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人类分子遗传学。2010年1月1日；19(1): 170–180.
2009年10月16日在线发布。 数字对象标识：10.1093/hmg/ddp477
预防性维修识别码：项目经理2792155
PMID：19837698

细胞色素小鼠模型的分析c（c）由于基因突变导致的氧化酶缺乏范围2

华阳,1中，† 索尼娅·布罗塞尔,2,† 丽贝卡·阿辛·佩雷斯,三 维斯纳·斯拉夫科维奇,4 西野一藏,1中，‡ 拉斐·汗,5 伊拉·J·戈德堡,5 约瑟夫·格拉齐亚诺,4 乔瓦尼·曼弗雷迪,三和埃里克·肖恩1中，2,*
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关联数据

补充资料

摘要

细胞色素正确组装和功能所需的蛋白质SCO2的突变c（c）氧化酶（COX；线粒体呼吸链的复合物IV）可导致致命的婴儿心脑肌病，并伴有COX缺乏。我们已经培育出携带范围2敲除（KO）等位基因和a范围2敲除（KI）等位基因在129位（E129K）表达E→K突变，与几乎所有人类中发现的E140K突变相对应SCO2公司-变异患者。纯合子KO小鼠为胚胎致死小鼠，纯合子KI和复合杂合子KI/KO小鼠存活，但肌肉无力；生化方面，他们有呼吸链缺陷以及多个组织中复杂的IV组装缺陷。线粒体铜含量随之降低，但受检组织中铜的总量没有降低。这些小鼠模型应用于进一步研究Sco2功能，以及测试治疗人类疾病的治疗方法。

简介

哺乳动物细胞色素c（c）氧化酶（COX），也称为线粒体呼吸链复合体IV，是一种多亚单位全蛋白，由线粒体DNA（mtDNA）编码的三个亚基和核DNA编码的10个亚基以及两个血红素组成(一和一三)，三个铜、一个镁和一个锌作为假体组(1). 线粒体DNA编码亚单位（COX I–III）构成酶的催化核心，并包含三个氧化细胞色素的氧化还原中心c（c）并还原氧以形成水，同时将质子从基质泵入膜间空间。在这个反应中，来自细胞色素的电子c（c）首先转移到CuA类亚单位II中的位点（包含两个铜原子），然后到血红素一位于亚单位I中，然后到达CuB类-血红素一三双核中心，也位于亚单位I中，最后形成分子氧(2)。

COX全蛋白的组装是一个复杂且受调控的过程，需要20多个辅助组装因子，包括处理结构亚单位和将全蛋白插入线粒体内膜所需的蛋白质，以实现血红素的生物合成和成熟，以及铜的代谢和插入全蛋白(2——7)。

将铜插入人COX至少需要八种蛋白质，包括CMC1、COX11、COX17、COX19、COX23、PET191、SCO1和SCO2(2). SCO1和SCO2（SCO代表秒合成c（c）细胞色素c（c） o（o）氧化酶）是与细菌相关的同源蛋白prrC公司，是的成员prrBCA公司与光合作用调控反应相关的操纵子球形红杆菌(8,9). 因此，SCO不仅可以将铜输送到铜A类现场(10)，但也可以用作氧化还原传感器(9,11,12). 虽然SCO1和SCO2都包含一个高度保守的CXXXC基序，该基序可能与铜结合，因此被认为是金属伴侣，对COX催化核心的组装至关重要(13,14)，这两种蛋白质显然具有非重叠功能(15,16)并可能不同程度地参与细胞铜稳态的调节(16). 然而，迄今为止，SCO蛋白的确切功能尚不清楚。

人类SCO1和SCO2的致病性突变导致与致命婴儿COX缺乏相关的线粒体疾病。虽然这两种蛋白似乎在所有组织中都表达(17)，SCO1的致病性突变导致致命的婴儿肝脑肌病(18)而SCO2患者出生后不久就会导致肥厚性心肌病、脑病和肌病(17). 为什么这两个基因的突变会导致如此不同的表现正在调查中。

迄今为止，超过25名常染色体隐性COX缺乏症患者是由SCO2公司已被描述(17,19——27). 只有一个例外(27)，所有患者都有一个错义突变，该突变在至少一个等位基因上将Glu-140转化为Lys（即E140K），该位点距离CXXXC铜结合域只有三个残基(9). 有趣的是，与在一个等位基因上有E140K和在其他等位基因中无突变（截断或移码突变）的复合杂合子相比，E140K突变纯合子患者的症状发作延迟，病程更长，死亡时间在发病中后期(20)。

为了更好地理解SCO2的生物学作用，并测试潜在的治疗方法，我们创造了同时携带SCO2和SCO2的小鼠苏格兰2敲除（KO）等位基因和a范围2敲除（KI）E129K等位基因，对应于人类常见的E140K突变。尽管纯合子KO小鼠是胚胎致死小鼠，但纯合子KI小鼠和复合杂合子KI/KO小鼠在受人类疾病影响的组织中都表现出COX缺乏。

结果

的生成范围2突变小鼠

使用5 kb千磅I片段包含整个范围2基因和侧翼的部分Tymp公司和Ncaph2号机组基因作为靶向载体，我们生成范围2KO和E129K KI结构(补充材料，图S1). 将这些基因转染到ES细胞中，并将阳性克隆注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中。通过聚合酶链反应（PCR）分析验证杂合WT/KO和WT/KI小鼠(补充材料，图S2)尾巴DNA的测序。获得种系传播后，我们移除了NeoR（右）通过将杂合小鼠与cre公司老鼠。然后将后代与WT 129Sv/J小鼠回交。由此产生的杂合子小鼠健康且有生育能力，与野生型（WT）同窝小鼠相比没有任何明显差异。

杂合子KI（E129K）小鼠近交产生80只小鼠范围2E129/E129（WT）、纯合K129/K129和杂合E129/K129-等位基因的孟德尔预期比率（分别为20:38:22只动物）。成年体重、出生后的生长和发育与WT同窝伙伴无明显区别（数据未显示）。

进一步交配，包括与杂合KO小鼠的交配，使我们能够产生纯合KI/KI（以下称为KIKI小鼠）和复合杂合KI/KO（KIKO）小鼠，但我们无法获得活的纯合KO/KO小鼠：在近交WT/KO杂合子后，我们观察到7.5 dpc（生后天数）下的后代孟德尔比率（6 WT/WT、14 WT/KO和7 KO/KO），但出生时没有观察到活的KO纯合子（42 WT/WT，87 WT/KO和0 KO/KO.）。KOKO小鼠的胚胎致死发生在妊娠早期；我们能获得的最新KOKO胚胎是在受精后8.5天，并且有严重的形态异常（图1). 检测COX活性的组织化学显示，与年龄匹配的WT胚胎相比，尽管WT和突变胚胎都有线粒体，但胚胎中的COX严重缺乏，如琥珀酸脱氢酶（SDH）活性阳性染色所示（图1B） ●●●●。

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小鼠胚胎的形态学分析。(A类)WT和KOKO胚胎的PCR分析。符号如中所示补充材料，图S2. (B类)组织化学检测WT（顶部面板）和KOKO（底部面板）8.5 dpc胚胎中的COX和SDH活性。注意KOKO胚胎中没有COX活性，但存在SDH活性。

与KOKO小鼠相比，KIKI和KIKO小鼠是活的。它们的寿命与WT同窝出生的同类相似，在每个测试年龄，它们的体重与对照组相似（未显示）。小鼠并没有出现人类疾病中出现的心脑肌病的明显症状，但经过进一步研究，我们发现在小鼠体内范围2-突变小鼠与正常小鼠的比较。

生物化学

我们评估了4个月龄WT、KIKI和KIKO小鼠大脑、心脏、肝脏和肌肉分离的粗线粒体中呼吸链复合物I、III和IV（COX）的活性，这些复合物归一化为柠檬酸合成酶（CS）的活性。在所有情况下，KIKI和KIKO小鼠的标准化复合物I活性与WT对照组的值相当（图2). 然而，KIKO小鼠所有受检组织中的复合IV活性均降低（约20–60%），肝脏中的值最低（约60%；图2). 在KIKI小鼠的所有组织中，复合物IV活性也降低，但程度较轻（约为15-45%）（图2). 令人惊讶的是，我们还检测到突变小鼠所有组织中的复合物III活性降低（约为15-45%；图2)。

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呼吸链酶活性。所有活性均标准化为柠檬酸合成酶的活性。中的值范围2-突变小鼠相对于WT同窝小鼠±SE的百分比。星号（*）表示与WT的显著差异(P（P）< 0.05); 双星号（**）表示KIKO与WT和KIKI的显著差异(P（P）< 0.05).

我们分析了相同组织和粗制线粒体中的铜含量。组织中的总铜含量基本上没有差异（图三A和B），但与WT动物相比，从KIKI和KIKO小鼠所有受检组织中分离出的粗线粒体部分中的铜有明显减少的趋势（图三C） ●●●●。

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组织中的铜含量如图所示2. (A类)总组织中的铜含量，µg/g湿重基础。(B类)总组织的铜含量，µg/g蛋白质为基础。(C类)粗线粒体部分的铜含量，µg/g粗线粒体蛋白质基础。由于雄性和雌性小鼠之间的铜值没有明显差异，因此将两性的数据合并以提高统计能力；所有值均为平均值±SE（分析的样品数量在括号中表示C类). 星号（*）表示与WT的显著差异(P（P）< 0.05).

虽然没有严格定量，但对小鼠肌肉、心脏、大脑、肝脏和肾脏中COX活性的组织化学检测显示，与WT相比，KIKO小鼠的COX缺乏程度更明显，骨骼肌和大脑受到的影响最为显著(补充材料，图S3)与人类SCO2缺乏症中受影响最大的两种组织相似(17). 骨骼肌的更详细的组织化学检查表明，在WT和突变动物中，COX活性模式与Sco2免疫染色模式相似（图4)。

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肌肉组织化学和免疫组织化学。组织化学检测COX和SDH，免疫组织化学检测Sco2，检测代表性4月龄雄性和雌性小鼠的肌肉。注意COX染色的强度和分布减少，特别是在KIKO小鼠中（×20）。

我们进行了一维蓝色阴性凝胶电泳（1D-BNGE）(28,29)来自肝脏和大脑的线粒体，用五种OxPhos复合物中每一种的代表性抗体进行探测。我们发现，在KIKO和KIKI小鼠中，完全组装的复合物IV水平降低，同时KIKO小鼠中的一条带明显消失，对应于WT和KIK1小鼠中存在的由复合物III和IV组成的超复合物（SC）（图5A） ●●●●。为了进一步研究复杂IV组装，我们将样品置于二维BNGE（2D-BNGE）下(28)然后用western blotting检测复合物IV的不同亚单位。当使用COX I和COX II抗体时，我们在KIKI和KIKO样品中观察到一个亚复合物的出现，大小约为80–100 kDa，在肝脏和大脑中，这在WT对照组中是不存在的（图5B） ●●●●。使用抗COX-Va的抗体，我们观察到在KIKI和KIKO小鼠的肝脏和大脑线粒体中出现了不同的亚复合体，大小约为150kDa，但在WT小鼠中没有（图5B） ●●●●。我们在凝胶的低分子量部分（即40-66 kDa之间）没有发现游离未组装亚基的证据，但我们不能排除存在小于40 kDa的亚基但从凝胶中流出的可能性。另一方面，当用COX IV抗体进行印迹时，我们没有观察到任何异常的组装中间产物（图5B） ●●●●。这些结果揭示了Sco2不仅在复杂IV功能中起作用，而且在其组装中也起作用。最后，使用五种抗体的混合物，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的大脑和肝脏粗线粒体蛋白质的western blotting中，从五种氧磷复合物中的每一种中检测一种代表性多肽，我们发现与WT相比，KIKI和KIKO小鼠中COX I的数量减少（图5C） ●●●●。这种减少似乎与这些组织中Sco2（或Sco1，就此而言）的数量无关（图5D） ●●●●。

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(A类)1D-BNGE分离的小鼠线粒体的Western blot分析。请注意，SC存在于WT和KIKI小鼠中，但在KIKO小鼠中显然不存在。(B类)通过2D-BNGE分离的复合物IV组装中间体的蛋白质印迹分析。通过对复合物IV指示亚单位的探索，发现KIKI和KIKO小鼠的肝和脑线粒体中存在中间亚复合物，使用COX I、COX II和COX Va抗体（星号），但不使用COX IV抗体。分子量标记（以千道尔顿为单位）位于顶部。(C类)SDS-PAGE分离的小鼠线粒体蛋白质的Western blot分析。用SDS-PAGE分离所示组织中的线粒体蛋白，并用所示亚单位的抗体混合物进行检测。负荷控制为抗细胞色素c（c）. (D类)Western blot分析检测Sco1和Sco2，如(C类). 负荷控制为抗孔蛋白。

功能分析

我们对运动功能、协调性和神经肌肉力量进行了评估。根据立杆试验的表现，突变小鼠和WT小鼠之间的神经肌肉协调性没有差异。然而，当小鼠在跑步机上进行跑步测试时，4个月大的KIKO雄性小鼠的耐力明显低于其WT同窝小鼠（图6B） ●●●●。KIKO小鼠也有肌肉无力，这是通过悬挂钢丝测试测得的（图6A） ●●●●。有趣的是，虽然雄性和雌性小鼠都出现了肌肉无力，但雌性小鼠的肌肉无力发生却延迟了：雄性小鼠在4个月龄时明显丧失了力量，而雌性小鼠在该年龄段是正常的，直到8个月龄才表现出力量的丧失（图6A） ●●●●。在这方面，我们注意到，肌肉缺乏另一种COX组装蛋白Cox10的小鼠对过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化物1-alpha（PGC-1α）上调的反应程度存在性别差异(30)。

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功能测试。(A类)老鼠被测试了悬挂在悬挂电线上的能力。括号中的数字表示所分析的小鼠数量。(B类)在跑步机上的耐力；星号和双星号如图所示2。

通过经胸M型和二维超声心动图测量，我们发现WT和Sco2突变小鼠的心脏功能没有显著差异(31)（未显示）。

讨论

我们在这里描述了由于COX组装蛋白Sco2的突变导致的COX缺乏的第一个小鼠模型。而纯合子范围2KO小鼠是胚胎致死小鼠，纯合E129K KIKI和复合杂合KIKO小鼠都表现出生化、形态和功能缺陷，使人想起并兼容人类受影响组织中COX活性的丧失第二阶段缺乏。然而，虽然范围2-突变小鼠再现了人类疾病的许多生化和功能特征，但它们并没有复制所有这些特征。特别是，尽管大多数SCO2公司-突变患者死于心脏病和肌病合并的婴儿期，KIKI和KIKO小鼠均未出现心肌病迹象，寿命也未缩短。

在我们的范围2小鼠模型与人类疾病中的模型相比，与纯合子中观察到的胚胎致死表型形成了鲜明对比范围2KO小鼠，其本身与缺乏冲浪1，另一种COX组装基因，基本正常(32,33). 尤其是小鼠的纯合性破坏范围2该基因在8.5 dpc之前导致胚胎死亡，这意味着Sco2在早期发育中起着关键作用。需要对从这些胚胎中提取的细胞进行进一步分析，以更好地确定致死性的性质。

我们的数据也支持以下观点：SCO1公司和SCO2公司哺乳动物和酵母中都有重复基因(17)，它们可能具有非重叠功能(15,34). 我们注意到范围1早在2细胞期（Genbank AK139512.10）的小鼠胚胎以及8天、9天和10天的胚胎中就检测到了mRNA(AK017794.1号,AK083729.1和AK011251.1号这意味着Sco1蛋白存在于早期发育过程中。如果是这样的话，我们的结果表明Sco1不能挽救纯合子KO小鼠胚胎中Sco2功能的丧失，这支持了Sco2不仅对胚胎生存能力至关重要，而且Sco1和Sco2在发育的这个阶段（也可能在出生后的生活中）至少部分具有非重叠功能的观点。细胞培养中也报告了Sco1和Sco2之间缺乏互补性，Sco1或Sco2突变导致铜水平和COX活性降低，Sco2的过度表达可以抑制铜水平和CO活性，但Sco1的过度表达不能抑制(16)。

本研究中创建的两个可行的小鼠模型携带E129K突变（人类E140K突变的同源物），无论是纯合KIKI还是复合杂合子，带有一个E129K等位基因和一个KO等位基因（KIKO）。这两只小鼠都是活的、可繁殖的，似乎与它们的WT同胞一样长寿，我们发现突变小鼠与WT同胞在体重、外观、梳理、筑巢和睡眠行为方面没有差异。KIKI和KIKO小鼠的这种明显的良好健康状况与人类的类似情况形成了鲜明对比SCO2公司E140K纯合子患者(20)和复合杂合子(17)突变，在大约一年内死亡，典型的是心脑肌病。

另一方面，KIKO小鼠在跑步机耐力测试中表现不佳，与WT同窝小鼠相比，它们更容易疲劳。他们的运动功能也受到了损害，这是通过悬挂钢丝抓地力测试测得的。运动活动和肌肉耐力的缺陷与肌肉中COX活性的显著不足一致，并且很可能是由于COX活性显著不足所致。事实上，我们发现所有被检查组织中的COX活性降低，包括大脑、心脏、肝脏和骨骼肌，其中肝脏的COX含量最低。在这些组织的COX组织化学中，也可以观察到生化测定的COX活性降低。然而，小鼠体内COX生化和组织化学活性的降低在肌肉中不如在肝脏或心脏中严重，与在人类体内观察到的情况形成对比SCO2公司COX缺乏似乎在心肌和骨骼肌中最严重的患者(17). 我们对这些差异没有解释，但它们可能解释了我们观察到的相对温和的表型。

有人提出，SCO2独立于其在COX组装中的作用，作用于SCO1的上游，通过调节细胞铜流出速率来帮助维持细胞铜稳态(16)这可以解释SCO突变患者细胞和组织中细胞铜总量的减少(16,35). 然而，虽然在KIKI和KIKO小鼠的粗线粒体部分中发现的铜含量低于WT（与COX活性降低一致），但我们检测的组织中的铜总量在Sco2-突变动物中没有下降。我们不知道为什么小鼠的数据与人体组织的数据不一致。

许多研究表明，SCO2-突变患者组织中存在高残留水平的COX组装中间体(23,36). 患者SCO2突变被认为降低了CuA类COX II中心形成(15,36)这意味着铜中存在铜A类COX II的组装或稳定性需要现场(37). 这一观点得到了研究的支持，在这些研究中，COX活动在SCO2公司-添加铜的突变细胞(34,36,38,39). 然而，铜向COX的直接转移还没有得到证实，而且仍然是推测性的，关于SCO2相对于COX II的空间安排，还不知道什么。

我们用2D-BNGE检测小鼠体内COX的缺陷，这是一种检测呼吸链复合物组装中间体的灵敏方法。在KIKI和KIKO小鼠的脑和肝线粒体中，我们发现含有COX I和COX II的异常组装中间产物的积累，这意味着除了铜向Cu转运的缺陷外A类COX II中的站点(10)，E129K突变也可能间接损害铜向COX I的转运(40)从而影响COX的组装并降低这些组织中的COX活性。我们还检测到一种含有COX Va的异常组装中间产物。我们在小鼠体内观察到的COX组装缺陷与在人类细胞和组织中观察到的缺陷相似上海合作组织但值得注意的是，这些子组件的组成因患者而异。Taanman的小组将两个子组件描述为一体SCO1公司患者，一个含有COX I、IV和Va，另一个仅含有COX I(41). Houstek的团队描述了SCO1公司同时含有COX I和II但不含COX IV和Va的患者(35). 他们还发现了SCO2公司含有COX I、IV和Va但不含COX II的改变亚组分的患者；有趣的是，组织之间的装配缺陷各不相同(37). 最后，寿桥的团队发现SCO1公司含有COX I和IV但不含COX II的子组件的患者（未检查COX Va）(15). 因此，在范围2-含有Cox I、II和Va的突变小鼠，但不含Cox IV，与人类患者中发现的小鼠密切相关，但并不完全相同。可能是SCO1突变导致的组装缺陷与SCO2不同，或者SCO突变以组织特异性的方式干扰COX组装途径，或者不同的特异性SCO突变对COX组装过程有不同的影响。最后，我们（也许还有其他人）观察到的一些亚组件也可能是降解产物，而不是真正的组装中间体，因为当SCO2突变时，COX全复合物更不稳定。

根据COX组装的当前模型，该过程从COX I与COX IV或COX Va的相互作用开始(29,41,42). 在我们的2D-BNGE分析中，含有COX I的中间产物表明，E129K突变在组装路径的早期阶段损害了COX组装，这与COX I突变患者COX缺陷的观察结果一致，这些患者的COX全酶组装有缺陷(43,44). 同样，对COX II突变细胞的免疫印迹分析也显示COX I和COX II的量都减少，同时COX活性也降低(45,46). 尽管SCO1和SCO2可能具有非重叠功能，但它们在COX组装途径中的作用似乎相似，因为在我们的SCO2缺陷小鼠和SCO1缺陷患者的细胞中都发现了含有COX I和COX II但不含COX IV的组装中间体(35)。

我们还检测到KIKO和KIKI小鼠的复合物III活性降低。这一发现有点出乎意料，因为在最初的报告中没有观察到复杂III缺陷SCO2公司突变(17,19,20)，但我们注意到SCO2公司病人最近被报告(27). 线粒体疾病患者中存在复合物I+III(47)和I+III+IV(48)虽然我们注意到一些SCO2公司患者被报告患有I+III缺乏症(23,27). 当然，因为呼吸链可以作为SC存在(49)复合物IV组装蛋白（如SCO2）的突变也可能影响复合物III的活性。

同样有趣的结果是在KIKI和KIKO小鼠中观察到的COX缺乏症的定量性质。具有两个E129K等位基因的KIKI小鼠的表型不如具有一个E129K等位基因和一个空等位基因KIKO小鼠的严重。这一结果与在人类中观察到的相应E140K突变相似，携带两个E140K等位基因的患者比携带一个E140K等位基因和一个空等位基因患者生存时间更长(20). 这种错义突变在小鼠和人类中的数量行为表明，它是一种亚型，在铜运输中，或者更推测地说，在氧化还原感应中，它仍然允许残留功能(9). 如果E140K确实是亚形态的，那么携带该突变的未受影响的杂合子父母应该具有一半以上的正常SCO2功能（因此COX活性>50%），从而可能比那些具有更有害等位基因的携带者具有选择性优势，从而解释为什么E140K突变在人群中如此常见。因此，虽然我们的KIKI和KIKO小鼠只复制了人类疾病的某些方面，但它们很好地模拟了常见E140K突变的定量性质。

总之，小鼠Sco2的突变通过破坏COX全蛋白的稳定性降低COX活性，并对复合物III的活性产生意外影响。由于这些Sco2突变体小鼠也能再现人类疾病的许多功能特征，包括肌肉无力，但仍能存活和繁殖，因此它们在测试潜在疗法的效果方面具有价值(30)针对孟德尔遗传性COX缺乏症，这是一组目前无法治愈和致命的疾病。

材料和方法

动物护理

所有实验均根据哥伦比亚大学医学中心动物护理和使用委员会批准的方案进行，该方案符合美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南。小鼠按照国际标准条件进行饲养和繁殖，光照12小时，暗照12小时。

Sco2小鼠模型的生成

生成和分析范围2-突变小鼠在补充材料。

呼吸复合物的酶活性

通过脑、心、肝和肌肉组织的匀浆和差速离心获得粗线粒体。组织在四个体积的SETH缓冲液（250 m）中均匀化米蔗糖，2米米乙二胺四乙酸，10米米三重-盐酸，50 U/ml肝素，pH 7.4），置于冰上的玻璃均质器（5-8冲程）中。匀浆在600℃下加热克在4°C下保持5分钟。上清液在8000下再次离心克在4°C下保持15分钟。将含有粗线粒体的颗粒重新悬浮在SETH缓冲液中（约10–25 mg/ml）。蛋白质浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白为标准。

我们使用分光光度法测定CS(50)、复合物I、复合物III(51)和复合物IV(52)如前所述，从小鼠组织中分离出的粗线粒体的活性。

组织化学和免疫组织化学分析

对于组织化学，大脑、心脏、肝脏和肌肉组织在液氮中冷却的异戊烷中冷冻。如前所述，对组织进行冷冻切片（8µm厚），并对SDH和COX活性进行染色(53). 对于免疫组织化学，组织切片在室温（RT）下固定在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）中10分钟。在PBS中冲洗组织，然后在柠檬酸盐缓冲液（10 m）中进行抗原回收步骤米柠檬酸，pH 6.0，在100°C下放置45分钟）。然后在室温下将载玻片在0.4%Triton X-100中的PBS中孵育20分钟，并在室温下在含有160µl/ml Avidin Block（Vector Labs）的SuperBlock阻断缓冲液（Pierce）中阻断1小时。将抗人SCO2的交叉反应兔多克隆抗体（见下文）在含有160µl/ml生物素块（Vector Labs）的SuperBlock封闭缓冲液中按1:100稀释，并在4°C下过夜添加到组织切片中。在RT时添加次级生物素化兔抗体（Amersham）1 h，然后在RT时与链霉亲和素荧光素（Amersham）孵育1 h。

铜分析

我们使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）方法分析铜。我们在浓HNO中消化组织匀浆三在RT下20小时，稀释至10%的最终酸浓度，并使用配备有AS 93+自动进样器和适当校准标准的Perkin Elmer Elan动态反应池（DRC）II ICP-MS分析Cu浓度。我们使用与铜（即镓）的质量和电离特性相匹配的内标来校正基质诱导的干扰。我们使用氨作为第二种气体来抑制仪器DRC中的多原子干扰。已知铜浓度的标准血清样品的内精密变异系数为2.8%，选定的重复组织样品的内精确变异系数为1.6%。

BNGE和蛋白质印迹

对于SDS–PAGE分离的蛋白质的western blotting，通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳15µg粗线粒体，并将其电印在聚偏二氟乙烯（PVDF）过滤器（Bio-Rad）上。对于蛋白质检测，我们使用MitoProfile Total OxPhos啮齿动物抗体混合物（Mitosciences MS604）。抗细胞色素c（c）（Invitrogen编号456100；1:1000稀释）用作负荷控制。对于Sco蛋白的western blotting，将30µg小鼠粗线粒体蛋白加载到15%的聚丙烯酰胺凝胶上，用SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素膜上，并用与相应小鼠蛋白交叉反应的人SCO1或SCO2兔抗血清进行探测。针对人类SCO1的第272–285号氨基酸（EFLDYFGQNKRKGE）和人类SCO2的第236–249号氨基酸（LFTDYYGRSRSAEQ）制备抗血清（Zymed Laboratories，Invitrogen）。在对抗血清进行亲和纯化后，将抗体稀释为1:400进行免疫印迹。抗霉素（Abcam编号ab15895；1:500稀释）用作负荷控制。

对于BNGE，将用月桂基麦芽糖苷提取的50–75µg线粒体蛋白质涂敷在5–13%梯度BN凝胶上，然后通过12.5%变性凝胶分离2D-BNGE(54). 电泳后，蛋白质被电印在PVDF过滤器上，然后用特异性抗体进行检测。对于蛋白质检测，我们使用了抗NDUFA9（复合物I）、Fp（复合物II）、核心2（复合物III）、COX I（复合物IV）、COX II（复合物IV）、COX IV（复合物IV）、COX Va（复合物IV）和ATPase-β（复合物V）的抗体。所有抗体均来自Invitrogen。

小鼠功能分析

为了测量小鼠的耐力，小鼠在跑步机（哥伦布仪器公司）上以22米/分钟的速度奔跑，直到达到疲劳状态。疲劳被定义为尽管连续用手戳了1分钟，但小鼠仍无法保持适当的速度，此时将小鼠从跑步机上取下并记录其运行时间。

用立杆试验测定小鼠的协调性和平衡性。塑料杆直径2厘米，长40厘米，用布带包裹，以提高牵引力。老鼠被放在柱子的中心，处于水平位置。然后逐渐将电杆提升至垂直位置。正常的协调和平衡被定义为小鼠在杆子上停留超过45°角的能力。

通过标准吊线试验检测小鼠的肌肉异常(55). 老鼠被放在铁丝笼盖上，盖子慢慢倒置。盖子高出长凳约20厘米。盖住盖子周围的胶带防止老鼠从边缘走下来。记录小鼠从笼盖上掉下来的时间，并留出2分钟的截止时间。试验重复五次，两次试验之间休息20秒。

如前所述，通过经胸M型和二维超声心动图测量心功能(31)。

基金

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助(HD83062型;,第11766页; 和AG08702型; 【致E.A.S.】，K02NS047306型; [致通用汽车]，HL73029型; [致国际J.G.]，T3207343电话; 【致R.K.】和P42ES10340页; 和第30ES09089页（致J.G.）、肌肉营养不良协会（致E.A.S.和G.M.）、联合线粒体疾病基金会（致R.A.-P.）和万豪基金会（至E.A.S..）。

补充材料

【补充资料】

致谢

我们感谢Victor C.S.Lin（哥伦比亚转基因/基因靶向设施）协助获得范围2以及弗吉尼亚·帕皮奥安诺（哥伦比亚遗传与发展部），以获得有益的建议和讨论。

利益冲突声明.作者没有利益冲突。

参考文献

1Tsukihara T.、Aoyama H.、Yamashita E.、Tomizaki T.、Yamaguchi H.、Shinzawa-Itoh K.、Nakashima R.、Yaono R.、Yoshikawa S.氧化牛心脏细胞色素金属位点的结构c（c）2.8 A下的氧化酶。科学。1995;269:1069–1074.[公共医学][谷歌学者]
2Barrientos A.、Gouget K.、Horn D.、Soto I.C.、Fontanesi F.酵母和人类COX组装缺陷的抑制机制：对COX组装过程的见解。生物化学。生物物理学。《学报》。2009;1793:97–107. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Pecina P.、Houstkova H.、Hansikova H、Zeman J.、Houstek J.细胞色素的遗传缺陷c（c）氧化酶组件。生理学。物件。2004;53（补充1）：S213–S223。[公共医学][谷歌学者]
4Herrmann J.M.，Funes S.线粒体内膜细胞色素氧化酶营养装配线的生物发生。基因。2005年；354:43–52.[公共医学][谷歌学者]
5Zee J.M.，Glerum D.M.《人类细胞色素氧化酶组装缺陷：酵母的教训》。生物化学。细胞生物学。2006;84:859–869.[公共医学][谷歌学者]
6Fontanesi F.、Soto I.C.、Horn D.、Barrientos A.线粒体细胞色素的组装c（c）-氧化酶是一种复杂且高度调控的细胞过程。美国生理学杂志。细胞生理学。2006;291：C1129–C1147。[公共医学][谷歌学者]
7Fontanesi F.、Soto I.C.、Barrientos A.细胞色素c（c）氧化酶生物发生：新的调控水平。IUBMB寿命。2008;60:557–568. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Eraso J.M.，Kaplan S.从氧化还原流到基因调控：PrrC蛋白的作用球形红杆菌2.4.1.生物化学。2000;39:2052–2062.[公共医学][谷歌学者]
9Williams J.C.、Sue C.、Banting G.S.、Yang H.、Glerum D.M.、Hendrickson W.A.、Schon E.A.人类SCO1的晶体结构：线粒体细胞色素对氧化还原信号传导的影响c（c）氧化酶组装蛋白。生物学杂志。化学。2005年；280:15202–15211.[公共医学][谷歌学者]
10Lode A.、Kuschel M.、Paret C.、Rodel G.酵母中的线粒体铜代谢：Sco1p和Cox2p之间的相互作用。FEBS信函。2000;485:19–24.[公共医学][谷歌学者]
11Chinnov Y.V.细胞色素c（c）具有硫氧还蛋白折叠的氧化酶组装因子在原核生物和真核生物中是保守的。《分子医学杂志》。2000;78:239–242.[公共医学][谷歌学者]
12Abriata L.A.、Banci L.、Bertini I.、Ciofi-Baffoni S.、Gkazonis P.、Spyrulias G.A.、Vila A.J.、Wang S.铜的机理A类组件。自然化学。生物。2008;4:599–601. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Carr H.S.，Winge D.R.细胞色素组装c（c）线粒体内的氧化酶。Acc.Chem.化学。物件。2003;36:309–316.[公共医学][谷歌学者]
14Dickinson E.K.、Adams D.L.、Schon E.A.、Glerum D.M.人类SCO2突变有助于确定Sco1p在细胞色素氧化酶组装途径中的作用。生物学杂志。化学。2000;275:26780–26785.[公共医学][谷歌学者]
15Leary S.C.、Kaufman B.A.、Pelleccia G.、Guercin G.H.、Mattman A.、Jaksch M.、Shoubridge E.A.人类SCO1和SCO2在向细胞色素输送铜方面具有独立、合作的功能c（c）氧化酶。嗯，分子遗传学。2004;13:1839–1848.[公共医学][谷歌学者]
16Leary S.C.、Cobine P.A.、Kaufman B.A.、Guercin G.H.、Mattman A.、Palaty J.、Lockitch G.、Winge D.R.、Rustin P.、Horvath R.等人。人类细胞色素c（c）氧化酶组装因子SCO1和SCO2在维持细胞铜稳态中具有调节作用。细胞代谢。2007;5:9–20.[公共医学][谷歌学者]
17Papadopoulou L.C.、Sue C.M.、Davidson M.M.、Tanji K.、Nishino I.、Sadlock J.E.、Krishna S.、Walker W.、Selby J.、Glerum D.M.等。致命婴儿心脑肌病伴COX缺乏和突变SCO2公司，一种COX组装基因。自然遗传学。1999;23:333–337.[公共医学][谷歌学者]
18瓦尔诺一世、奥斯蒙德·S·、吉加雷尔·N·、梅耶·B·、阿米尔·J·、科尔米尔·戴尔·V·、穆尼奇·A·、博内方·J.P.、鲁斯汀·P·、Rötig·A·SCO1公司线粒体细胞色素基因c（c）氧化酶缺乏伴新生儿期肝衰竭和脑病。Am.J.Hum.遗传学。2000;67:1104–1109. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Jaksch M.、Ogilvie I.、Yao J.B.、Kortenhaus G.、Bresser H.G.、Gerbitz K.D.、Shoubridge E.A.SCO2突变与一种独特的肥厚型心肌病和细胞色素相关c（c）氧化酶缺乏。嗯，分子遗传学。2000;9:795–801.[公共医学][谷歌学者]
20Jaksch M.、Horvath R.、Horn N.、Auer D.P.、Macmillan C.、Peters J.、Gerbitz K.D.、Kraegeloh Mann I.、Muntau A.、Karcagi V.等人。SCO2中的纯合子（E140K）会导致婴儿心肌病和神经病变的延迟发作。神经病学。2001年；57:1440–1446.[公共医学][谷歌学者]
21Salviati L.、Sacconi S.、Rasalan M.M.、Kronn D.F.、Braun A.、Canoll P.、Davidson M.、Shanske S.、Bonilla E.、Hays A.P.等人，《细胞色素》c（c）一种新的SCO2突变导致的氧化酶缺乏与Werdnig-Hoffmann病相似。架构（architecture）。神经醇。2002;59：862–865。[公共医学][谷歌学者]
22Sacconi S.、Salviati L.、Sue C.M.、Shanske S.、Davidson M.M.、Bonilla E.、Naini A.B.、De Vivo D.C.、DiMauro S.分离细胞色素患者突变筛查c（c）氧化酶缺乏。儿科。物件。2003;53:224–230.[公共医学][谷歌学者]
23Tarnopolsky M.A.、Bourgeois J.M.、Fu M.H.、Kataeva G.、Shah J.、Simon D.K.、Mahoney D.、Johns D.、MacKay N.、Robinson B.H.新型SCO2突变（G1521A）表现为脊髓性肌萎缩症I型表型。美国医学遗传学杂志。2004;125安:310–314.[公共医学][谷歌学者]
24Vesela K.、Hansikova H.、Tesarova M.、Martasek P.、Elleder M.、Houstek J.、Zeman J.对6例分离细胞色素的患者进行临床、生化和分子分析c（c）由于基因突变导致的氧化酶缺乏SCO2公司基因。儿科学报。2004;93：1312–1317。[公共医学][谷歌学者]
25Leary S.C.、Mattman A.、Wai T.、Koehn D.C.、Clarke L.A.、Chan S.、Lomax B.、Eydoux P.、Vallance H.D.、Shoubridge E.A.早期快速进展性致命心肌病中的半合子SCO2突变。分子遗传学。Metab公司。2006;89:129–133.[公共医学][谷歌学者]
26Knuf M.，Faber J.，Huth R.G.，Freisinger P.，Zepp F.，Kampmann C.细胞色素中新型复合杂合子SCO2突变的鉴定c（c）氧化酶缺乏致命的婴儿心脑肌病。儿科学报。2007;96:130–132.[公共医学][谷歌学者]
27Mobley B.C.、Enns G.M.、Wong L.J.、Vogel H.一种新型纯合子SCO2公司突变，p.G193S，导致致命的婴儿心脑肌病。临床。神经病理学。2009;28:143–149.[公共医学][谷歌学者]
28Schägger H.、Bentlage H.、Ruitenbeek W.、Pfeiffer K.、Rotter S.、Rother C.、Bottcher-Purkl A.、Lodemann E.血小板和细胞系多蛋白复合物的电泳分离：氧化磷酸化缺陷疾病分析技术。电泳。1996;17:709–714.[公共医学][谷歌学者]
29Nijtmans L.G.、Taanman J.W.、Muijsers A.O.、Speijer D.、Van den Bogert C.细胞色素组装-c（c）培养人细胞中的氧化酶。欧洲生物化学杂志。1998;254:389–394.[公共医学][谷歌学者]
30Wenz T.、Diaz F.、Spiegelman B.M.、Moraes C.T.激活PPAR/PGC-1α途径可防止生物能量缺乏，并有效改善线粒体肌病表型。细胞代谢。2008;8:249–256. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 已缩回
31Yamashita H.、Bharadwaj K.G.、Ikeda S.、Park T.S.、Goldberg I.J.高血压的心脏代谢补偿需要脂蛋白脂肪酶。美国生理学杂志。内分泌。Metab公司。2008;295：E705–E713。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Agostino A.、Invernizzi F.、Tiveron C.、Fagiolari G.、Prelle A.、Lamantea E.、Giavazi A.、Battaglia G.、Tatangelo L.、Tiranti V.等人冲浪1与高胚胎死亡率、线粒体疾病和细胞色素有关c（c）小鼠氧化酶缺乏。嗯，分子遗传学。2003;12:399–413.[公共医学][谷歌学者]
33Dell’agnello C.、Leo S.、Agostino A.、Szabadkai G.、Tiveron C.、Zulian A.、Prelle A.、Roubertoux P.、Rizzuto R.、Zeviani M.延长Ca的寿命和耐火度2+-Surf1敲除小鼠的依赖性神经退行性变。嗯，分子遗传学。2007;16:431–444.[公共医学][谷歌学者]
34Glerum D.M.、Shtanko A.、Tzagoloff A.SCO1和SCO2是线粒体铜补充缺陷的高拷贝抑制因子酿酒酵母。生物学杂志。化学。1996;271:20531–20535.[公共医学][谷歌学者]
35Stiburek L.、Vesela K.、Hansikova H.、Hulkova H、Zeman J.Sco1功能丧失及其与细胞色素的相互作用c（c）氧化酶。美国生理学杂志。细胞生理学。2009;296：C1218–C1226。[公共医学][谷歌学者]
36Jaksch M.、Paret C.、Stucka R.、Horn N.、Muller-Hocker J.、Horvath R.、Trepesch N.、Stecker G.、Freisinger P.、Thirion C.等。细胞色素c（c）由基因突变引起的氧化酶缺乏SCO2公司，编码线粒体铜结合蛋白，在人类成肌细胞中被铜拯救。嗯，分子遗传学。2001年；10:3025–3035.[公共医学][谷歌学者]
37Stiburek L.、Vesela K.、Hansikova H.、Pecina P.、Tesarova M.、Cerna L.、Houstek J.、Zeman J.组织特异性细胞色素c（c）SCO2和SURF1突变导致的氧化酶组装缺陷。生物化学。J。2005年；392:625–632. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Salviati L.、Hernandez-Rosa E.、Walker W.F.、Sacconi S.、DiMauro S.、Schon E.A.、Davidson M.M.补充铜可恢复细胞色素c（c）患者培养细胞中的氧化酶活性SCO2公司突变。生物化学。J。2002;363:321–327. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Freisinger P.、Horvath R.、Macmillan C.、Peters J.、Jaksch M.线粒体铜结合蛋白Sco2缺乏患者肥厚性心肌病的逆转：铜是否有潜在影响？J.继承元。数字化信息系统。2004;27:67–79.[公共医学][谷歌学者]
40Cobine P.A.、Pierrel F.、Winge D.R.将铜贩运到线粒体并组装铜金属酶。生物化学。生物物理学。《学报》。2006;1763:759–772.[公共医学][谷歌学者]
41Williams S.L.、Valnot I.、Rustin P.、Taanman J.W.细胞色素c（c）COX10、SCO1或SURF1突变患者成纤维细胞培养物中的氧化酶亚群。生物学杂志。化学。2004;279:7462–7469.[公共医学][谷歌学者]
42Taanman J.W.，Williams S.L.细胞色素组装c（c）氧化酶：我们能从细胞色素患者身上学到什么c（c）氧化酶缺乏？生物化学。社会事务处理。2001年；29:446–451.[公共医学][谷歌学者]
43Comi G.P.、Bordoni A.、Salani S.、Franceschina L.、Sciaco M.、Prelle A.、Fortunato F.、Zeviani M.、Napoli L.、Bresolin N.等。细胞色素c（c）运动神经元病患者的氧化酶亚基I微缺失。安。神经。1998;43:110–116.[公共医学][谷歌学者]
44Bruno C.、Martinuzzi A.、Tang Y.、Andreu A.L.、Pallotti F.、Bonilla E.、Shanske S.、Fu J.、Sue C.M.、Angelini C.等。人类线粒体DNA细胞色素中的终止密码子突变c（c）氧化酶I基因破坏复合物IV的功能结构。Am.J.Hum.遗传学。1999;65:611–620. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Rahman S.、Taanman J.W.、Cooper J.M.、Nelson I.、Hargreaves I.、Meunier B.、Hanna M.G.、Garcia J.J.、Capaldi R.A.、Lake B.D.等。细胞色素氧化酶亚基II的错义突变导致组装缺陷和肌病。Am.J.Hum.遗传学。1999;65:1030–1039. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Campos Y.、Garcia-Redondo A.、Fernandez-Moreno M.A.、Martinez-Pardo M.、Goda G.、Rubio J.C.、Martin M.A.、del Hoyo P.、Cabello A.、Bornstein B.等人。线粒体DNA无义突变引起的早期多系统线粒体紊乱细胞色素c氧化酶Ⅱ基因。安。神经。2001年；50:409–413.[公共医学][谷歌学者]
47Budde S.M.、van den Heuvel L.P.、Janssen A.J.、Smeets R.J.、Buskens C.A.、DeMeirleir L.、van Coster R.、Baethmann M.、Voit T.、Trijbels J.M.等。与核编码突变相关的酶复合物I和III联合缺失NDUFS4型基因。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。2000;275:63–68.[公共医学][谷歌学者]
48McKenzie M.、Lazarou M.、Thorburn D.R.、Ryan M.T.Barth综合征患者线粒体呼吸链超复合体不稳定。分子生物学杂志。2006;361:462–469.[公共医学][谷歌学者]
49Acin-Perez R.、Fernandez-Silva P.、Peleato M.L.、Perez-Martos A.、Enriquez J.A.呼吸活性线粒体超复合物。分子细胞。2008;32:529–539.[公共医学][谷歌学者]
50Srere P.柠檬酸合成酶。方法酶制剂。1969;13:3–11. [谷歌学者]
51Birch-Machin M.A.、Briggs H.L.、Saborido A.A.、Bindoff L.A.、Turnbull D.M.人体骨骼肌线粒体呼吸链复合物I–IV活性测量的评估。生物化学。医学元。生物。1994;51:35–42.[公共医学][谷歌学者]
52DiMauro S.、Servidei S.、Zeviani M.、DiRocco M.、DeVivo D.C.、DiDonato S.，Uziel G.、Berry K.、Hoganson G.、Johnsen S.D.细胞色素c（c）Leigh综合征中的氧化酶缺乏。安。神经。1987;22:498–506.[公共医学][谷歌学者]
53Sciaco M.、Bonilla E.组织切片中线粒体的细胞化学和免疫细胞化学。方法酶制剂。1996;264:509–521.[公共医学][谷歌学者]
54Schägger H.，von Jagow G.蓝色天然电泳，用于分离酶活性形式的膜蛋白复合物。分析。生物化学。1991;199:223–231.[公共医学][谷歌学者]
55克劳利J.N。我的老鼠怎么了？转基因和敲除小鼠的行为表型。纽约：威利-莱斯；2000年，第47-64页。[谷歌学者]
文章来自人类分子遗传学由以下人员提供牛津大学出版社