Xist RNA A区的二维结构及其对PRC2结合的意义

小鼠A区二维结构的M折叠辅助建模

Wutz及其同事提出的每个重复序列折叠成双干环结构的结构不能解释我们在小鼠和人类a区观察到的大量V1 RNA酶裂解(图2)[11]。我们探索了每个重复折叠成一个独特的较长干环结构的可能性。这种折叠同样无法解释V1核糖核酸酶裂解(图S2). 我们得出的结论是，2-D结构可能涉及重复序列和间隔物之间的相互作用以及重复序列间的相互作用。然而，重复序列之间有多种可能的双重形成方式(图3– ​5,5，型号1-3）。我们通过检测中心聚A序列（位置550至555）中六个连续的强V1核糖核酸酶裂解来确定推测结构的设计方向，表明该片段参与螺旋结构。DMS对紧邻下游序列（位置555至561）的强烈修改表明存在单股状态。对这些数据的一个可能解释是，形成了一种称为SLS2M的中央干环结构，其中一条链上有U轨迹，另一条链中有a轨迹(图5). 在探索小鼠a区可能的折叠时，这种中央干环结构的形成被作为一个约束条件。这排除了两个连续重复将相互作用的结构（模型1，图3)，因为在这种情况下，整个多边形A区域将与位于重复3上游的多边形U轨迹交互，这与探测数据不一致(图3). 另一种可能的结构涉及A区5′和3′两半之间相互作用的形成。这将产生一个非常长的不规则干环结构，带有丰富的末端环（模型2，图4). 另一种结构涉及A区5′和3′部分的折叠，SLS2M位于两者之间（模型3，图5). 还探索了其他几个重复序列的替代配对，其中一个完全符合化学和酶数据。

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图2

在之前提出的西斯特A区二维结构上表示实验数据。

小鼠的七个重复序列和第八个半重复序列中的每一个都是根据先前预测的两个干环结构折叠的[11]T1、T2和V1核糖核酸酶裂解分别由圆圈、三角形和正方形上方的箭头表示。DMS或CMCT修饰的核苷酸被圈出。圆圈和箭头的颜色表示改性和劈理的产量——红色、黄色和绿色分别表示强改性、中等改性和低改性或劈理。V1核糖核酸酶裂解和化学修饰无法用两个干环结构模型解释，它们被蓝色通道包围。

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图3

西斯特A区可能的二维结构1的实验数据表示。

在模型1中，各种茎环结构都涉及两个连续的重复。重复项用红线表示，编号从1到8。化学和酶数据的表示如图2在三个面板中的每一个面板中，识别出DMS和/或CMCT修改的线段都显示在二维结构的示意图上（DMS和CMCT分别为完整线和点线）。在两种化学试剂分析的片段中，未修饰的核苷酸被平方。然而，我们应该考虑到这样一个事实，即在我们使用的温和条件下，G残基被CMCT修饰得很差。使用M fold软件计算了0°C和3 M NaCl中每个干环结构的自由能。

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图4

西斯特A区可能的二维结构2的实验数据表示。

在模型2中，A区5′半部的重复序列与该区3′半部重复序列相互作用。酶解和化学修饰的表示如图2和​和3三.

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图5

西斯特A区可能的二维结构3的实验数据表示。

在模型3中，包含四个重复的两个干环结构被对应于poly-a和poly-U序列的小干环分开。酶解和化学修饰的表示如图2和​和3三.

A区5′部分（小鼠RNA中的318至521位）独立折叠的概念得到了该片段的M倍分析的支持，该分析确定了高度稳定的长不规则茎环结构SLS1M（ΔG=−41.96 kcal/mol（0°C，3 M NaCl），其中重复1与重复4相互作用，重复2与重复3相互作用。这是为这5′段提出的最稳定的热力学结构，无论实验数据是否作为M折搜索中的约束条件引入，都进行了预测。在SLS1M中，每个重复都会与另一个重复和间隔段相互作用，从而增加整体结构的稳定性。同样，对小鼠A区3′部分的M折叠分析表明，重复序列5与重复序列8和间隔区相互作用，重复序列6与重复序列7和间隔区交互作用。当实验数据被纳入约束条件时，通过M折预测得到的SLS3M结构是最有利的结构。总体预测的三干环结构（模型3）计算自由能较低（−77.76 kcal/mol），与模型1和模型2相比，更符合实验数据(图3和​和4），4)这表明，在众多可能性中，模型3是最可能的结构。

形成结构3的可能性被系统学保留

如果一个结构具有生物相关性，那么它在整个进化过程中通常是保守的。因此，我们测试了为小鼠A区确定的最有利结构是否与溶液中的人类A区相关。人类A区的序列与小鼠不同，因为存在额外的重复序列5，而没有长的中央多聚A区。实验数据(图6和​和77和图S3A–E）表明中央重复序列5形成中央干环结构（SLS2H）。基于此，可以为人类A区提出类似于小鼠模型2和模型3的结构，该区域涉及一个包含所有重复的长而不规则的干环结构（模型2）或一个具有重复1到4形成第一干环结构的三干环结构，重复5在第二干环中单独折叠（SLS2H）重复6至9，涉及第三干环结构（SLS3H）。至于小鼠A区：（i）探测数据不支持每个重复与其直接下游重复相互作用的2-D结构（模型1中分别为重复1、3、6和8以及重复2、4、7和9）（段688至696）(图S4); （ii）人类A区5′部分（位置370至530）的M倍分析（有或无实验数据作为约束条件）确定SLS1H为最稳定的结构（ΔG=−42.70 kcal/mol）(图7); （iii）当实验数据被添加为M折叠搜索的约束时，SLS3H被保留为A区域3′部分最稳定的结构；与其他二维模型相比，与模型3相对应的3个干环结构（ΔG=−86.6 kcal/mol）与探测数据最为吻合。我们观察到整个人类A区和分离的SLS1H部分的酶切模式相同，进一步支持了模型3(图6).

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图6

探索人类A区整体和5′半的二维结构。

图例如所示图1，但转录物分别对应于整个人类A重复区（人类A RNA）和人类A区域的5′半（SLS1H RNA）。

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图7

人类西斯特A区可能结构3的实验数据表示。

重复序列5位于一个短的中央干环结构中，两侧是两个较大的干环结构，每个结构包含四个重复序列。酶解和化学修饰的表示如图2和​和3。三识别DMS和/或CMCT修改的段的指示如所示图3用M fold软件计算了干环结构的自由能。

在哺乳动物A区进化过程中，间隔区和重复区之间保持相互作用意味着参与这些相互作用的核苷酸序列要么是保守的，要么是受到补偿碱基变化的影响。小鼠、人类、猩猩、狒狒、狐猴、狗、兔子、奶牛和大象A区序列的比对证实了这一点(图S5). 大多数重复序列的核苷酸序列保守性超出了重复序列本身，允许在所有已测序的Xist RNA中形成SLS1和SLS3结构(图S6).

FRET实验为模型3带来了更多数据

为了通过FRET实验测试模型3，保留了三个寡核苷酸对（P1–P5、P2–P4和P6–P7）(图8). 该模型预测，P1–P5和P2–P4对寡核苷酸与与重复序列1和4形成的螺旋相邻的单链片段相互作用，而P6–P7对寡核苷酸应与与重复片段5和8形成的螺旋相连的单链段相互作用。因此，如果如模型3中那样折叠A区，则预期这三个寡核苷酸对具有显著的FRET效应。另一方面，如果区域A像结构1或2那样折叠，则这三对寡核苷酸的荧光团之间的距离预计会大得多。虽然三级结构相互作用可能会缩短距离，但如果a区按照结构1或2折叠，则三对寡核苷酸的FRET水平仍会较低(图8). P1和P6寡核苷酸与结构2中重复序列1和8形成的螺旋侧面的两个单链片段结合。因此，如果A区域按照结构2折叠，则P1和P6的FRET效应将很强。当与A区结合时，寡核苷酸P7部分破坏由中心聚A延伸形成的碱基对相互作用。然而，由于三种可能结构的失稳程度相似，因此这种寡核苷酸的结合并不比其他两种结构更有利于一种结构。与聚A序列的伴侣U延伸结合的寡核苷酸P5也是如此。为了监测与螺旋相邻的寡核苷酸的FRET水平，我们使用了包含重复序列1和重复序列2的短R1–2转录本及其相邻序列，该转录本采用单一独特的二维结构和P1–P3′寡核苷酸对(图S7). 其他对照组利用了P3–P6和P3–P5对，这两对在三个拟建结构中都不太接近(图8). 使用的寡核苷酸对如所示图8，以及FRET实验中记录的P2–P4和P3–P6对的典型荧光强度光谱示例(图8D). P1/P5、P2/P4和P7/P6寡核苷酸对的FRET信号在50%的范围内较高，而P1-P6（35%），尤其是P3-P6和P3-P5寡核苷酸对（分别为25%和22%）FRET信号较低。这与大部分在溶液中折叠成结构3的分子相容。将大量分子折叠成结构2将导致P1–P6对的强FRET信号和其他五对的低FRET信号，这是未观察到的。P1/P5、P2/P4和P7/P6寡核苷酸对获得的强烈FRET效应强烈反对根据结构1折叠。根据FRET数据，我们得出结论，褶皱主要发生在模型3中。

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图8

稳态荧光研究为A区模型3提供了额外支持。

在（A、B和C）中，FRET实验中使用的寡核苷酸P1到P6的结合位点显示为对应于模型1、2和3的A区域的三个二维结构。每个寡核苷酸（供体Cy3或受体Cy5）中存在的发色团的身份分别用绿色和蓝色表示。Cy3-和Cy5-标记的寡核苷酸购自Eurogentec。如（D）所示，收集单独与RNA结合的供体寡核苷酸在530至745nm的发射荧光光谱（绿色曲线），以及在供体和受体寡核苷酸存在下获得的发射光谱（小提琴曲线）。溶液中未检测到Cy3-和Cy5-标记的寡核苷酸之间的能量转移。每对寡核苷酸的FRET效率定义为受体存在时，供体在564nm处的荧光降低。FRET分析的两个典型示例（寡核苷酸对P2/P4和P3/P6）如（D）所示。（E）中提供了六对寡核苷酸的FRET效率测量值（三个独立实验的平均值）。显示了标准偏差（σ）。每个寡核苷酸对获得的FRET的相对效率在（A、B和C）中用连接寡核苷酸的线表示。线条的厚度反映了FRET效应的效率。

区域二维结构的新概念

到目前为止，两台电脑[11]和实验分析[22]Xist RNA A区可能的2-D结构使个体重复序列成为折叠单位。然而，重复序列之间存在的长间隔序列表明，这些间隔序列可能参与了二维结构的形成，并指出了先前模型的潜在不足。我们对溶液中A区结构进行了详细的化学和酶法探测，包括设计用于逆转录酶延伸分析的特异性引物，使我们能够首次识别构成溶液中A区域结构的双链和单链片段。所获得的数据清楚地表明，重复序列本身不会折叠，而是一个与另一个折叠。

化学和酶法探测溶液中的RNA结构通常可以根据实验数据建立独特的二维结构模型。然而，由于高度的序列冗余，对A区的研究变得复杂。使用基于FRET分析的最近提议的生物物理方法[24]，通过提供不同重复序列两侧序列之间的相对距离信息，帮助克服了这些困难。据我们所知，到目前为止，该方法仅用于确认端粒酶RNA的二维结构模型[24]这种方法包括利用携带供体和受体荧光染料的寡核苷酸来补充所研究RNA中的单链片段，经证明特别适合研究A区，因为我们的探测数据确定了几个能够结合寡核苷酸探针的长单链片段。在A区可能的二维结构中，只有一个结构3与FRET数据完全一致。结构3包含两个长而不规则的干环结构，每个结构包含四个重复（四重复结构），也显示出与化学和酶数据的最佳一致性。这两个长干环结构被一个短干环结构隔开，对应于小鼠和人类Xist RNA之间的分歧区域。该片段中的一个重复对所有已测序的Xist RNA来说都是常见的(图S5)在后者中，它被一个poly-a序列取代，形成一个带有poly-U序列的短茎环。有趣的是，A区的核苷酸序列保守性延伸到间隔末端，这有助于形成四重复结构的可能性(图S5).

虽然大的内部和末端环的存在降低了干环结构的稳定性，但小鼠和人类RNA中两个四重复结构的预测自由能具有强烈的负值（介于−33和−45 kcal/mol之间），这解释了为什么M fold软件会提出这些结构。此外，这四个重复结构可以被稳定在赛璐珞中通过RNA与蛋白质的相互作用。有趣的是，蛋白PTB含有4个RNA识别基序（RRM），每个基序都能与UCUU（C）、UUCUCU或CUCUCU序列相互作用，在核提取物结合实验中显示出与A区的高亲和力(图9)[25]由于UCUU基序存在于四重复结构中的大内环和末端环的每一侧，人们可以想象单个PTB分子的RRM与这些不同片段的相互作用可以稳定四重复结构，正如先前提出的蛋白质PTB-RNA相互作用模型所建议的那样[26].

尽管与其他模型相比，模型3与所有数据的拟合度最高，但这并不排除SLS1和SLS3结构的小范围内出现局部动力的可能性。更准确地说，少数碱基对相互作用的不稳定性可以解释在a重复区的极少数片段中同时存在V1核糖核酸酶裂解和化学修饰。

四重复结构的可能功能含义

我们采用亲和纯化色谱法，最初用于纯化剪接体复合物[27]将A区不同片段与未分化小鼠ES细胞制备的核提取物孵育后形成的复合物，再结合质谱和Western blot分析，效果显著。结合对组装的RNP复合物进行的免疫选择分析，它揭示了PRC2复合物的四个成分与A区形成的四个重复结构之一对应的RNA相关联的能力。然而，我们观察到，Suz12蛋白的有效结合需要整个A区，这表明整个A区在结合Suz12或稳定Suz12与四重复结构的结合方面可能具有额外的功能作用。这还为时过早，无法对这一观察作出令人信服的分子解释。需要进一步的实验来理解为什么Suz12与PRC2复合体的其他成员相比显示不同的关联属性。

虽然使用整个A区对ES核提取物形成的RNP复合物进行UV交联已证实PTB与该RNA区直接结合，但未检测到PRC2复合物组分的直接结合（未公布数据）。Ezh2和Eed都不是，它们之前被提议由西斯特以依赖于A地区的方式招募[21]，被大量交联，表明它们与A区的关联是通过与其他核蛋白的关联介导的。因此，可能需要A区特有的SLS1和SLS3结构来招募与PRC2复合物成分具有亲和力的核蛋白，或增强这些成分的RNA亲和力。对整个A区形成的RNP复合物的质谱分析表明，除了PRC2复合物的成分外，还有大量其他核蛋白可以与该RNA区域相关。在进一步的研究中，重要的是确定PRC2结合需要哪些蛋白质，以及哪些蛋白质直接与A区结构结合。

我们的发现Suz12需要整个A区，或者更简单地说需要四个以上的重复序列才能与RNA有效结合，这与Wutz及其同事（2002年）的观察结果一致，即至少需要5.5个重复序列才能启动失活[11]对四重复模型的功能重要性的额外支持来自Wutz及其同事获得的数据的修改，他们测试了a区内的一系列突变对XCI启动的影响[11]我们的结构研究表明，Wutz等人分类为活性的所有变体（XR、XSR、XCR）都能形成四重复结构，而两个非活性变体（XS1和XNX）则不能(图S9).

尽管一些数据支持四个重复结构在a重复活性中的主要作用，但我们不能排除替代结构的可能作用，例如在调节a重复活性中。

RNA二级结构的酶和化学探测

溶液中的RNA 2-D结构探测如下[29]：200 ng以80 nM浓度溶解在缓冲液D（20 mM Hepes-KOH，pH 7.9，100 mM KCl，0.2 mM EDTA pH 8.0，0.5 mM DTT，0.5 mM-PMSF，20%（vol/vol）甘油）中的转录物在65°C下加热10 min进行复性，然后在室温下缓慢冷却，添加1µl 62.5 mM MgCl₂最终浓度为3.25 mM MgCl₂在室温下预孵育10分钟后，在使RNase T1（0.02或0.0375U/µl）或T2（0.025或0.0375U/µl）裂解单链片段的条件下加入RNase T1。V1核糖核酸酶（2.5×10⁻³或5×10⁻³U/µl）用于裂解双链和堆叠残留物。使用DMS（1µl 1/4或1/8（V/V）DMS/EtOH溶液）修饰单链a和C残基，使用CMCT（4或5µl 180 mg/ml溶液）修饰单链U残基，并在较低程度上修饰G残基。按照中所述停止反应[29].通过引物延伸确定裂解和改性位置[29]。使用8.1版Mfold软件确定了与实验数据最吻合的稳定二级结构[30]。在搜索中引入探测数据作为约束。

稳态荧光测量

在4°C下记录荧光光谱，激发波长为515 nm，扫描范围为500至750 nm（激发和发射带宽为3 nm）。使用的程序源自[24]将RNA和Cy3-寡核苷酸以1∶1摩尔比混合在160µl 150 mM NaCl和3.25 mM MgCl中₂和15 mM柠檬酸钠（pH 7.0）达到最终浓度（0.38µM），优于Kd，在85°C下培养5分钟，并在室温下缓慢冷却15分钟。在4°C下孵育4小时后，在非变性凝胶中通过电泳测定寡核苷酸结合的产量。使用台风（9410）医疗扫描仪测量凝胶中的荧光。当检测到令人满意的缔合产率时，在通量荧光光谱仪（SAFAS）上测量Cy3标记络合物的发射。对10个光谱进行平均。然后，以1∶1摩尔比添加Cy5标记的寡核苷酸，并在4°C下孵育4 h。记录了10个光谱，并考虑到Cy3寡核苷酸的结合/未结合比，计算了Cy3–Cy5对的荧光共振能量转移（FRET）。每个FRET实验使用不同批次的转录物重复三次。

利用MS2选择亲和力纯化RNP

将整个小鼠A区和几个片段克隆到T7启动子3′和质粒pAdML3中的MS2标签5′[27],[31].

未分化女性ES细胞（LF2）的核提取物根据[32]，并针对缓冲液D进行透析。如上所述，对100 pmol的MS2-tagged RNA进行变性、复性，并与5倍摩尔过量的纯化MS2-MBP融合蛋白孵育[31]将形成的RNA-MS2-MBP复合物与直链淀粉珠（40µl，GE Healthcare）在4°C的缓冲液D中平衡培养2小时。用500µl缓冲液D洗涤三次后，在150µl含有5µM酵母tRNAs的缓冲液D中添加1 mg核提取物。在4°C下持续搅拌培养15分钟后，在缓冲液D和RNP复合体中连续进行三次洗涤，通过用80µl含有10 mM麦芽糖的缓冲液D培养洗脱（4°C时30分钟）。用10%SDS-PAGE对整个A区形成的一半洗脱RNP复合物进行分离，以进行质谱分析。对于所有纯化的RNP复合物，10%的洗脱材料用于根据[33].

质谱分析

将SDS-PAGE的每条通道切成2 mm的切片，并将蛋白质提交凝胶内胰蛋白酶消化。根据标准协议，在与QTOF2质谱仪（Waters）耦合的CapLC毛细管液相色谱系统上，使用纳米LC-MS-MS对提取的肽进行分析(图S8). 使用MASCOT 2.2.0分析MS/MS数据。搜索由UniprotKB下载的Rattus和Mus蛋白质序列组成的内部生成的蛋白质数据库的算法（矩阵科学）网址：http://beta.uniprot.org/（2008年8月7日）和已知污染蛋白（如猪胰蛋白酶和人类角蛋白）的蛋白质序列与所有序列的反向拷贝连接。质谱和MS/MS数据的质谱公差为0.3 Da，允许胰蛋白酶和半胱氨酸的氨基甲酰化、蛋氨酸的氧化和指定为可变修饰的N-乙酰基蛋白最多1次缺失裂解。当一种肽的吉祥物离子得分高于35时，验证蛋白质鉴定。使用肽验证软件Scaffold（蛋白质组软件）进行评估。

感谢R.Lührmann教授（戈廷根马克斯普朗克研究所）慷慨捐赠质粒pMBP-MS2和pAdML3，以及在使用MS2-MBP-RNP纯化方法方面的帮助。感谢I.Motorine教授和C.Aigueperse教授（AREMS，Nancy）在植入这种方法方面的建议。感谢V.Ségault（AREMS，Nancy）就免疫净化分析提出的建议。感谢S Mazeres（IPBS，图卢兹）帮助我们定义FRET实验协议。