鲜血。 2009年12月17日； 114(26): 5315–5321.
淋巴瘤 BCL6通过抑制SYK磷酸酶PTPROt调节弥漫性大B细胞淋巴瘤的BCR信号通路 , 1 , 1 , 1 , 2 , 2 , 三 , 2 和 1 Przemyslaw Juszczynski公司 1 Dana-Farber癌症研究所，马萨诸塞州波士顿；
陈林峰 1 Dana-Farber癌症研究所，马萨诸塞州波士顿；
埃文·奥唐纳 1 马萨诸塞州波士顿Dana Farber癌症研究所；
何塞·M·波罗 2 纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院； 和
斯特拉·兰科洛 2 纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院； 和
里卡多·达拉·费弗拉 三 纽约哥伦比亚大学病理与遗传与发展系癌症遗传学研究所
阿里·梅尔尼克 2 纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院； 和
玛格丽特·希普 1 Dana-Farber癌症研究所，马萨诸塞州波士顿；
1 Dana-Farber癌症研究所，马萨诸塞州波士顿；
2 纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院； 和
三 纽约哥伦比亚大学病理与遗传与发展系癌症遗传学研究所
通讯作者。 2009年2月9日收到； 2009年9月26日接受。
补充资料 [补充数字]
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摘要 张力B细胞受体（BCR）信号传导是正常B细胞个体发生和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）亚群中的一个关键生存途径。 我们之前证明，BCR-依赖性DLBCL细胞系和原发肿瘤在使用BCR-相关脾酪氨酸激酶（SYK）的ATP-竞争性抑制剂治疗后发生凋亡。 这些“BCR型”肿瘤也有更丰富的转录阻遏物BCL6的表达，并增加了对BCL6抑制的敏感性。 在此，我们评估了BCL6介导的转录抑制和SYK依赖的BCR信号之间的潜在联系。 在转录分析的正常B细胞亚群（幼稚、生发中心和记忆B细胞）和原发性DLBCL中，BCL6和SYK酪氨酸磷酸酶PTPROt的表达模式相互交替。 BCL6通过与细胞内功能性BCL6结合位点的直接相互作用抑制PTPROt转录 PTPROt公司 发起人。 正常原始B细胞中BCL6的强制表达和生殖中心B细胞中RNAi介导的BCL6缺失直接调节PTPROt的表达。 在“BCR型”DLBCL中，BCL6缺失增加了PTPROt的表达，降低了SYK和下游衔接蛋白BLNK的磷酸化。 由于BCL6增强BCR信号传导，而BCL6和SYK在许多DLBCL中都是有希望的治疗靶点，因此对这些功能相关通路的联合抑制值得进一步研究。
介绍 新的数据强调了B细胞受体（BCR）介导的生存信号在B细胞淋巴瘤中的重要作用。 BCR参与诱导SRC家族激酶对Igα和β免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMS）的磷酸化，以及随后蛋白酪氨酸激酶（PTK）、SYK和下游途径的募集和激活。 1 —— 三 虽然BCR信号通常被认为是由抗原结合触发的，但最近的研究强调了在没有受体参与的情况下，“补品”BCR生存信号的作用。 例如，在小鼠模型中，BCR的诱导性丢失或IgαITAM的选择性切除导致外周B细胞死亡。 4 , 5
SYK-PTK在紧张BCR信号中起着核心作用，既传递下游事件，又放大原始信号。 2 , 三 , 6 , 7 SYK活性受到BCR-相关磷酸化和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）介导的抑制作用的严格调控。 8 我们最近发现，SYK是组织特异性和发育调控PTP（PTPROt）的主要底物。 6 PTPROt特异性抑制BCR触发的SYK酪氨酸磷酸化、相关衔接蛋白（如BLNK）的激活和下游信号事件。 6 在BCR依赖性淋巴瘤中，PTPROt过度表达降低了细胞增殖，并在没有BCR交联的情况下诱导了细胞凋亡，这表明磷酸酶调节SYK依赖性强直BCR信号。 6
PTPROt是PTPRO家族（也称为GLEPP、PTP-、PTP-OC和PTPu2）的成员，是一组高度保守的受体型PTP，具有单一催化域和跨膜区域，细胞外序列大小可变。 9 , 10 PTPRO包含一个延伸的胞外结构域，而PTPROt包含一个截短的胞外区域。 PTPROt 5′非翻译区也作为一个内含子，从较大的PTPRO cDNA中剪接出来。 11 这2种亚型具有组织特异性表达模式，PTPRO主要在上皮细胞中表达，PTPROt主要在B细胞和巨噬细胞中表达。 12 初步研究表明，PTPROt在正常生发中心（GC）B细胞和B细胞淋巴瘤的一个亚群中大量受发育调节和减少。 12
我们最近发现，弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的一个子集依赖于强直BCR信号作为生存机制，PTPROt调节这些肿瘤中SYK依赖的BCR信号。 6 , 13 依赖BCR信号的DLBCL具有显著的转录特征，BCR信号级联的多个成分表达增加，包括SYK本身。 13
这些“BCR-type”DLBCL还表现出BTB/POZ域转录抑制因子BCL6的表达增加，以及更频繁的 BCL6号机组 轨迹。 14 , 15 BCL6是正常GC发育所必需的，在正常GC B细胞中表达水平最高。 16 , 17 在以前的研究中，我们发现“BCR型”DLBCL表现出对BCL6靶基因的协同抑制，并增加了对BCL5抑制剂的敏感性。 15 由于DLBCL的相同转录定义子集依赖于SYK依赖的BCR信号，并表现出协调BCL6介导的转录抑制，因此我们探讨了这两个过程之间的关系。 在此，我们报道了BCL6调节PTPROt的表达和相关的SYK依赖性紧张性BCR信号传导。
方法 正常B细胞和肿瘤标本中BCL6和PTPRO的微阵列分析 两个先前描述的转录分析新诊断的DLBCL数据集，具有可用的综合簇和来源单元名称 14 , 18 和一系列额外的正常B细胞亚群（原始细胞、成中心细胞和记忆细胞） 18 , 19 用于评估BCL6和PTPROt转录物丰度。 通过磁性细胞分离（MidiMACS系统；Miltenyi Biotec）从正常人扁桃体中分离出一系列额外的高纯度正常B细胞亚群（幼稚、成中心细胞、中心细胞和记忆），并使用Affymetrix U133Plus平台进行轮廓分析，如前所述。 20 Affymetrix探针208121_s_at（PTPRO）、203140_at、215990_s_at和dChip 2007程序用于评估PTPROt和BCL6转录物丰度。
计算分析 PTPROt公司 启动子，生成 PTPROt公司 启动子构建和荧光素酶分析 计算分析 PTPROt公司 启动子是使用Genomatix套件的公开可用MatInspector模块执行的( 网址：http://www.genomatix.de ). 约1.6-kb的序列从先前确定的上游−1.1 kb到下游+0.5 kb PTPROt公司 对转录起始位点（TSS）进行了检测，确定了3个推测的BCL6结合位点。 要生成 PTPROt公司 启动子报告子构建，一个跨越核苷酸−1108到+381的片段被聚合酶链反应（PCR）扩增并克隆到无启动子pGL3荧光素酶载体（Promega）中。 按照制造商的建议，使用GeneTailor位点定向突变系统（Invitrogen）生成BCL6结合位点的缺失。 使用编码野生型蛋白（pMT2T-HA-BCL6）或缺乏N-末端POZ结构域或C-末端锌指的突变蛋白（分别为pMT2T-HA-BCL6-ZF和pMT2T-HA-BCL6-ΔZF）的BCL6构建体。 21
对于荧光素酶分析，HEK293T细胞保存在添加了10%胎牛血清（Cellgro Mediatech）、10mM HEPES缓冲液、4mM 我 -谷氨酰胺、50 U/mL青霉素和50 U/mL链霉素。 将HEK293T细胞接种在6孔板上，生长到60%至80%的融合率，并与350 ng/孔的适当启动子pGL3构建物（野生型或突变型PTPROt启动子构建物）、150 ng/孔对照报告质粒pRL-TK（Promega）、， 根据制造商的协议，使用FuGENE 6转染试剂（罗氏应用科学公司）构建5至100 ng野生型或100 ng突变型BCL6。 孵育24小时后，对细胞进行裂解，并使用双荧光素酶分析试剂盒（Promega）和Luminoskan Ascent光度计（Thermo Lab Systems）通过化学发光分析测定荧光素酶活性。 荧光素酶活性表示为3个实验加或减SD的平均值。
染色质免疫沉淀 DHL4、DHL6或K422细胞保存在添加10%胎牛血清（Cellgro Mediatech）、10 mM HEPES缓冲液、4 mM的RPMI1640培养基中 我 -谷氨酰胺、50 U/mL青霉素和50 U/mL链霉素。 染色质免疫沉淀（ChIP），25×10 6 在室温下，DHL4、DHL6或K422细胞在0.5%甲醛中固定10分钟。 反应随后在0.2 M甘氨酸中猝灭5分钟。 然后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，并在含有蛋白酶抑制剂（完整蛋白酶抑制剂混合物；罗氏应用科学）的RIPA裂解缓冲液（150 mM NaCl，1%NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]，50 mM Tris[pH8.0]，2 mM EDTA）中进行裂解和超声处理。 对裂解液进行预处理，然后与针对BCL6的兔抗血清（N3抗体；Santa Cruz生物技术）或正常兔IgG抗体（Santa Crux生物技术）孵育。 用用鲑鱼精子DNA（Abcam）预封闭的蛋白A/G Plus琼脂糖捕获免疫复合物，并用RIPA缓冲液洗涤3次，用最终的ChIP洗涤缓冲液洗涤一次（1%NP40，0.1%SDS，500 mM NaCl，2 mM EDTA，pH 8.0，20 mM Tris-HCl，pH 8.0，含蛋白酶抑制剂）。 然后，用1%SDS在100 mM NaHCO中洗脱免疫复合物 三 并通过在65°C下培养样品4小时来逆转交联。 然后在45°C下用蛋白酶K消化样品1小时。 通过标准酚-氯仿提取和乙醇沉淀回收富含ChIP的DNA片段，并使用PTPROt启动子和控制区引物（F1:ACAGGCAGGTTTTTGGTCT；R1:TCGTAAAGAGATGTGTCTG；F2:CTCCACCTTTTAAGTGCAGATTTTT；R2:ACTGAGTTGCCCTG ATA； F3:tgactttgctgggggtggaa，R3:TGGTTTTCTGACTGGAGCCAA； 续1:TGGCTTCACTCCTCCTACC； 联系人1:CTGGGTTGTTGCTGGTGAAA； 续2：TGATGGAAAGGCATCAGTCTG； contR2:AGACCCAGAGAGAGATAATCCAAA）、PowerSYBR绿色套件（应用生物系统）和ABI 7700热循环器（应用生物系）。 使用2 −（ΔCT BCL6−ΔCT IgG） 方法。 根据三次ΔΔ阈值循环（CT）值计算标准偏差。
BCL6介导的PTPROt在正常扁桃体原始B细胞和成中心细胞中的阻遏作用分析 如前所述，通过MidiMACS系统（Miltenyi Biotec）进行磁性细胞分离，从人类扁桃体中获得正常的原始B细胞和成中心细胞。 20 如前所述，通过用表达BCL6的FUGW慢病毒载体（Addgene）或仅eGFP的对照感染细胞，可以在原始B细胞中表达BCL5构建物。 20 对于中心成纤维细胞中BCL6的敲除，使用克隆到pFIV-H1-copGFP载体中的BCL6特异性或阴性对照“扰乱”shRNA。 20 48小时后，用TRIzol（Invitrogen）制备总RNA，并用Superscript III第一链cDNA合成试剂盒（Invit罗gen）反转录到cDNA。 使用以下引物和5′-FAM标记的MGB探针，通过定量5′核酸酶分析PCR评估PTPROt转录物丰度：正向：ACTTGTTTGCTCAGAACCAG； 背面：AGAAAACAGCAA CTGGTTCCTGAAG； 探头：CACTCTCGCAGTGAAC。 PCR使用ABI 7700热循环器（Applied Biosystems）进行，CT值使用序列检测软件1.2版（AppliedBiosystes）生成。 使用2 −（ΔCT PTPROt−ΔCT PPIA1） 方法。 根据三份ΔΔCT值计算标准偏差。 对于绝对mRNA拷贝数定量，PCR是用含有PCR目标序列的质粒DNA的连续稀释液进行的。 根据对数（质粒拷贝数）绘制系列稀释液的CT值，以生成前面所述的标准曲线。 22 使用RT-PCR（PowerSYBR Green试剂盒）和以下引物评估对照BCL6靶基因FCER2相对于GAPDH的表达：FCER2，F:ATGAATCCTCCAAGCAGGAG； FCER2，R:GACTTGAAGCTGCTCAGACTGCT； GAPDH，F:GATTCCACCATGGCAAATTC； GAPDH，R:TGATTTGGAGGATCTCTCC公司。
RNA干扰介导的BCL6敲除 BCL6特异性onTARGET+siRNA和阴性对照加扰（SCR）寡核苷酸（CCUCCAUAUCCGCGUCU）从Thermo Scientific获得。 寡核苷酸在50μM的无RNA酶水中重新悬浮，并储存在−70°C。 对于siRNA核感染，4×10 6 DHL4或K422细胞再次悬浮在含有75 pmoles BCL6或SCR寡核苷酸的100μL AMAXA核感染液V中，并在nucleofector II设备（AMAXA）中用O-017程序处理。 Cy3-标记的GAPDH寡核苷酸（Applied Biosystems/Ambion）的核感染和随后的流式细胞术分析证实其转导效率超过90%。 核感染后，细胞孵育72小时，用于磷特异性流式细胞术或制备全细胞提取物用于免疫印迹或免疫沉淀。
免疫沉淀和免疫印迹 先前描述的Tet-inducible Flag-tagged野生型（WT）或突变型（CS）PTPROt克隆在含或不含多西环素的情况下培养，血清饥饿，然后用山羊抗人IgG（10μg/mL）刺激10分钟或不治疗。 6 在NP40裂解缓冲液（1%NP-40、50 mM Tris-HCl[pH7.4]、150 mM NaCl和2 mM Na）中裂解细胞 三 VO（旁白） 4 )含有蛋白酶抑制剂。 离心后，将上清液与2μg/mL的α-SYK（4D10）或α-CD79a抗体（Santa Cruz Biotechnology）在4°C下旋转孵育1小时。 此后，添加50μL蛋白G–Sepharose珠（裂解缓冲液中50%的浆液），并将样品额外旋转1小时。 然后通过离心回收免疫复合物，用冷裂解缓冲液洗涤，在样品缓冲液中重新悬浮，在95°C下煮沸10分钟，用PAGE进行粒径分馏，并转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore Corp）。 印迹首先在封闭缓冲液（5%牛奶，0.1%吐温，PBS）中培养30分钟，然后在4°C下与针对SYK Y352[BD Biosciences]、Y525/526、Y323[Cell Signaling]或抗泛磷酸酪氨酸4G10抗体[Upstate]的磷酸特异性抗体培养过夜。 在用0.1%吐温/PBS连续清洗后，用辣根过氧化物酶标记的二级抗体在室温下孵育印迹1小时，通过增强化学发光（Western Lighting Plus-ECL；PerkinElmer）显影，并用柯达Biomax胶片（Carestream Health Inc）进行可视化。 为了用另一种抗体进行复制，在50℃下剥离印迹（0.063 M Tris-HCl[pH6.8]，2%SDS，0.026 M DTT）30分钟，清洗，并用α-SYK和α-Flag抗体进行分析。 使用ChemiImager 4400软件（Alpha Innotech）对显影胶片进行密度分析。
通过在RIPA裂解缓冲液中直接裂解细胞来获得来自BCL6 siRNA转导的细胞的全细胞提取物。 对于免疫沉淀，首先将细胞悬浮在含有1%FCS的150μL PBS中，不处理或在37°C下用山羊抗人IgG刺激1分钟。 细胞悬液立即在150μL的2×NP40裂解缓冲液（2%NP-40，100 mM Tris-HCl[PH7.4]，300 mM NaCl，4 mM Na）中进行裂解 三 VO（旁白） 4 用蛋白酶抑制剂）和α-SYK进行免疫沉淀。 在NuPAGE Novex 4%至12%Bis-Tris Gels（Invitrogen）上对裂解液或免疫沉淀物进行分级，并转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore）上。 在室温下，用一级抗体（αBCL6、αSYK、αBLNK、αCD79a[Santa Cruz Biotechnology]和α-βactin[Sigma-Aldrich]）在封闭缓冲液中培养印迹2小时。 对于磷酸特异性SYK Y352，在4°C下培养杂交过夜。 洗净印迹，用适当的辣根过氧化物酶标记的二级抗体孵育，培养并观察。
RNA干扰介导的PTPROt敲除 使用GeneScript RNAi选择算法设计PTPRO特异性siRNA 23 ( https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai网址 )由Integrated DNA Technologies（IDT Inc）合成为单链DNA寡核苷酸并进行退火。 PTPRO特异性寡核苷酸（GATCCGGACTTTGATGCCTCTATTCAGAGATATGCATCAAAGTCATCATCCTTTTG）或SCR寡核苷酸 24 连接到线性化pSIREN--RetroQ逆转录病毒载体（Clontech）。 如前所述，生成重组逆转录病毒并感染DHL4细胞。 22 感染后，对细胞进行嘌呤霉素选择（0.5μg/mL）并通过限制稀释进行亚克隆。 此后，对从选定的亚克隆中提取的RNA进行逆转录，并通过定量RT-PCR确认PTPROt的缺失。 随后将PTPROt缺失的亚克隆（PTPROt表达减少90%）和SCR对照克隆用于磷酸特异性流式细胞术。
磷特异性流式细胞术 如前所述进行细胞内磷酸特异性流式细胞术 13 根据制造商的说明。 简言之，2×10 6 将细胞重新悬浮在1mL冷PBS加1%FCS中，不处理或在37°C下用山羊抗人IgG刺激1分钟。 此后，将细胞固定、渗透并用藻红蛋白结合的α-pSYK（pY352）、藻红蛋白连接的α-pBLNK（pY84；BD Biosciences）或同种对照抗体染色。 使用FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences）进行流式细胞术分析。
结果 正常B细胞和原代DLBCL中PTPROt和BCL6表达的相互模式 我们之前发现，PTPROt蛋白在正常GC B细胞中的含量低于原始或记忆B细胞。 12 由于BCL6在正常GC B细胞中的表达最高，我们首先通过转录谱分析比较了PTPROt和BCL6的相对表达在2个独立系列的高纯度原始GC和记忆B细胞中( A） ●●●●。 PTPROt转录物在正常幼稚和记忆B细胞中的含量明显高于GC B细胞，而BCL6在正常GC B细胞中表达最高( A） ●●●●。 此外，BCL6和PTPROt在2个独立的大系列原发性DLBCL中的表达存在互惠模式( B和补充图1）。 值得注意的是，超过78%具有高BCL6和低PTPROt转录水平的原发性DLBCL先前被鉴定为“BCR型”肿瘤( B、 χ 2 测试， P（P） < .001).
正常B细胞和原代DLBCL中PTPROt和BCL6表达的相互模式 （A）2个独立系列的高度纯化的正常B细胞（幼稚的GC成中心细胞[CB]和中心细胞[CC]，记忆）中的相对BCL6和PTPROt转录物丰度。 （B） 176例新诊断和先前分析的DLBCL中BCL6和PTPROt转录物的相对丰度。 14 正常GC B细胞 14 包括时间进行比较（左）。 主DLBCL和正常GC单元的综合集群名称显示在热图上方。 主要DLBCL系列包括77个BCR、50个OxPhos和49个HR肿瘤。 底部的色标表示相对表达式和平均值的SD。 红色意味着高级表达； 蓝色表示低级表达
PTPROt公司 是BCL6靶基因 正常B细胞和原发性DLBCL中BCL6和PTPROt表达的相互模式以及BCL6-high/PTPROt-low“BCR-type”DLBCL的鉴定提出了以下可能性： PTPROt公司 是BCL6的靶基因。 出于这些原因，我们检查了 PTPROt公司 BCL6结合位点的调控区域。 1.5-kb PTPROt公司 启动子区域，包括先前确定的TSS和TATA盒， 11 , 12 包括3个候选BCL6结合位点（−763到−746；−124到−107；以及TSS的+300到+317 nt）。 值得注意的是，2个上游候选BCL6结合位点（−763到−746和−124到−107）位于 PTPROt公司 与受抑制的基础转录活性相关的启动子。 11
为了评估候选BCL6结合位点的功能状态，我们生成了一个荧光素酶载体，该载体由 PTPROt公司 启动子（pGL3-Luc-PTPROt-1108+381）。 该PTPROt-荧光素酶构建物与编码WT BCL6或2个非活性BCL6突变体中的1个、BCL6-ZF或BCL6-ΔZF的载体共同转染到HEK293T细胞（分别缺少氨基末端转录抑制区或羧基末端DNA-结合锌指序列）。 WT BCL6被抑制 PTPROt公司 启动子驱动荧光素酶活性的剂量依赖性( A） ； 与之形成鲜明对比的是，无活性BCL6突变体均未降低PTPROt报告基因的表达( B） ●●●●。
PTPROt转录受BCL6调节 （A）BCL6以剂量依赖的方式抑制PTPROt启动子驱动的转录； 将350 ng PTPROt启动子荧光素酶报告子构建物（pGL3-Luc-PTPROt−1108+381）与空载体或增加剂量（5-100 ng）的BCL6表达载体（pMT2T-HA-BCL6）共同转染到HEK293T细胞中。 如前所述评估荧光素酶活性（见“荧光素酶分析”）。 （B） WT-BCL6而非BCL6突变体抑制PTPROt启动子驱动的转录。 pGL3-Luc-PTPROt-1103+381与编码HA-BCL6或2个BCL6突变体中的1个突变体的100 ng载体共转染，缺失氨基末端转录抑制域（BCL6-ZF）或羧基末端DNA结合锌指结构域（BCL-6-ΔZF），随后测定荧光素酶活性。 在面板A和B中，来自3个独立实验的代表性荧光素酶活性被归一化为Renilla荧光素酶活性，并表示为折叠变化±SD。
接下来我们询问内源性BCL6是否结合 PTPROt公司 用染色质免疫沉淀法测定体内启动子区。 在2个“BCR型”DLBCL细胞系（DHL4和DHL6）中，DNA片段（包括预测的BCL6结合位点，但不包括2个上游/下游对照片段）在α-BCL6染色质免疫沉淀物中显著富集( A） ●●●●。 这些数据表明，体内每个已识别的结合位点都被BCL6占据( A） ●●●●。 与这些观察结果一致，每个预测的BCL6结合位点的个体突变都降低了BCL6介导的PTPROt抑制，并且所有3个BCL6的结合位点的联合突变都在 PTPROt公司 启动子取消了对BCL6的反应( B） ●●●●。 综上所述，这些结果表明BCL6抑制 PTPROt公司 启动子在“BCR-type”DLBCL细胞系DHL4和DHL6中，并且该功能需要确定的BCL6结合位点。 相反，BCL6不绑定 PTPROt公司 染色质免疫沉淀分析中非BCR型DLBCL细胞系K422的启动子区域（参见补充图2）。
BCL6通过与 PTPROt公司 启动子区 .（A）BCL6绑定到 PTPROt公司 体内启动子。 以BCL6抗体或正常IgG为对照，对2株DLBCL细胞系（DHL4和DHL6）进行染色质免疫沉淀。 中的目标放大器 PTPROt公司 启动子包括3个预测的BCL6结合位点（BS1-3，■）和2个远端上游或下游控制区（C1和C2，□）。计算每个区域的BCL6/IgG比值，并将其归一化为控制区1。 （B） BCL6介导的抑制 PTPROt公司 启动子需要完整的BCL6结合位点。 PTPROt-启动子驱动的荧光素酶构建物在预测的BCL6结合位点中有或无单独或联合突变，与pMT2T-HA-BCL6共同转染到HEK293T细胞中。 随后测定荧光素酶活性。
BCL6调节正常B细胞和DLBCL中PTPROt的表达 鉴于BCL6和PTPROt在正常B细胞中的相互、发育调节表达模式，我们接下来询问PTPROt是否是高纯度原始B细胞和GC中心体中BCL6的生理转录靶点。 在用BCL6慢病毒载体转导幼稚B细胞和用BCL6 shRNA构建体转导成中心细胞后，我们通过RT-PCR评估PTPROt的表达( A） ●●●●。 在原始B细胞中，BCL6的强制过表达显著降低了PTPROt转录丰度( 左侧面板）。 相反，BCL6缺失增加了正常中央粒细胞中PTPROt的表达( 右侧面板）。
BCL6调节正常原始B细胞、GC成中心细胞和某些DLBCL中PTPROt的表达 .（A）正常B细胞。 用eGFP-BCL6构建物或空载体转染正常的原始B细胞（左），用BCL6-shRNA慢病毒载体或打乱对照转染GC成中心细胞（右）。 （B） DLBCL。 用BCL6 siRNA转导DLBCL细胞系（DHL4）。在正常B细胞（A）和DLBCL电池系（B）中，用Western blot（顶面板）检测BCL6蛋白水平，用RT-PCR（底面板）检测PTPROt表达。 在DLBCL中，还评估了总SYK、上游BCR通路成分CD79a和下游适配蛋白BLNK的表达水平。 误差条表示代表性实验中每个条件和细胞类型的3个独立RT-PCR分析的平均值中的SD。
在证明PTPROt是正常B细胞中BCL6的生理靶标后( A） ，我们询问BCL6是否调节代表性BCR型DLBCL细胞系中PTPROt的表达( B） ●●●●。 在BCL6 siRNA增加已知BCL6靶点FCER2丰度的条件下（数据未显示），BCL6缺失使PTPROt转录物丰度增加10倍( A） ●●●●。 值得注意的是，BCL6缺失并没有改变总SYK、上游BCR通路成分（如CD79a）或下游适配器蛋白（如BLNK）的表达。 在非BCR型细胞系K422中，BCL6缺失并未上调PTPROt表达（参见补充图2B）。 这些数据表明，BCL6调节正常B细胞和某些DLBCL中PTPROt的表达。
PTPROt脱磷SYK Y352 SYK活化需要LYN介导连接子区域SYK Y352和Y348的磷酸化，然后在催化域SYK Y525/526的自磷酸化。 随后SYK Y323的磷酸化导致Cbl介导的SYK泛素化和降解。 为了鉴定PTPROt SYK酪氨酸底物，我们在DLBCL细胞中过度表达标记的WT或CS突变体PTPROt，交联BCR 5分钟，并比较BCR在SYK Y352、Y525/526和Y323诱导的磷酸化( A） ●●●●。 在这个早期点，SYK Y352磷酸化被WT-PTPROt的过度表达特异性抑制，但不被非活性CS-PTPROt突变体抑制( A和补充图3A）。 在相同的实验中，WT-PTPROt过度表达并没有改变上游BCR通路成分的磷酸化，如CD79a（Igα； 底部面板）。
PTPROt过度表达抑制SYK Y352酪氨酸磷酸化 Tet-inducible Flag-tagged WT或突变体（CS）PTPROt克隆在有或无Dox的情况下培养，并用山羊抗人IgG刺激5分钟（A）、15分钟（B）或不处理。 随后，用抗SYK或抗CD79a抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀。 对免疫沉淀物进行分级、印迹，并用指示的磷酸酪氨酸抗体（分别为抗pSYK352、-pSYK525/526、-pSYK323和4G10）进行分析。 随后剥离印迹并用抗泛SYK或抗CD79a抗体进行印迹。 在每个实验中，同时对相应的全细胞裂解物进行大小分级、印迹和Flag抗体分析，以确认Dox诱导的WT-PTPROt或CS-PTPROt过度表达。
为了评估PTPROt对SYK Y525/526和Y323随后磷酸化的影响，我们在BCR交联15分钟后进行了相同的实验( B和补充图3B）。 在稍后的时间点，当检测到所有3个SYK酪氨酸残基的磷酸化时，WT-PTPROt而非CS-PTPROt的过度表达抑制了SYK Y352、Y525/526和Y323的磷酸化( B和补充图3B）。 综上所述，这些结果表明PTPROt使SYK Y352去磷酸化，限制了随后SYK Y525/526的自磷酸化和活化。 与这些观察结果一致，与模拟转染细胞相比，DHL4细胞中shRNA-介导的PTPROt下调与显著升高的SYK Y352和BLNK Y84磷酸化相关（参见补充图4）。 鉴于PTPROt的基线表达极低，这些结果进一步强调了这种磷酸酶在调节紧张性和免疫球蛋白交联相关BCR信号中的作用（参见补充图4）。
BCL6介导的PTPROt抑制增加SYK Y352磷酸化并促进BCR信号传导 在证明PTPROt能去磷酸化SYK Y352后，我们评估了BCL6缺失对典型BCR DLBCL细胞系（DHL4）中SYK磷酸化和强直BCR信号的影响。 DLBCL系用BCL6-siRNA或加扰对照转导； 然后，用pan SYK抗体对细胞进行裂解、免疫沉淀，并用抗磷SYK Y352抗体进行免疫印迹。 BCL6缺失细胞中SYK磷酸化水平明显低于亲代或模拟转导细胞( A） ●●●●。 接下来，我们使用单细胞磷酸化特异性流式细胞术来专门评估BCL6敲除后SYK Y352的磷酸化和BCR信号。 BCL6缺失细胞中SYK Y352的补体和BCR交联相关磷酸化远低于对照细胞和亲代细胞( B） ●●●●。 相关衔接蛋白BLNK的磷酸化在缺乏BCL6的细胞中也同样降低，但在对照细胞或亲代细胞中没有降低( B） ●●●●。 综上所述，这些数据证实BCL6通过抑制SYK磷酸酶PTPROt来调节BCR通路的强直和BCR-交联诱导的信号传导( —— ).
BCL6介导的PTPROt抑制增加紧张性BCR信号 DLBCL细胞系DHL4被BCL6-siRNA、SCR对照寡核苷酸转导，或未经处理。 随后将细胞培养72小时，并用山羊抗人IgG（10μg/mL）刺激1分钟或不处理。 （A） BCL6缺失后SYK磷酸化的西方分析。 BCR-交联细胞被裂解并用抗SYK免疫沉淀。 免疫沉淀物进行分级、印迹，然后用α-pSYK Y352抗体进行分析。 随后将膜剥离并用抗泛SYK抗体进行印迹。 （B） BCL6缺失后补体和α-Ig诱导的SYK Y352和BLNK Y84磷酸化的磷酸特异性流式细胞术分析。 在BCL6-siRNA（红色）、SCR控制寡核苷酸（蓝色）或未经处理（绿色）的BCR交联缺失（左侧面板）或存在（右侧面板）的情况下，比较转导细胞中的SYK Y352和BLNK Y84磷酸化（顶部和底部面板）。 用同型匹配的对照Ig染色的细胞也显示出来（灰色虚线）。 x轴表示表达式（对数刻度），y轴表示单元数。
讨论 在此，我们证明了BCL6和SYK磷酸酶PTPROt在正常B细胞和BCL6依赖性DLBCL中的表达模式是相互作用的。 此外，我们还表明BCL6绑定到 PTPROt公司 启动子并抑制PTPROt转录。 BCL6的强制表达降低了原始B细胞中PTPROt的表达，而BCL6缺失增加了正常成中心细胞和某些DLBCL中PTPROt的表达。 与这些观察结果一致，BCL6介导的PTPROt抑制导致SYK磷酸化增加，增强补体和配体依赖性BCR信号。
补体BCR信号被认为是由细胞膜脂筏内PTK和PTP之间的随机相互作用启动和调节的。 在这个稳态平衡模型中， 2 正调控因子与BCR复合体瞬时随机相互作用，激活受体相关的PTK，如SYK。 这种积极的PTK相关监管机制被PTP（如PTPROt）的招募所抵消。 PTP依赖性负调控臂的抑制稳定并增强紧张性BCR信号。 PTPs在调节紧张性BCR信号传导中的作用最初是由一些研究提出的，在这些研究中，BCR近端PTKs通过磷酸酶抑制剂渗透酸/H的处理被激活 2 O（运行） 2 在没有BCR交联的情况下。 2 , 三 , 7 , 25 目前的研究确定BCL6介导的PTPROt抑制是增强SYK依赖性强直BCR信号的一种机制。
PTPROt是PTPRO家族的一个组织特异性和发育调控成员，PTPRO是一组高度保守的受体型PTP，被认为具有抑癌作用。 上皮亚型PTPRO与肺癌和肝癌有关。 26 , 27 在这些癌症的模型系统中，PTPRO抑制凤尾鱼非依赖性生长，延迟细胞周期重入，并增加对凋亡的敏感性。 26 , 27 长 PTPRO公司 短PTPROt亚型由2个不同的启动子表达。 11 这个 PTPRO公司 启动子，位于 PTPROt公司 监管区域，包括一个CpG岛。 这一特征值得注意，因为上皮性肿瘤中PTPRO的表达减少与肿瘤特异性高甲基化 PTPRO公司 CpG岛。 26 , 27 因为 PTPROt公司 该启动子不包含可比较的CpG富集区，其他机制可能控制PTPROt的表达。
在正常GC B细胞中，PTPROt被BCL6抑制，BCL6是一种序列特异性转录阻遏物，起GC反应的主调节器的作用。 28 BCL6抑制PTPROt的发现确定了BCL6在正常GC B细胞中的一种新功能。 在GC内，成中心细胞迅速增殖并经历其免疫球蛋白基因的体细胞超突变，这是抗体亲和力成熟的基础。 16 , 28 BCL6介导的对SYK磷酸酶PTPROt的抑制可能会降低GC B细胞中低亲和力BCR的补体和配体诱导信号的阈值，从而促进其存活。 一旦产生高亲和力BCR，增强的配体诱导的BCR信号通过BCL6 PEST结构域的MAPK依赖性磷酸化和相关的蛋白酶体降解促进BCL6下调，从而使其退出GC。 29
BCL6对BCR信号的严格时空控制可能在BCL6表达解除的DLBCL中发生改变。 在某些DLBCL中，BCL6的组成性表达抑制PTPROt并增强依赖SYK的BCR信号。 这些观察结果确定了B细胞淋巴瘤中一种新的BCL6依赖性生存途径。 由于BCL6和SYK在同一组DLBCL中都是有希望的合理治疗靶点，因此对这些功能相关通路的联合抑制值得进一步研究。
确认 本论文由美国国立卫生研究院拨款5 PO1 CA092625和LLS SCOR拨款7391-07资助。
脚注
本文的在线版本包含数据补充。
这篇文章的出版费用部分由版面费支付。 因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者 贡献：P.J.设计并执行了研究，分析了数据，并撰写了论文； L.C.设计并执行研究； 执行研究的首席执行官； J.M.P.设计并执行研究和分析数据； S.M.R.设计并执行研究； R.D.F.提供了重要的新试剂或分析工具和分析数据； A.M.设计研究和分析数据； M.A.S.设计了研究，分析了数据，并撰写了论文。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通信：马萨诸塞州波士顿宾尼街44号达纳-法伯癌症研究所Margaret A.Shipp，邮编02115； 电子邮件： ude.dravrah.icfd@ppihs_teragram .
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