀粉样斑块，但它们确实持续表现出Aβ产生的改变。事实上，在此研究的NSE-P117L系先前已被证明具有较高的Aβ42水平13M146V FAD突变在人类FAD患者的两个成纤维细胞中持续显示Aβ42升高，43以及转基因小鼠。32可溶性单体和低聚物也更难用免疫组织化学方法检测。因此，仍然有可能是免疫组织化学方法无法检测到的可溶性或寡聚物形式，并且不会导致淀粉样蛋白沉积，但这正是病理学的驱动因素。有趣的是，Kumar-Singh等人7有报道称，在Tg2576和PS/APP小鼠的淀粉样变和非淀粉样变微血管中都可以发现病理变化，这表明即使在frank CAA的情况下，血管病理仍然发生在未受影响的血管中。因此，本研究既可以进一步支持Aβ低聚物假说，也可以挑战淀粉样蛋白假说本身。需要进行额外的研究来确定Aβ寡聚体是否沉积在这些血管内。

病理学的第二个显著特征是血管基底膜的改变发生在PS1 FAD突变血管的早期。血管膜改变也是AD微血管病变的特征。36在PS1 FAD突变小鼠的超微结构中，毛细血管基底膜在血管病理的其他形态学表现明显之前出现增厚和营养不良。基底膜是细胞外基质蛋白、蛋白聚糖和结构蛋白的复杂混合物。尽管它们存在于正常成年小鼠大脑中，但许多基底膜抗原（包括IV型胶原）的染色仅在标准灌注固定组织中不一致，除非使用抗原回收方法。20然而，有趣的是，即使没有胃蛋白酶消化，当使用IV型胶原蛋白和珍珠糖抗血清时，PS1 FAD突变小鼠的大脑中也出现了血管染色。

增强的血管染色可以反映细胞外基质相关蛋白的增加。电子显微镜观察到血管基底层增厚。然而，通过Western blotting，我们没有发现NSE-P117L FAD突变体的大脑中IV型胶原、层粘连蛋白或纤维连接蛋白的水平有任何增加，认为这些细胞外基质相关蛋白的表达没有增加，相反，血管染色增加可能代表血管细胞外基质的重组，这些抗原对免疫染色的可及性增加。有趣的是，不经胃蛋白酶处理而用抗原（如IV型胶原）染色血管也是未成熟血管的典型特征，20在机械创伤后成人脑损伤区域的血管中也可见。44虽然这些不同染色模式的生理基础还不完全清楚，但它们似乎与胶质卵母细胞连接的紧密性最为相关（参见参考20). 事实上，大脑中未成熟微血管（未经胃蛋白酶处理，这些抗原染色良好）和成熟微血管之间的一个主要结构差异是，未成熟微动脉中存在较大的血管周间隙，这些间隙将外胶质基底层和内血管层分隔开。44,45事实上，胶质-血管连接的紧密性似乎与机械损伤后层粘连蛋白免疫染色的强度有关。44所以，通过类比，FAD突变小鼠的早期病理特征可能是胶质-血管连接正常紧密性的丧失。重要的是，在光镜下观察到显著血管病变之前的年龄段，在FAD突变小鼠中观察到血管周围间隙变宽，胶质突起充满无定形物质。

血管基底膜和胶质血管连接的改变可能被解释为PS1 FAD突变小鼠的血管重塑增加，可能被刺激为对低聚物aβ的反应。或者，营养信号的改变可以刺激血管重塑，而不依赖于Aβ的产生。在此背景下，两种重要的血管营养因子，血管内皮生长因子和转化生长因子β1在AD脑中被报道增加。46–49最近也有报道称v（v）β三整合素是血管生成的标志物，在AD脑微血管中表达增加。50这一观察结果进一步支持了AD中正在发生主动血管重塑的观点。有趣的是，表达组成性活性转化生长因子β1的转基因小鼠也被报道患有CAA，其早期病理特征是基底膜增厚。51Aβ本身通过受体介导的跨内皮细胞转运以及通过血管周围间隙的间质转运从大脑中清除。52,53无论是由Aβ还是其他因素诱导，增厚的血管基底膜和改变的胶质血管连接可能反过来损害Aβ的转运，并可能产生一个循环，在这个循环中，进一步的膜重塑导致进行性病理。

PS1 FAD突变小鼠血管病理的第三个显著特征是，血管病理的病理生理学基础似乎起源于神经元，因为在这两个品系中，FAD突变转基因在神经元中表达，但在胶质细胞或血管中不表达。我们以前的就地杂交研究记录了NSE驱动的野生型和P117L转基因的神经元特异性表达模式。14事实上，尽管PS1在发育过程中以及在成人非神经组织中广泛表达，但对PS1表达的免疫组织化学研究通常发现，在成人大脑中存在神经元表达模式，而在胶质细胞或血管内皮细胞中没有检测到表达。29PS1在反应性星形胶质细胞中表达，但在未受损大脑中的星形胶质细胞不易检测到。54,55我们的就地用人特异性cRNA探针对PS1 PAC小鼠进行的杂交研究也显示了广泛的神经元表达，但在脑血管内或周围没有表达。

总之，这些证据表明血管病理学起源于神经元。这可能证明有毒低聚物aβ的神经起源，这些研究事实上与其他研究平行，这些研究表明CAA可以由神经元特异性Thy1启动子驱动的突变APP转基因诱导。8–10此外，这些研究可能表明，PS1影响调节成人脑血管稳态的神经元信号，FAD突变的PS1干扰这些信号。这也为我们的研究提供了一个有趣的平行结果，即在发育过程中，神经上皮侧选择性表达PS1足以挽救血管的发育第1页空突变，56不能根据Aβ生成来解释的影响。事实上，基于PS1 FAD突变体对神经元的限制表达，我们可以假设FAD突变型最初破坏正常血管内稳态所需的神经-血管信号。随着时间的推移，这可能导致与年龄相关的血管逐渐受损，随着年龄的进一步增长，血管缺陷可能会损害神经血管单元的完整性，直到神经元的代谢或营养支持受到影响，导致神经元功能障碍。

独立于PS1 FAD突变体血管基底膜早期改变的机制，我们在这里显示，PS1 FAD-突变体小鼠发生微血管病，模仿AD中血管病理学的许多核心特征，但没有CAA。这些研究对Aβ的形式和神经-血管信号在病理产生中的作用都有影响，Aβ可能在血管病理产生中起关键作用。对这些小鼠的未来研究为揭示PS1 FAD突变体在神经血管信号传导中的作用提供了机会，并为研究神经血管信号在散发性AD中如何被破坏提供了见解。

致谢

转基因小鼠是通过西奈山医学院小鼠遗传学共享资源设施培育的。TgCRND8小鼠是David Westaway博士和Paul Fraser博士送给我们的礼物，我们感谢Michelle Ehrlich博士、Sam Gandy博士以及Loren Khan女士对西奈山殖民地的维护。感谢保罗·马修斯（Paul Matthews）博士和尼古拉·罗巴基斯（Nikolaos Robakis）博士赠送抗体，感谢阿里·伊玛姆（Ali Imam）博士和弗兰克·格罗夫尔德（Frank Grosveld）博士提供质粒。我们感谢Bridget Wicinski提供的专家技术援助。

脚注

由国家老龄研究所（授予AG20139、AG02219、AG05138、AG010491和AG029361）、阿尔茨海默病协会（IIRG-07-57318）和退伍军人事务部颁发的荣誉奖（5I01BX000342-02）支持。

工具书类

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文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会