雄激素通过Caspase-3依赖性激活蛋白激酶Cδ诱导多巴胺能神经毒性

摘要

最近的研究报告了某些神经退行性疾病患病率的性别差异(1,2)例如帕金森氏病（PD）。老年男性帕金森病的发病率高于老年女性(三,4,5,6,7). PD的临床特征包括运动障碍，如震颤僵硬和运动迟缓(8,9,10,11). PD的主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺神经元的丢失(8,9,11,12,13).

氧化应激参与介导PD中多巴胺神经元的这种丢失(6,7,11,14,15). 此外，PD的动物模型表明，氧化应激导致凋亡途径的启动(16,17,18,19). 两种PD动物模型都发现中脑多巴胺受体缺失(20)和用雄激素治疗的动物(21). 因此，睾酮可能在PD的进展中发挥作用。以前的报道表明，睾酮可以增加细胞凋亡(22,23,24). 然而，睾酮在帕金森病多巴胺神经元死亡中的作用尚未得到研究。

细胞凋亡是一种受控制的细胞死亡(25,26)以细胞收缩、DNA断裂和染色质浓缩为特征(27,28,29). 细胞凋亡与半胱氨酸蛋白酶caspase家族的细胞激活有关(25,26). Caspase-3介导细胞凋亡周期的执行阶段(28,30,31,32,33). caspase-3激活后，蛋白激酶C（PKC）-δ被蛋白质水解裂解，导致其在胞浆内激活，随后细胞死亡(32,34,35). 一些研究报告称，PKCδ对caspase-3的激活产生正反馈，从而诱导进一步的细胞凋亡(36,37,38). PKCδ在PD动物模型中也被证明是细胞凋亡的介体(36,39). 一些研究报告称PKCδ对氧化应激和睾酮都有反应(37,38,40,41). 据报道，多巴胺能N27细胞系中存在通过激活caspase-3对过氧化氢等氧化应激反应而增加的凋亡(7). LNCaP前列腺细胞中睾酮水平与PKCδ水平呈正相关(41). 睾酮直接调节PKCδ表达的可能性进一步得到了睾酮激素反应元件的支持，该元件位于PKCδ启动子区转录起始位点上游4.7 kb(41).

值得注意的是，尚未在多巴胺能细胞系中研究雄激素及其对氧化应激的影响。因此，本研究的目的是研究雄激素在PD中的作用，以N27细胞为模型，测试这些激素对多巴胺神经元的神经毒性作用。此外，为了确定雄激素诱导神经毒性的特异性，纳入了非多巴胺能细胞系GT1-7。

材料和方法

细胞培养

本研究中使用了两种细胞系：N27和GT1-7。GT1-7(42,43,44,45)和N27细胞系（图1A​1A）)表达雄激素受体。N27细胞系（科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学健康科学中心Curt Freed博士捐赠）由来自12天大鼠胎儿中脑组织的酪氨酸羟化酶永生化细胞组成，这些细胞产生多巴胺及其代谢物。这些细胞表达多巴胺转运体、PKC亚型和肾上腺素受体(46). 然而，它们不表达多巴胺D1受体(46)与成熟的黑质多巴胺神经元相一致(47,48). 此外，在单侧6-羟基多巴胺损伤大鼠中，移植的N27细胞已被证明能显著降低甲基苯丙胺诱导的旋转速率(46). 这种细胞系以前曾被用作研究神经毒性的模型(36,49,50). 细胞保存在添加10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）的RPMI 1640培养基中；在37℃、5%CO中生长₂孵化器；每周传代一次。所有实验在第12代和第19代之间进行，在RPMI 1640无血清培养基中以大约80%的融合度进行，以避免混淆变量（血清中的激素含量）。由于培养基富含葡萄糖、氨基酸和必要的营养素，血清的去除不会导致禁食或剥夺状态(51). 使用碘化丙啶荧光（一种细胞死亡的测量方法），在无血清培养基中暴露1小时和48小时之间，死亡细胞的百分比没有发现显著差异（分别为0.163±0.083和0.121±0.113%）。这些细胞在无血清环境中继续增殖（坎宁安，R.L.，未发表的观察结果）。

在单独的窗口中打开

图1

雄激素通过经典雄激素受体诱导N27细胞凋亡。N27细胞表达雄激素受体。睾丸匀浆用作阳性对照（A）。使用Hoechst 33342检测细胞凋亡。N27细胞用溶媒对照（n=5）、睾酮（100n）处理米，n=4），氟他胺（500 n米，n=3），氟他胺+睾酮（n=3米，n=4）或T-BSA（100 n米; n=3）。用荧光显微镜观察细胞核染色。凋亡细胞通过存在亮蓝色核（B） 。从每个独立实验的每个室10个随机场中对凋亡细胞核进行量化。数据表示为凋亡细胞的平均百分比±扫描电镜（C） ●●●●。与对照组相比，睾酮和DHT均显著增加N27细胞的凋亡，P（P）< 0.05. T-BSA不增加细胞凋亡。雄激素受体拮抗剂氟他胺抑制睾酮诱导的细胞凋亡。方差分析之后是学生的PLSD事后（post-hoc）测试。比例尺, 200 μ米.箭头表示凋亡细胞。

下丘脑GnRH GT1-7细胞系是Lu Xin-Yun博士（德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心）赠送的礼物。该细胞系保存在补充有10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）的DMEM/F12培养基中，在37℃、5%的CO中生长₂培养箱和每周传代培养。实验在无血清培养基中进行。

结果

睾酮增加N27细胞线粒体功能障碍

以前的研究表明线粒体功能障碍促进多巴胺细胞的神经毒性(63,64,65). 通过测量还原巯基水平和过氧化物水平来检查线粒体功能障碍。睾酮暴露显著增加过氧化物水平（图2A​2安）)并显著减少了还原硫醇的数量（图2B​2B）)多巴胺能神经元与载体对照组比较。过氧化物酶原-3（一种针对过氧化物的线粒体抗氧化剂）的蛋白质表达也因睾酮暴露而显著增加（图2C​2C）。). 雄激素受体拮抗剂氟他胺和抗氧化剂NAC阻断雄激素诱导的氧化应激（图2B​2B型).

在单独的窗口中打开

图2

睾酮诱导的线粒体功能障碍。在五个独立的实验中，使用普通还原硫醇的荧光探针分析还原硫醇水平，并使用比色试剂盒分析过氧化物。用睾酮或载体对照物处理N27细胞48 h。睾酮（100 n）米)过氧化物浓度显著增加（*，P（P）<0.05），而10 n米睾酮没有影响（A）。睾酮（100 n米)与对照组相比，还原性硫醇显著减少（*，P（P）< 0.05). 抗氧化剂NAC和雄激素受体拮抗剂氟他胺（B）都能显著阻断睾酮对还原巯基的作用。为了定位增加的过氧化物自由基，在三个独立的实验中分析了蛋白质过氧化物酶体脱氧素-3（PRDX3）的蛋白质印迹分析，PRDX3是一种对过氧化物自由基具有特异性的线粒体抗氧化剂，以定位增加的过氧化物自由基。睾酮显著增加了PRDX3的表达（*，P（P）<0.05）（C）。方差分析之后是学生的PLSD事后（post-hoc）测试。

睾酮激活PKCδ凋亡信号通路

为了确定雄激素诱导N27细胞凋亡的机制，在睾酮暴露后12、24和48小时测定PKCδ的蛋白水解活性。睾酮治疗后48小时诱导全长PKCδ（72–74 kDa）裂解为活性催化片段（42和38 kDa​3A）。). 因为先前的研究表明多巴胺能细胞凋亡是caspase-3依赖性的(36,38)细胞与睾酮和caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK（4μ米). Z-DEVD-FMK显著抑制雄激素诱导的PKCδ裂解（图3B​3B）。). 如图4所示​4,caspase-3的抑制也能阻断雄激素诱导的多巴胺神经元凋亡。与睾酮组相比，抑制剂+睾酮组的亮蓝色荧光阳性细胞明显较少，而对照组和仅抑制剂组的蓝色荧光标记细胞水平相似。根据碘化丙啶荧光测定，Z-DEVD-FMK（0.897±0.227%）抑制了雄激素诱导的细胞死亡，而对照组为0.986±0.461%。

在单独的窗口中打开

图3

睾酮通过caspase-3途径诱导PKCδ的蛋白水解裂解。在睾酮处理12、24和48小时后，检测N27细胞中PKCδ的激活。采用Western blot分析确定PKCδ催化片段。治疗后48小时睾酮诱导PKCδ断裂（A）。Z-DEVD-FMK（4μ米)显著阻断睾酮诱导的PKCδ蛋白水解（#，P（P）<0.05）（B）。方差分析之后是学生的PLSD事后（post-hoc）测试。

在单独的窗口中打开

图4

通过抑制N27细胞中caspase-3抑制睾酮诱导的凋亡。使用Hoechst 33342评估细胞凋亡。N27细胞用载体对照（n=5）、睾酮（100n米，n=4），caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK（4μ米或Z-DEVD-FMK+睾酮（n=3）。用荧光显微镜观察细胞核染色。凋亡细胞通过亮蓝色标记细胞的存在进行鉴定。与对照组相比，睾酮显著增加了细胞凋亡（*，P（P）<0.05）（A）。抑制caspase-3阻断睾酮诱导的凋亡（B）。方差分析之后是学生的PLSD事后（post-hoc）测试。比例尺, 200 μ米.箭头表示凋亡细胞。

雄激素诱导的细胞凋亡不是一种普遍的神经元反应

为了确定雄激素是否诱导其他神经元细胞类型的凋亡，使用与N27细胞所述的相同的模式，将非多巴胺能细胞系GT1-7暴露于慢性（48小时）雄激素治疗。图5A​5A级图示了Hoechst-33342标记的GT1-7神经元的荧光显微照片。睾酮组和对照组的亮蓝色荧光标记细胞水平相似（图5B​5B），)在细胞死亡方面没有发现差异（睾酮，1.738±0.141%；对照，2.176±0.107%）。通过过氧化物测定，GT1-7细胞（2.111±0.782）的氧化应激基础水平低于N27细胞（5.447±0.240）。然而，睾酮并没有增加氧化应激（图5C​第5页).

在单独的窗口中打开

图5

睾酮不会诱导GT1-7细胞系的凋亡。在四个独立实验中，使用Hoechst 33342在非多巴胺能细胞系（GT1-7）中检测雄激素诱导的凋亡。GT1-7细胞用溶媒对照或睾酮（100 n）处理米). 睾酮组和对照组（A组和B组）中亮蓝色荧光标记的凋亡细胞没有发现差异。睾酮不会增加GT1-7细胞（C）中的过氧化物水平。学生的未婚t吨测试。比例尺, 200 μ米.箭头表示凋亡细胞。

讨论

这项研究表明，生理相关水平的雄激素诱导多巴胺能神经元的神经毒性。主要发现包括：1）睾酮通过经典的细胞内雄激素受体增加N27细胞的凋亡和细胞死亡，2）雄激素增加氧化应激诱导的线粒体功能障碍，3）睾酮诱导依赖caspase-3的PKCδ蛋白水解激活，雄激素诱导的细胞凋亡不是一种普遍的神经元事件。这些发现表明，雄激素可能导致PD发病率的性别差异(1,2).

雄激素诱导多巴胺能神经元凋亡的模型如图6所示​6该模型提出雄激素可能通过级联作用促进多巴胺能细胞损伤，级联作用涉及线粒体功能受损和氧化应激增加，导致PKCδ的caspase-3依赖性裂解（从而激活）。PKCδ断裂后，会导致DNA断裂和凋亡(66). 该模型表明雄激素受体拮抗剂可以逆转雄激素引发的凋亡事件。另一方面，药物抑制caspase-3活性可以阻断PKCδ激活的凋亡作用。

在单独的窗口中打开

图6

雄激素诱导N27细胞凋亡的假定模型。雄激素进入细胞，与经典的细胞内雄激素受体（AR）结合，诱导氧化应激，导致线粒体功能障碍。线粒体释放细胞色素c激活凋亡caspase级联反应，促进PKCδ活化。氟他胺对雄激素受体的药理抑制或Z-DEVD-FMK对caspase-3活性的药理抑制可阻断雄激素诱导的凋亡。

氧化应激被描述为PD发病机制的一个组成部分(67,68,69). 在这项研究中，我们通过测量N27细胞中还原巯基和过氧化物自由基的水平，来研究长期接触雄激素对氧化应激的影响。还原巯基可用作活性氧物种（ROS）的间接测量（或传感器）。事实上，对抗活性氧增加的一种细胞机制是产生巯基还原谷胱甘肽和硫氧还蛋白，它们维持细胞的还原-氧化平衡(70,71). 因此，还原巯基的减少表明细胞中的ROS增加。我们的数据表明，睾酮降低了N27细胞中降低的硫醇水平，表明睾酮诱导的活性氧增加。抗氧化剂NAC阻断了这种作用。此外，睾酮增加了过氧化物自由基物种（图2​2),)表明线粒体氧化应激增加。这些结果形成了我们的工作模型（图6​6),)这表明长期接触睾酮会促进线粒体功能障碍，从而进一步增加多巴胺神经元的氧化应激负荷。这种连锁反应与先前关于氧化应激在PD发病机制中的研究一致(67,72).

生理水平的雄激素对多巴胺神经元凋亡的影响尚未在超过24小时的时间段内进行检测，只有使用超生理水平睾酮的数据可用(22). 以前的研究表明，在10和100 n时24小时暴露于睾酮米对多巴胺能SH-SY5Y细胞活力无影响(22). 这些结果与我们的研究一致，表明24小时雄激素暴露对N27细胞没有影响。然而，较长时间（48小时）的孵育可诱导细胞凋亡，这表明细胞存活率取决于雄激素暴露的时间长短。

雄激素已被证明具有两种神经保护作用(73,74,75)和毒性影响(41)，取决于正在研究的雄激素系统和浓度(73,74). 此外，雄激素可以激活不同的细胞内途径，例如与神经保护有关的ERK/MAPK途径(73,75). 另一方面，雄激素的生理水平已被证明会增加前列腺细胞的凋亡(41)在芳香化酶抑制剂存在下混合皮层细胞(76). 不同的雄激素代谢产物或假定膜或经典细胞内雄激素受体的激活可能解释了这些差异效应。睾酮可以通过芳香化酶转化为雌二醇，或通过5α-还原酶还原为DHT(77,78,79). 雌激素一直被证明具有神经保护作用(80,81,82)芳香化酶敲除小鼠多巴胺能细胞凋亡增加(83). 这些研究表明，雄激素机制有助于多巴胺能细胞凋亡，雌激素机制介导多巴胺能神经保护。

最近一项对初级皮质星形胶质细胞的研究表明，雄激素暴露导致的细胞凋亡可能与膜雄激素受体的激活有关(23). 有趣的是，不渗透质膜的T-BSA的凋亡作用已被证明可降低初级皮质星形胶质细胞中的Akt磷酸化（参与细胞保护的信号通路）并增加caspase的激活(23). 因此，子类型或位置可能(即薄膜与。细胞核）在确定睾酮的保护性或毒性特性方面是至关重要的。

由于膜雄激素受体介导胶质细胞的凋亡，我们研究了这些受体对N27细胞凋亡的影响。有趣的是，睾酮促进细胞凋亡，而T-BSA则没有，即使在等摩尔浓度下使用。另一方面，非芳香化雄激素DHT也增加了细胞凋亡，支持雄激素介导的机制。最后，雄激素受体拮抗剂氟他胺阻断了睾酮和DHT的作用。氟他胺被证明优先阻断经典的细胞内雄激素受体而不是膜雄激素受体，并进一步区分了这两种受体机制(23). 因此，这些结果首次表明，雄激素诱导多巴胺能神经元细胞凋亡是通过经典的细胞内雄激素受体发生的，而不是通过药理学上不同的假定膜雄激素受体。

在PD动物模型中，PKCδ被证明是细胞凋亡的介体(36,39). 以前的研究表明，PKCδ在大脑纹状体和黑质（SN）中高度表达(32,84). 纹状体和SN的多巴胺神经元丢失是PD的特征之一(6,7,11,14,15,20). 此外，PKCδ的表达随着年龄的增长而增加(85)，这是帕金森病的一个风险因素(三,4,5). 蛋白水解激活PKCδ参与细胞凋亡中基因转录的调控(66). 与这些发现一致，我们观察到在睾酮暴露48小时后，N27细胞中PKCδ裂解增加，表明观察到的凋亡是PKCδ介导的。

PKCδ激活可能通过三种不同的机制发生：1）PKCδ的膜移位，2）酪氨酸磷酸化，3）caspase-3依赖性蛋白水解酶激活(32). 自由基导致的线粒体功能障碍、ROS生成增加以及随后的细胞色素c释放，可以激活caspase-3途径(86,87,88). 在这项研究中，我们发现睾酮增加了氧化应激和自由基生成，并证实了caspase-3信号通路参与了这些反应。Z-DEVD-FMK对caspase-3的抑制阻断了睾酮诱导的N27细胞PKCδ断裂和凋亡，表明雄激素诱导的这些神经元凋亡是通过caspase-3-依赖性蛋白水解酶激活PKCδ而发生的。这些结果与之前关于PKCδ介导的PD动物模型凋亡的报道一致(36,39).

睾酮未诱导非多巴胺能GT1-7细胞系凋亡的观察表明，多巴胺能N27细胞对雄激素的神经毒性作用更敏感。多巴胺细胞的一个固有特性是由于多巴胺本身的分解代谢而产生高度的活性氧形成和氧化应激(89,90,91). 雄激素诱导的N27细胞凋亡可能是由于睾酮的加性效应进一步增加了氧化应激和自由基物种，而该系统已经具有高氧化应激负荷。

临床研究表明，老年男性帕金森病的发病率较高(1,2). 帕金森病的临床症状发生在致密部（SNc）约60%的多巴胺神经元缺失后(8). 在大鼠SN中，雄激素受体主要表达于SNc的多巴胺能神经元，而不表达于SN网状部区域(92)这表明雄激素可能在使这些细胞比其他多巴胺神经元亚群（例如腹侧被盖区的神经元）更脆弱方面发挥作用。在老年大脑（皮层、下丘脑和海马体）中发现雄激素受体水平的变化以及睾酮水平的相互变化(93,94,95)尽管没有研究系统地研究年龄和激素水平对SNc内多巴胺神经元雄激素受体表达的影响。然而，年龄和性别已被证明改变雄激素受体磷酸化，从而影响其功能(96). 事实上，老年雄性小鼠皮质雄激素受体对睾酮的磷酸化水平高于年轻雄性和老年或年轻雌性(96). 如果其他脑区发生类似变化，如SNc，雄激素受体的磷酸化（激活）可能会导致多巴胺神经元进一步氧化应激。相反，睾酮水平随着年龄的增长而下降(95,97,98,99,100)和PD(101,102)但老年男性的睾酮水平仍然高于女性(103). 因此，睾酮水平的持续差异也可能导致多巴胺神经元的氧化应激增加，随着时间的推移，这可能会增加男性患帕金森病的风险。需要进一步的研究来证实这一假设，并确定雄激素受体功能和睾酮水平之间的关系是否有助于PD的发病机制。

总之，这些结果表明，雄激素通过增加自由基种类的产生和氧化应激，诱导线粒体功能障碍，导致PKCδ活化，从而增加多巴胺能神经元的凋亡。

致谢

脚注

工具书类