核酸研究。2009年11月；37（21）：e141。
PiggyBac公司发育中鸡脊髓的转基因策略
美国西北大学生物化学、分子生物学和细胞生物学系，伊文斯顿，IL60208
2009年4月29日收到；2009年8月3日修订；2009年8月4日接受。
- 补充资料
【补充资料】
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摘要
鸡脊髓是研究脊椎动物早期神经发育的极好模型。然而，缺乏强健、稳定和通用的转基因方法限制了鸡胚在研究后期神经发育事件中的作用。这里我们描述了一种利用PiggyBac公司（PB）转座子，用于分析后期神经发育，例如鸡胚中的轴突靶向和突触连接。使用PB转基因方法，我们实现了转基因表达的时间和空间调控，并执行了稳定的RNA干扰（RNAi）。利用这些新功能，我们绘制了脊髓中间神经元V2b亚群的轴突投影模式，并可视化了神经肌肉接头（NMJ）的成熟。此外，鸡中PB介导的RNAi再现了小鼠NMJ中农业蛋白功能丧失的表型。PB介导的转基因策略的简单性和多功能性为小鸡神经元连接的大规模遗传分析提供了很大的希望。
简介
表现出高度复杂突触的神经元细胞类型的巨大多样性给定义脊椎动物中枢神经系统中促进特定突触连接组装的分子机制带来了重大挑战。与遗传动力不同，例如黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫脊椎动物模型生物在很大程度上缺乏适当的遗传工具来分析神经元连接。最近的开创性研究证明了使用荧光蛋白标记的遗传镶嵌分析小鼠神经元连接的可行性和实用性(1–5). 然而，这些方法需要产生单个转基因小鼠系，因此不适合高通量分析。
鸡胚因其易得性和易用性，被广泛用于研究早期胚胎发生(6). 在过去的十年中，在ovo中电穿孔和禽重组逆转录病毒表达系统在理解神经发生、模式化和迁移等早期神经发育事件方面取得了巨大进展(7–13). 相比之下，由于这些方法的技术局限性，在分析轴突靶向和突触形成的后期发展方面的进展相对较少。为了克服这些限制并提高鸡胚遗传分析的吞吐量，我们旨在开发一种简单、高效和稳定的转基因方法来研究发育中的鸡脊髓中的基因功能。
PiggyBac公司（PB）是一种高效转座子，最初从尼旋毛虫(14). PB随后被证明在包括苍蝇和小鼠在内的许多不同物种中具有功能(15,16). 精确的“剪切和粘贴”转座机制使PB成为诱变和转基因操作的有力工具(16–22). 与重组逆转录病毒系统不同，PB可以容纳相对较大的DNA片段而不影响转座效率(16). 此外，PB与其他转座子系统相比有两个潜在优势，例如睡眠美容（SB）和Tol2（公差2）首先，PB在哺乳动物细胞中表现出明显更高的转座效率(23). 第二，PB的多个拷贝可以并入宿主基因组(16,21)提供了对宿主基因组进行多次同时操作的可能性。出于这些原因，我们决定开发PB介导的转基因方法，以促进脊髓神经元连接的分析。
这里我们展示了，结合在ovo中电穿孔，PB介导的转基因对鸡胚是高效的。PB转基因方法与异源启动子和Cre/loxP公司能够对转基因表达进行时间控制和细胞类型特异性标记的技术。此外，PB转基因稳定地表达小发夹RNA（shRNAs），使鸡能够进行稳健的功能丧失分析。作为原理证明，我们总结了在鸡体内使用shRNAs在agrin突变小鼠中观察到的神经肌肉接头（NMJ）缺陷。因此，PB转基因是一种有效且通用的方法，可用于脊椎动物神经系统的大规模电路图绘制和功能分析。
材料和方法
质粒构建
本研究中使用的所有表达载体都是通过克隆经酶切或PCR扩增的DNA片段以标准方案构建的。萤火虫和Renilla荧光素酶表达载体最初来自普罗米加.EGFP公司，不稳定GFP公司和Ds红色矢量来源于Clontech公司(pEGFP-N1、pd2EGFP、pDsRedN2). 这个PiggyBac公司和PBase表达载体如前所述(21).pCYL50型以含有多个克隆位点的PB载体作为亲本质粒构建所有PB衍生物。在人类下游克隆了编码shRNAs的退火双链寡核苷酸上半年PB载体中BbsI和XhoI位点之间的启动子。要构造CMV-Ffluc-agrin病毒报告员，用RT-PCR从HH 30鸡神经元RNA中扩增出一个650 bp的cDNA片段，该片段对应于交替剪接的鸡agrin转录物的共享外显子。然后在引物序列中用EcoRI和NotI消化这个agrin cDNA片段，并克隆到CMV-Ffluc公司矢量。本研究中的所有载体总结如下补充表S1所有克隆均通过完整或部分测序进行验证。
细胞培养和转染
将DF-1鸡成纤维细胞保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中。用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞。测试的相对击倒效率阿格林shRNAs、DF-1细胞在24孔板中与CMV-Ff-葡聚糖报告子（0.3µg/孔），雷尼拉·卢克（0.1µg/孔）和针对鸡agrin的单个效应器shRNAs（0.3µg/m孔）。对于荧光素酶试验，每2天传代一次转染细胞，并在被动裂解缓冲液（PLB，Promega）中收获。
Splinkerette PCR
为了确定鸡细胞中的PB转座位点，使用Lipofectamine 2000方案，在六孔板中以2:1的比例用PB-PGK-Hyg和PBase转染DF-1细胞。转染后24小时，5×104用海格霉素（300µg/ml）将细胞接种在10 cm的培养皿上，直到可见的克隆生长。从单个克隆中制备基因组DNA，并按照前面所述进行Splinkerette PCR(21,24). 采用TA克隆独特的PCR产物进行测序。
鸡胚电穿孔
在ovo中如前所述进行电穿孔(25,26). 简言之，在电穿孔之前，将受精的白色莱霍姆鸡蛋在38°C下孵育至HH阶段12。将质粒混合物注入神经管的中央管，在脊髓的胸椎段进行电穿孔，5次25 V脉冲，每次50 ms。对于电穿孔，将无内毒素质粒DNA（4µg/µl）与1/10体积的固绿混合用于微量注射。对于PB转座，所有实验中都使用了2:1的转座子和转座酶比率。用于激活ERT2核心ERT2将浓度为100 mM的500µl 4-羟基三苯氧胺（4-OHT，Sigma）转基因滴在单个鸡胚上。所有电穿孔实验重复至少三次，多次(6–12)鸡胚。
免疫组织化学和就地杂交
为了进行免疫组织化学，将鸡胚组织解剖并固定在4%多聚甲醛中2小时。在广泛的PBS洗涤和30%蔗糖的低温保护后，将样品嵌入OCT中，并处理12µm的冷冻切片进行间接免疫荧光染色。本研究中使用了以下主要抗体：小鼠抗GATA3（1:100，Santa Cruz）、兔抗Myc（1:2000，Sigma）、小鼠抗Flag M2（1:2000）、小鼠抗胰岛1/2（1:100，DSHB）、鼠抗GFAP（1:1000，Simma）、兔抗LacZ（1:1000、Chemicon）、兔对抗GFP（1:2000、Invitrogen）和山羊抗荧光素酶（Promega）。
现场如前所述进行杂交(27). 将鸡agrin cDNA片段克隆到pCR4-TOPO载体中，并用地高辛11-UTP（Roche）和T7 RNA聚合酶（Roche）标记反义核糖探针。20微米冷冻切片的shRNA电泳鸡胚用于就地杂交，用POD-偶联抗地高辛抗体（Roche）和Cy3-TSA-plus试剂盒（Perkin-Elmer）中的荧光底物显示杂交信号。
NMJ全悬置染色
为了观察腓肠肌中的NMJ，在荧光显微镜下解剖小肌束，并在4°C下用α-银杏毒素结合德克萨斯红（1:5000，分子探针）染色过夜。图像是在蔡司共焦显微镜PASCAL上拍摄的。
结果
PB介导的转基因在发育中的鸡脊髓中的表达
为了测试PB介导的转座在鸡细胞中的效果，我们用表达萤火虫荧光素酶（PB-Ff）的PB转座子和非PB转位子共同转染了DF-1鸡成纤维细胞Renilla荧光素酶矢量(CMV-Rn公司)在转座酶辅助质粒存在下(CAG公司-PBase）或阴性对照(CMV-LacZ公司) (A） ●●●●。PBase辅助质粒利用CAG公司普遍表达PBase的启动子在trans中但由于缺乏来自PB转座子的反向重复，其自身在转染时瞬时表达(21). 双重荧光素酶分析显示Ff公司/卢比PBase共转染细胞的荧光素酶比率在几代后显著增加，表明PB-Ff公司稳定地整合到转染细胞中，而CMV-Rn公司质粒在多次细胞分裂中丢失(B） ●●●●。PB版本的卢比荧光素酶和非PB Ff荧光素酶表达载体（数据未显示）。由于鸟类基因组与哺乳动物有着非常不同的进化历史，我们使用Splinkerette PCR从稳定转染的鸡DF-1细胞中克隆了少量PB转座位点。序列分析证实PB转座子在鸡细胞中整合在相同的TTAA序列(补充表S2). 因此，PB转座子系统可以高效地产生稳定转染的鸡细胞。
鸡胚PB转座。(A类)PB示意图-Ff公司转座子和非PB控制卢比矢量。(B类)PB的稳定集成-Ff公司鸡DF-1细胞中的转座子。PB混合物-Ff公司和卢比将表达载体与PB共转染到DF-1细胞中酶或LacZ公司控件。在转染后的不同时间点，测量并绘制Ff/Rn荧光素酶比值的相对比值。所有数据点均表示为平均值±SEM(n个= 3). (C类)PB的稳定集成-Ff公司发育中的鸡脊髓中的转座子。对发育中的鸡胚进行与（B）中相同的实验(n个= 3–4). 采集电泳神经管进行双荧光素酶分析，数据按（B）所示进行分析。(D类)电穿孔后PB-GFP转基因在鸡神经管中的快速表达。显示的是GFP信号（绿色）和亮场图像的合成图像。”S’表示体节，黄色虚线表示中线。(E类)电穿孔后2天PB-GFP标记鸡胚（E4）的整体外观。自发荧光是伪红色的，以显示胚胎的轮廓。GFP显示为绿色。(F类)PB-GFP在发育中的鸡脊髓中的表达。PB-GFP转基因表达与PBase介导转座的比较。在与PB-GFP和PBase共同电穿孔的鸡胚中，可以看到GFP的稳定持续表达，而在缺乏PBase的对照组中，GFP信号很快丢失。绿色：抗GFP染色。棒材：50µm。
在ovo中电穿孔被广泛用于将转基因瞬时导入鸡胚(9). 因此，我们接下来测试是否可以将PB转座子与在ovo中电穿孔在鸡胚中进行长期转基因研究。用PB电穿孔鸡神经管-Ff公司和CMV-Rn公司第12阶段（胚胎第2天左右）的质粒。PBase的共表达增加Ff公司/卢比发育后期比率约为10倍(C） 表明PB转基因已稳定整合到宿主基因组中。
为了测试更高的荧光素酶活性是由更多的表达细胞还是每个细胞更高的表达水平引起的，我们构建了一个表达不稳定GFP蛋白的PB。当与PBase共同引入时，电穿孔鸡脊髓快速且高度标记GFP(D和E）。在早期发育阶段，由于瞬时转染，在PB和非PB转基因胚胎中都可以看到稳健的GFP标记。在胚胎发育过程中，PB-GFP电穿孔脊髓始终被GFP强烈标记，而随着发育到后期，PBase阴性鸡胚中几乎没有GFP标记细胞(F） ●●●●。虽然我们在电穿孔2天后常规获得了近80–90%的GFP标记细胞，但电穿孔效率在单个胚胎中略有不同。为了排除电穿孔效率的差异可能导致在F、 我们在PB或非PB载体中共同表达Myc-tagged和Flag-taged不稳定GFP。在胚胎发育过程中，来自PB载体的标记GFP信号比来自非PB对照的信号更稳定(补充图S1). 在PB-GFP标记的半脊髓索中，GFP阳性细胞既包括室管膜区的祖细胞，也包括地幔区和边缘区的有丝分裂后细胞(F和补充图S1). 相反，在非PB转基因样本中，GFP阳性细胞通常在发育后期集中在腹侧运动神经元中(F和补充图S1). 因此，PB-介导的转座使转基因在发育中的鸡脊髓的不同细胞类型中持续表达。
接下来我们评估了PB是否-介导的转位对脊髓发育有不利影响。无论胚胎是与PB-GFP转座子和PBase共电穿孔还是仅与PB-GFP转座物共电穿孔，电穿孔后第4天大约90%的胚胎存活。前体标记（Sox2）、运动神经元标记（Islet 1/2）、中间神经元标记（Nkx2.2）和分化标记（NF）的免疫染色表明，PB-GFP转基因的稳定整合不会改变E8或E20脊髓发育(补充图S2)从而使我们能够进一步探索PB在鸡脊髓中的应用。
PB转基因表达的时间调控
转基因表达的结构性早期激活可能会妨碍对晚期发育事件的分析。因此，我们决定使用之前描述的ERT2核心ERT2-液氧磷诱导系统(28). 由于PB转座子的多个拷贝可以同时整合到宿主基因组的不同位点，我们构建了两个独立的PB转位子来表达ERT2核心ERT2并用牙线清洁GFP公司分别是记者(A） ●●●●。通过将这两个带有PBase的PB转座子导入鸡脊髓，ERT2核心ERT2-介导性切除导致在特定发育阶段通过4-OHT给药严格控制GFP的表达(B） 几乎没有观察到GFP的泄漏表达。4-OHT诱导后残留的红色荧光信号可能是由于DsRed蛋白的稳定性(B） ●●●●。当用Ff-luc荧光GFP报告员，4-OHT治疗7天后，Ff-luc信号大多消失(补充图S3). 因此，我们的结果表明ERT2核心ERT2-液氧磷基于PB的二元系统可以有力地调节鸡胚中转基因表达的开始。
PB转基因表达的时间控制。(A类)ERT2CreERT2调节转基因表达。4-OHT诱导后，切除弗洛伊德DsRed导致EGFP的表达。(B类)实验设计方案。EP：电穿孔。(C类)在发育过程中，GFP的表达受到4-OHT诱导的严格调控。棒材厚度为100µm。
PB转基因表达的细胞类型特异性控制
标签特异性细胞类型的方法对于神经发育的遗传学研究是非常可取的。因此，我们询问是否可以在发育过程中使用PB转座子系统标记特定的细胞类型。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种中间丝蛋白，几乎只在星形胶质细胞中表达。GFAP通常在胚胎发育后期开始表达。因此，在鸡脊髓中，GFAP的表达在E15处是可检测的，并且在E19和E21处变得更加强烈(B、 左侧面板）。3kb上游序列绿色食品添加剂不同脊椎动物物种的基因高度保守绿色食品添加剂已知启动子可以在不同物种间直接表达星形胶质细胞特异性(29). 由于GFAP在发育较晚的星形胶质细胞中表达，传统的质粒电穿孔不太可能产生细胞特异性表达(B、 中间面板）。因此，我们构建了一个PB转座子，其中GFP受2.7-kb小鼠的控制绿色食品添加剂发起人(A） ●●●●。当通过PBase电穿孔引入时，GFP的稳健表达与内源性GFAP相伴随(B、 右侧面板）。所有GFP阳性细胞内源性GFAP阳性(C） ；然而，并非所有的GFAP细胞都对GFP呈阳性反应。这可能是因为电穿孔后PB转座率<100%。或者，近端GFAP启动子可能缺乏GFAP表达细胞子集的额外调节元件。因此，PB-gfap-GFP在鸡脊髓中以星形胶质细胞特异性的方式表达，证明了PB转座子在实现细胞型特异性转基因表达方面的效用。
用PB转基因标记星形胶质细胞。(A类)鼠标示意图gfap公司基因与PB-绿色荧光蛋白-EGFP转基因。(B类)PB（聚丁二烯）-绿色荧光蛋白-EGFP特别标记脊髓发育后期的GFAP阳性细胞。在E19或E21，在星形胶质细胞所在的区域中可以看到强大的GFP信号。(C类)高分辨率图像显示，GFP在脊髓灰质和白质的GFAP阳性星形胶质细胞中共同表达。注意GFP和内源性GFAP信号在GFP阳性细胞中并不完全重叠，因为它们的亚细胞定位不同。棒材为50µm in（B）。
明确脊髓中不同神经元亚型的转录因子已被很好地描述(30–33). 许多细胞型特异性转录因子在特定发育阶段的前体细胞亚群中瞬时表达。在发育后期，特定转录因子的表达可能会被关闭，或不再局限于特定的神经元亚型。因此，我们接下来开发了一个Cre-loxP公司基于标记特异性神经元亚型的策略。在这种设计中，使用细胞类型特异性启动子来驱动克里在祖细胞子集中瞬时表达。于克里表达、切除漂浮的报告基因PB转基因在子细胞中产生永久性标记，用于细胞谱系分析(A） ●●●●。已经证明干细胞白血病(Scl公司)是一种bHLH转录因子，是脊髓中V2b中间神经元的表达和规范所必需的(34,35). 重要的是Scl公司该基因在鸡和哺乳动物中都有特征(36,37). 因此，为了测试我们的策略，我们构建了一个5英尺Scl-Cre转基因（命名为-7E3/Cre系列)如前所述(36) (A） ●●●●。什么时候？-7E3/Cre系列转基因与a克里PB记者-CAG-loxP-Luc-loxP-EGFP，少数中间神经元被标记为GFP公司在脊髓腹侧(B） ●●●●。因为大多数V2b中间神经元共存Scl公司,GATA2协议和GATA3协议胚胎早期的转录因子和适用于免疫组织化学的Scl抗体尚不可用(34,38)，我们为GATA3协议和GFP证实大多数GFP阳性细胞确实GATA3协议-E6处为正(C） ，表示−7E3/克里在V2b中间神经元中特异表达。
PB介导的脊髓V2b中间神经元标记。(A类)追踪策略Scl公司-利用PB转基因表达细胞系。−7E3/克里由小鼠组成的转基因5英尺单管启动子序列瞬时表达克里在里面Scl公司-表达祖细胞。克里-介导的切除导致PB中GFP的表达-loxP-luc-loxP-EGFP记者。Scl公司-表达细胞被GFP永久标记，因为PB报告子稳定整合在祖细胞中。(B类)GFP表达的激活-7E3/Cre系列转基因鸡脊髓。(C类)GATA3与GFP阳性细胞部分重叠-7E3/Cre系列转基因。(D类)V2b投影模式示意图(Scl公司-表达）脊髓中的中间神经元。标记脊髓方向和面板F a–e共焦图像的焦平面。绿松石：横截面；紫色：纵剖面。(E类)一张单人床Scl公司-脊髓横断切片上GFP标记的表达神经元。(F类)GFP标记V2b中间神经元神经元突起的投射模式。a和b，横截面；c–e，纵截面。蓝色虚线，中线。棒材为100µm英寸（F）。
接下来，我们使用-7E3/Cre系列和PB-CAG-loxP-Luc-loxP-EGFP记者。我们发现，表达Scl的细胞由具有复杂投影模式的异质神经元组成(D–F）。Scl表达细胞的一些神经元突起沿中线反向投射(F： a和b代表横切面，c代表纵切面），而其他V2b轴突似乎沿脊髓同侧的头侧和尾侧投射（见中的红色箭头F： d，表示分支和中的红色星号F： e，对于嘴侧生长锥）。通过直接可视化获得的整体投影图案-7E3/Cre系列标记的神经元与已知的GATA2/3阳性细胞的荧光素底物逆行标记获得的早期同侧轴突投射模式一致(39). 此外，我们的直接GFP标记方法使我们能够观察穿过中线的神经元突起的对侧投射，这是以前在V2b中间神经元中没有发现的。因此，结合PB-用鞭子抽打记者，细胞特异性克里转基因为神经元投射模式的可视化提供了一种特异而敏感的方法。
PB介导的鸡脊髓稳定RNAi
siRNA双链或shRNA质粒的瞬时电穿孔已被用于研究早期脊髓发育(40,41). PB转基因的稳定性使我们能够将这一功能丧失研究扩展到晚期神经发育事件。为了便于在鸡胚中使用稳定的RNAi，我们开发了一种PB转座子，该转座子由人类H1启动子组成，用于表达shRNA和CAG-EGFP公司标记转染细胞(A） ●●●●。当PB-CAG-EGFP-H1-luc公司表达对照shRNA的shRNAFf公司荧光素酶稳定转染鸡脊髓，GFP强烈标记支配腓肠肌纤维的运动轴突(B） ●●●●。因为agrin基因敲除导致小鼠出现明显的NMJ缺陷(42)，我们选择agrin作为例子来测试稳定RNAi的有效性。我们针对不同拼接的鸡agrin转录物的共同区域合成了五对agrin shRNAs(43). 使用含有农业蛋白靶序列的萤光素酶构建体，我们筛选了农业蛋白shRNA，并鉴定了最有效的shRNA构建体(补充图S3). 然后我们引入了稳定的PB-agrin-shRNA通过PBase电穿孔将基因导入鸡神经管，RT-PCR和就地杂交技术(C和D）。在E21发育后期，我们通过共聚焦显微镜观察腓肠肌纤维中NMJ的成熟。正如预期的那样，PB对脊髓运动神经元中agrin的敲除-agrin-shRNA导致NMJ形成异常。在阿格林-shRNA表达的样品中，乙酰胆碱受体（AChR）簇在终板带处越来越分散(E、 下部面板）与控件相比(E、 上部面板）。一种稳定的shRNA转基因阿格林能够重现在农业蛋白敲除小鼠中看到的NMJ缺陷。因此，PB-介导的稳定RNAi为对神经发育后期过程（如鸡胚中NMJ的成熟）进行功能丧失研究开辟了一条途径。
使用PB转基因的稳定RNAi。(A类)表达shRNA的PB转座子示意图(B类)支配腓肠肌的运动轴突在E21处标记有GFP。(C类)半定量RT-PCR分析表明，与对照侧（C）相比，电穿孔侧（E）的agrin表达下调阿格林-shRNA电穿孔脊髓。氟-氯shRNA作为阴性对照。图中显示了两个独立的胚胎（1和2）。(D类)现场杂交显示阿格林转录物（红色信号）在脊髓电穿孔侧的心室区和腹角被击倒。DAPI：蓝色。中线用黄色标记，以区分非电穿孔侧和电穿孔侧。(E类)阿格林PB击倒-shRNA诱发腓肠肌NMJ异常成熟。在用电穿孔的鸡胚胎中阿格林shRNA2472，AChR簇在腓肠肌终板带（下面板）处密度较小，而AChR束较大，集中在对照组的神经末梢（上面板）。运动轴突和AChR簇分别通过GFP信号（绿色）和德克萨斯红共轭α-银杏毒素（α-BT）染色（红色）显示。图中显示了从40–50µm肌肉束上采集的2µm图像堆栈的最大强度投影。
讨论
在这项研究中，我们已经表明基于PB的转基因方法是高效和通用的。本文所述的多种PB转基因构建体为实施这项技术提供了一个起点，以对鸡胚中晚期神经发育事件进行功能获得和功能丧失研究。PB转座子在鸡体内具有其他方法无法比拟的优势。首先，与质粒电穿孔不同，PB转座子系统允许稳定、长期表达转基因。其次，PB转座子可以容纳高达18kb的DNA插入，绕过了禽逆转录病毒RCAS系统的DNA大小限制。PB转座子的大容量允许从一个载体独立调节多个转录物。第三，与重组慢病毒系统相比，基于电穿孔的PB转基因方法可以实现非常快速的转基因表达。慢病毒转导的转基因表达通常需要16小时(44). 第四，PB系统与异源启动子和Cre/loxP公司因此允许转基因表达的时间和细胞类型特异性调节。第五，稳定表达shRNAs的PB转基因允许对晚期发育事件进行功能丧失研究。尽管有报告称使用了类似的方法Tol2（公差2）鸡胚转座子系统(45–47)SB和PB转座子的比较表明，PB是培养哺乳动物细胞中最有效的转座子(23)和鸡细胞（数据未显示）。总的来说，这些特性使这种基于PB的转基因系统优于其他用于鸡神经发育遗传分析的方法。PB系统的多功能性使其很容易适用于研究小鸡的其他神经回路，如小脑或视觉系统。事实上，PB载体已成功用于表达大型cDNA，如DSCAM公司和配角小鸡视网膜(48).
当PB转座子与Cre-loxP公司重组，一个担忧可能是克里可能导致有害的染色体缺失、反转和多重染色体之间的易位液氧磷-包含整合到基因组中的转座子。然而，由于三个原因，这似乎不是一个大问题。首先，虽然很难确定有丝分裂后脊髓神经元中每个细胞的PB转座子数量，但通过滴定PB和PBase表达载体的数量来控制整合位点的数量是可行的(21). 其次，PB转座子在整个基因组的64～68条鸡染色体中随机整合。因此，可能会有多个PB集成在trans中之前已经表明Cre-loxP公司复合在trans中效率非常低，频率为顺式-重组事件(49,50). 因此，克里-诱发染色体异常应该是罕见的。第三，复杂池中的单个转染细胞可能具有完全不同的PB整合位点，因此只有极少数转染细胞才会发生罕见的染色体异常。在实际水平上，这可以通过增加样本量来克服。
有几个途径可以扩展PB系统的实用性。例如，结合其他基因传递方法，子宫内电穿孔(51)PB转座子也可用于在小鼠胚胎中实现稳定或细胞特异性转基因表达。因为PB转座子可以容纳大量DNA插入，而且PB载体与BAC重组技术完全兼容(52)，在PB载体中开发一组细胞类型特异性启动子以在发育过程中标记不同的神经元亚型将是有利的。同时，构建各种克里-表达BAC转基因，可与漂浮的PB报告子一起标记特定细胞类型。这些试剂的积累将显著提高我们使用PB转基因方法进行细胞特异性基因操作的能力。
新颖Brainbow公司最近，转基因小鼠已率先通过随机作用组合表达几种荧光蛋白（XFP）来实现单个细胞的颜色编码Cre-loxP公司复合(2). 从概念上讲，类似的PB转座子包括Brainbow公司转基因可用于标记单个神经元与克里-表达转基因（例如PB-CAG-ERT2核心)通过电穿孔在ovo中或子宫内。由于PB可以容纳较大的插入尺寸，因此构建这样的PB是可行的-Brainbow公司转基因。更重要的是，如果成功，PB应用程序可以简化并提高Brainbow公司绘制大脑神经回路的转基因方法。
对于脊椎动物的中枢神经系统，回路图的细节和回路发育的遗传基础在很大程度上已经缺失。最近提出了“连接组学”的概念，将大规模方法应用于神经电路映射(53). 这里描述的PB转基因的发展是对这些努力的工具箱的一个新的补充。
资金
国家卫生研究所(5R01NS051253型)向X.W.开放获取费用拨款：国家卫生研究所(5R01NS051253型)至X.W。
利益冲突声明。未声明。
致谢
作者感谢Joshua Sanes博士、Robert Holmgren博士和Andrew Dudley博士对手稿的批判性阅读和建议。他们感谢A.R.Green博士的老鼠Scl公司启动子结构，C.Cepko博士ERT2核心ERT2Hb9抗体的表达载体和S.Arber博士。
参考文献
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