细胞内吞限制拟南芥晚期胞质分裂期间细胞分裂面上的KNOLLE突触蛋白

cpi1-1；knolle双突变分析表明甾醇和knolle作用于一条通路

为了阐明KNOLLE公司和CPI1公司，我们生成了cpi1-1/+;小丘^X37-2型/+杂合植物。这些自授粉植物没有产生偏离野生型的幼苗后代（0/951），cpi1-1或小丘^X37-2型表型。的增强功能小丘导致早期胚胎死亡的表型，如早期报道的小丘;基尔双突变体(魏策内格等, 2000)未观察到。相反，幼苗的分子基因分型显示小丘^X37-2型发育表型鉴定出31%的植物为cpi1-1；小丘^X37-2型双突变体（13/42）(图2A-C)，表明小丘是上位的消费物价指数1并暗示KNOLLE公司和CPI1公司以共同的方式行动。

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图2

甾醇和KNOLLE共同定位并作用于共同途径。(A类–C类)基因型5日龄幼苗的表型cpi1-1/+;小丘^X37-2型/+杂合子植物（参见补充数据). (A类)野生型（L呃),小丘^X37-2厘米(千牛顿^X37-2型)和cpi1-1. (B类)的特写千牛顿^X37-2型幼苗来自(A类). (C类)cpi1-1;千牛顿^X37-2型双突变体。(D类–O（运行）)胞质分裂结束时，联合检测细胞内不同内膜标记物（绿色）的filipin–sterol荧光（fil；red）和抗KNOLLE免疫荧光标记或荧光蛋白融合。(D类,G公司,J型,M（M）)Filin–甾醇荧光（fil）。(E类)反KNOLLE（KNOLLE）。(H（H）)pRAB-A2a:YFP-RAB-A2a（YFP-RAB-A2a）。(K（K）)pARF1:ARF1-EGFP（ARF1-GFP）。(N个)pRAB-F1:RAB-F1-GFP（RAB-F1-GFP）。(F类,我,L（左）,O（运行）)分别合并左侧两幅图像的图像。(P（P）)在细胞分裂素细胞中，KNOLLE-免疫荧光或荧光素-蛋白标记的内膜隔室之间的定量共定位分析，用与甾醇共定位的隔室百分比（%）表示。数据来自CLSM图像，如(D类–O（运行）)在显微镜物镜的分辨率极限内对两个标记物体的几何中心的共同定位进行评分。数据为每个标记14个细胞的平均值±标准差(n个=14). 标记物为抗KNOLLE（KNOLLE）、pARF1:ARF1-EGFP（ARF1）、pRAB-A2a:YFP-RAB-A2a（RAB-A2a）、pVHA-a1:VHA-a1-GFP。显示优先亚细胞定位并进行颜色编码。

细胞板和内膜室中甾醇和KNOLLE的共定标

随后，我们研究了KNOLLE和甾醇在细胞因子细胞中的共定位，使用filipin III作为3β-羟基甾醇特异性探针，对KNOLLE抗体和内膜系统荧光蛋白标记物进行荧光共标记研究(格雷贝等, 2003). 从细胞膜形成的最早阶段到胞质分裂结束，KNOLLE和甾醇共同定位于细胞板，但在额外的内膜室也观察到了共同标记(图2D-F;补充图1A–I). 我们量化了在两个不同通道中标记的隔间几何中心的共定位，揭示了甾醇和KNOLLE标记隔间的最高共定位程度(图2D–F和P)，与所有其他检测的标记物进行比较(图2G–P;补充图1S–G′). 然而，在filipin–sterol标记和早期内体（EE）之间也观察到了强烈的共定位/反式-高尔基网络（TGN）标记YFP-RAB-A2a(图2G–I和P)和ADP-核糖基化因子1（ARF1）-GFP(图2J–L和P). Filippin–甾醇标记与EE/TGN标记VHA-a1-GFP的共定位较少(图2P;补充图1S–U)，的反式-高尔基马克N个-ST-YFP公司(图2P;补充图1Y-A′)和内侧的-高尔基标记NAG1-EGFP(图2P;补充图1B′–D′)而内质网（ER）标记没有显示出显著的共定位(图2P;补充图1E′-G′;格雷布等, 2003). 空泡前室标志物RAB-F1-GFP和GFP-RAB-F2b（也称为Ara6-GFP和GFP-Ara7；上田等, 2001)证实甾醇与这些Rab5型GTPase共标记(图2M–O和P;补充图1V-X)，但定量分析显示甾醇和KNOLLE以及其他EE/TGN分室标记物之间存在较高程度的共定位(图2P).

丝氨酸-甾醇复合物的超微结构分析显示在TGN、多泡体、细胞板和细胞分裂平面富集

接下来，我们通过透射电镜（TEM）分析观察到了filipin–甾醇标记结构，因为filipin-甾醇复合物在富含甾醇的膜上诱导了特定的20–30 nm的膜变形，这可以在不同的真核细胞中看到(奥西等, 1981;米勒，1984年;格雷布等, 2003). 我们早些时候在拟南芥根表皮细胞(格雷布等, 2003). 对细胞分裂素根细胞的分析显示，在未融合的细胞膜上有明显的20–30 nm变形(图3A和B)和细胞分裂平面上完全融合的细胞板(图3C). 相比之下，固定剂中不含菲利平的对照细胞膜没有显示变形(图3E-G). 引人注目的是，菲律宾标记样品的TGN从反式-最高尔基池(图3A和D)与显示预期TGN囊泡光滑形态且未受影响的对照细胞相比反式-多数高尔基体池(图3H). 相反，菲利平治疗既不影响顺式-和内侧的-高尔基池(图3D和H)、nor ER和核膜(图3C、D和I)而多泡体（MVB）的外膜明显变形(图3I)与未处理样品中MVB的光滑膜相比(图3J). 这些观察结果证实了从filipin–甾醇荧光显微镜获得的结果，显示在TGN处有较强的filipin-甾醇复合物积累，反式-高尔基和MVB与内侧的-和顺式-这些结果与甾醇在高尔基体池中的非均匀分布具有显著的相似性(奥西等, 1981)哺乳动物细胞内吞途径中甾醇的富集(莫比乌斯等, 2003). 因此，我们的研究结果表明，甾醇在整个植物内膜系统中呈分级积累，揭示了甾醇和KNOLLE在TGN/EE、细胞板和细胞分裂平面上的高度共定位。

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图3

在形成和融合细胞板、TGN和MVB处对filipin–sterol复合物进行超微结构检测。(A类–J型)化学固定的细胞因子表皮细胞80nm超薄切片的TEM图像拟南芥嵌于丁苯环氧树脂中的树根(A类–D类,我)菲律宾语标记（+fil）。(E类–H（H）,J型)二甲基亚砜溶剂，不含filipin（−fil）。(A类–C类)注意，20–30 nm的filipin–甾醇复合物变形反式-高尔基网络（tgn）、未融合的细胞膜/囊泡（cp）和细胞分裂平面上的融合细胞膜（cdp），与(E类–G公司)未经filipin处理的样品中的光滑膜。(D类)与(H（H）)未经filipin处理的样品中的光滑高尔基（g）膜。(我)多泡体（mvb）膜和质膜（pm）上的鱼肝素-甾醇复合物。(H（H）,J型)未经filipin处理的样品中的光滑tgn和mvb膜。(A类–J型)内质网（er）、er-body（erb）、微管（mt）、细胞核（nu）、微微管（mt）、线粒体（mi）、液泡（v）。比例尺为500 nm。

KNOLLE不富含耐洗涤剂的膜组分

研究表明，酵母细胞中的TGN能够将甾醇和鞘脂以及特定的蛋白质货物分类到PM中(克莱姆等, 2009). 由于甾醇和KNOLLE在TGN和细胞膜上的共同定位，我们研究了KNOLLE在耐洗涤剂膜（DRM）中的潜在富集，DRM被认为含有甾醇和鞘磷脂富集的微域，有时被称为“脂筏”或“膜筏”(Simons和Ikonen，1997年;蒙格兰德等, 2004;博纳等, 2005;派克，2006;Zappel和Panstruga，2008年;Boutté和Grebe，2009年). 膜筏有助于膜的横向分隔(Simons和Ikonen，1997年;派克，2006)，但他们体内存在和体内植物膜的功能仍然没有得到很好的解决(Zappel和Panstruga，2008年;Boutté和Grebe，2009年). 我们从拟南芥细胞悬浮培养，使用不同比例的洗涤剂Triton-X-100和TM蛋白进行DRM提取，并通过蔗糖密度梯度离心分离DRM部分(博纳等, 2005). 随后，我们通过用针对富含DRM的PM-H的抗体检测蛋白印迹来分析蛋白质含量⁺-ATP酶与DRM缺失的ER伴侣蛋白BiP(蒙格兰等, 2004;博纳等, 2005). 此外，我们产生了一种特异性检测整合膜蛋白SMT1的抗血清，该蛋白在免疫荧光共标记研究中与ER标记物共定位(补充图2). 与PM-H相比⁺-ATP酶与BiP和SMT1相似，与SMT1和BiP的比率为8时相比，KNOLLE在中等洗涤剂与蛋白质比率为4时从DRM中耗尽，略少耗尽，但与TM或模拟处理组分相比，KNOLLE不富集(图4;补充图3). 因此，对“脂筏”中KNOLLE定位的干扰不太可能解释其在改变的甾醇组成上观察到的PM横向定位错误。

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图4

KNOLLE不富含DRM馏分。提取自拟南芥细胞悬浮培养。从总膜（TM）部分、Triton-X-100（TX-100）洗涤剂/蛋白质比0（R0）下模拟提取的漂浮部分、以比4（R4）和比8（R8）萃取后的DRM部分中装载等量的膜蛋白（4μg）。针对富含DRM的标记蛋白PM-H KNOLLE的抗体⁺ATP酶（DRM）、DRM缺失（非DRM）蛋白BiP和SMT1。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。

cpi1-1突变并不明显增强PM的KNOLLE侧向扩散或分泌靶向性

为了解决甾醇成分可能影响KNOLLE从细胞分裂平面到侧膜的迁移率的可能性，我们通过荧光回收后光浸出（FRAP）实验分析了KNOLLE的横向迁移率。为此，我们使用表达功能性GFP-KNOLLE蛋白的幼苗，该蛋白可以拯救小丘突变表型(莱查特等, 2007). 在细胞分裂平面上2μm膜区内GFP-KNOLLE的光浸出过程中，FRAP发生在该区域(图5A-C). 恢复速度略快于用能量抑制剂（叠氮化钠和2-脱氧）培养的根系-D类-葡萄糖）(图5A-C)它废除了依赖能源的交通，并允许评估扩散对横向流动的贡献(男人等, 2008). 类似地，当细胞分裂平面的膜在与蛋白质生物合成抑制剂CHX或能量抑制剂和CHX孵育的根中完全漂白时，能量抑制剂处理的细胞的恢复较慢(补充图4A-C). 我们推断，膜转运和侧向扩散都有助于GFP-KNOLLE在细胞分裂平面上的荧光恢复，因为能量抑制剂处理的根显示出显著减少，但仍有大量恢复(图5C;补充图4C).

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图5

细胞视平面的KNOLLE横向扩散在cpi1-1突变体。(A类–N个)FRAP分析与(D类–K（K）)GFP-KNOLLE荧光的FLIP分析。(A类,B类,D类,E类,G公司,我,J型,L（左）,M（M）)漂白前（预）、漂白后（后）和随后在时间点以分钟为单位获取的漂白后图像。方框表示漂白剂ROI。(A类–C类)细胞分裂平面上2μm ROI漂白后的FRAP分析(A类)野生型（wt）或in(B类)野生型，与能量抑制剂（-e）、0.02%叠氮化钠、50 mM 2-脱氧预培养45分钟后-D类-葡萄糖（wt-e）。(C类)实验的定量分析，如(A类,B类)显示漂白后图像采集间隔30s内恢复时间点漂白前和漂白后荧光强度的标准值。数据为14个单元格的平均值±标准差(n个=14). (D类,E类)GFP-KNOLLE在胞质分裂结束时脱色，细胞分裂平面的荧光除外，表现为野生型（wt、+/+和cpi1-1/+)来自cpi1-1/+;GFP-KNOLLE公司工厂。(D类)45分钟，50μM CHX（wt CHX）。(E类)45分钟，50μM CHX，-e（wt CHX-e）。(F类)实验的定量分析，如(D类,E类)在CHX或CHX，-e应用下，分别用于细胞直径平面（CP）膜上的FLIP和外质膜（PM）上的FRAP。数据为10个单元格的平均值±标准差(n个=10). (G公司)作为E，但在cpi1-1;GFP-KNOLLE公司背景(cpi1-1CHX-e）。(H（H）)实验的定量比较，如(E类,G公司)对于CP处的FLIP和PM处的FRAP，数据为10个单元格的平均值±s.d(n个=10). (我,J型)GFP-KNOLLE在细胞分裂平面上的漂白(我)野生型和(J型)cpi1-1突变体均预处理45分钟，50μM CHX，-e（wt CHX-e）。(K（K）)实验的定量比较，如(我,J型)对于PM处的FLIP和CP处的FRAP，数据为七个单元格的平均值±s.d(n个=7). (L（左）,M（M）)GFP-KNOLLE FRAP完全漂白(L（左）)cpi1-1/+或+/+和（M）cpi1-1细胞。(N个)FRAP实验的定量比较，如(L（左）,M（M）). 数据为10个单元格的平均值±标准差(n个=10). (O（运行）–问)L细胞晚期细胞因子细胞的KNOLLE免疫荧光定位（红色）呃有或没有抑制剂处理的幼苗根系。DAPI DNA染色（蓝色）。(O（运行）)我呃. (P（P）)L（左）呃30分钟，50μM CHX。(问)L（左）呃，30分钟，50μM CHX-e。所有标尺为5μM。

与天然的KNOLLE相比，在胞质分裂后的PM中还发现了GFP-KNOLLE(图5A) (莱查特等, 2007). 我们利用这一特性来研究GFP-KNOLE从细胞分裂平面到侧膜的潜在迁移率。我们在胞质分裂结束时漂白了新形成的子细胞的GFP-KNOLLE荧光，但细胞分裂平面的荧光除外(图5D、E和G). 随后，我们监测了PM处的FRAP和细胞分裂平面上的荧光损失光漂白（FLIP）(图5D–H). 这些实验是在用CHX预处理的根上进行的(图5D和F)监测GFP-KNOLLE在缺乏蛋白质生物合成的情况下的横向迁移。我们还检查了CHX和能量抑制剂预处理对评估GFP-KNOLLE横向扩散的影响(图5E和F). 在这两种处理中，FRAP从细胞膜接触PM的部位开始，荧光逐渐扩散到侧膜，直到其在整个PM上恢复(图5D和E). 在用CHX或CHX和能量抑制剂处理的细胞中，PM的FRAP和细胞分裂平面上的FLIP紧密互补(图5F)强烈提示GFP-KNOLLE通过侧向扩散从细胞分裂平面迁移。我们没有观察到野生型和野生型GFP-KNOLE的FLIP或FRAP之间的差异cpi1-1CHX和能量抑制剂处理的突变细胞(图5E、G和H). 同样，FLIP和FRAP动力学监测横向扩散在野生型和cpi1-1在细胞分裂平面的细胞膜上荧光被漂白的突变细胞(图5I、J和K). 因此，当膜转运被阻断时，改变甾醇组成不太可能直接影响GFP-KNOLLE横向扩散的速率。此外，我们没有观察到野生型和cpi1-1GFP-KNOLLE荧光完全变白的突变细胞(图5L–N)表明GFP-KNOLLE的分泌贩运在突变株中没有受到实质性影响。综上所述，我们的发现表明GFP-KNOLLE可以通过侧向扩散从细胞分裂平面移动到PM，反之亦然，而这并不是就其本身而言似乎在cpi1-1突变体。

增强的GFP-KNOLE横向扩散可能很难在cpi1-1突变体，因为功能性GFP-KNOLLE与天然内源性KNOLLE蛋白不同，已经在野生型中显示出一些PM定位。因此，我们比较了GFP-KNOLLE和附加分子、小苯乙烯基染料FM4-64、小整体PM蛋白EGFP-LTI6a和较大的功能性PIN2-EGFP蛋白在晚期细胞分裂素细胞侧膜的4μm区域的横向扩散。通过采用这种方法，我们涵盖了这些分子显示的大范围横向扩散速率(补充图4D). 然而，它们中没有一个在cpi1-1型与野生型相比，突变体(补充图4E–P)表明不同分子的横向扩散不是就其本身而言在中增强cpi1-1突变背景。

为了探索天然内源性KNOLLE是否可以侧向扩散，我们检测了其在CHX或CHX和能量抑制剂处理的根中的定位。与未经处理和CHX处理的根细胞相比(图5O和P)，我们在CHX加能量抑制剂处理的根细胞中观察到KNOLLE横向错位(图5Q). 与PIN2和DRP1A-GFP相比，KNOLLE侧向定位似乎对能量抑制特别敏感，后者在同一时间内没有侧向定位(补充图5A-L和M-U)，而在应用能量抑制剂后，细胞分裂平面中的YFP-RAB-A2a荧光迅速降低(补充图5V-D′)，这与这种小Rab GTPase以GTP结合形式与膜结合的观点一致。我们的结果表明，天然KNOLLE可以向侧膜扩散，而侧膜通常似乎由能量依赖机制（如内吞运输）进行补偿。

在cpi1-1突变株中，胞质分裂末期的KNOLLE内吞作用发生改变

内吞示踪剂FM4-64在发育中的细胞板中与GFP-KNOLLE快速共标记(莱查特等, 2007). 应用后不久，FM4-64也与GFP-KNOLLE在CHX预处理细胞（其细胞板刚刚与PM融合）的小的、间断结构中共同定位(图6A–C). 这些内体对内吞再循环抑制剂布雷费尔丁A（BFA；格尔德纳等, 2001;格尔德纳等, 2003;格雷布等, 2003) (图6D–F)施用60分钟后，在较大的“BFA隔室”中诱导GFP-KNOLLE和FM4-64的共同积累(图6G–I). 我们随后分析了CHX和BFA处理细胞中天然KNOLLE的行为。治疗60分钟后，KNOLLE免疫荧光在细胞分裂平面上降低，但在野生型和cpi1-1型胞质分裂晚期突变(图6J–M). 在BFA处理60分钟后，细胞分裂面上的相对KNOLLE荧光与细胞内隔间中的标记物的比率显著降低，这在数量上反映出来(图6N). 与野生型相比(图6K)，更多的KNOLLE标记保留在细胞分裂平面cpi1-1应用BFA后60分钟突变(图6M)，这反映在cpi1-1与野生型相比，突变体(图6N). 以及在中观察到的FM4-64和PIN2内化缺陷cpi1-1突变体(男人等, 2008)这些发现表明，在胞质分裂结束时，KNOLLE内吞需要正确的膜甾醇组成。

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图6

在胞质分裂末期，KNOLLE通过早期内体内化，但更多地滞留在细胞分裂平面cpi1-1. (A类,D类,G公司)GFP-KNOLLE荧光和(B类,E类,H（H）)FM4-64野生型荧光(C类,F类,我). (A类–C类)用50μM CHX预处理45分钟，用25μM FM4-64脉冲处理5分钟，然后培养细胞，以检测FM4-64内化(D类–F类)6分钟后，以及(G公司–我)用50μM CHX和50μM BFA孵育60分钟。注意GFP-KNOLLE和FM4-64之间的内体共定位（箭头位于C类,F类,我). (J型–M（M）)DNA DAPI染色法检测晚期细胞因子细胞中的抗KNOLLE免疫定位（红色）（蓝色）。(J型)在施用BFA之前，用50μM CHX预处理45分钟后KNOLLE（0分钟）(K（K）)在与50μM CHX和10μM BFA长时间孵育60分钟（60′）后，内化到BFA室并从细胞板上消失。(L（左）)cpi1-1用50μM CHX和(M（M）)用50μM CHX和10μM BFA延长培养60分钟（60′）。注意，KNOLLE位于细胞分裂平面(M（M）)与（K）相比。(N个)细胞视平面（CDP）和内部隔室（IC）的KNOLLE免疫荧光强度的量化(J型–M（M）). 归一化荧光强度比Rn_{CDP/IC（CDP/IC）}（标准化为时间点0）为每个单元格给定。这是通过计算得出的R（右）_{CDP/IC（CDP/IC）}=[KNOLLE在CDP处的平均振幅相对像素强度：长度CDP（μm）]：[KNOLLE标签/区域IC的平均振幅相对像素强度（μm²)]每个单元和归一化R（右）_CDP/IC公司除以平均Rav_{CDP/IC（CDP/IC）}野生型和cpi1-1分别是。完全正确P（P）-从非参数双尾Mann–Whitney获得的值U型-试验在0分钟时为野生型(n个=47）与60分钟时的野生型(n个=30),P（P）<2e-06；cpi1-10分钟时(n个=50）与cpi1-160分钟(n个=49)P（P）<2e-06，60分钟时为野生型(n个=30）与cpi1-1型60分钟(n个=49)P（P）=0.0277，显著性阈值为P（P）<0.05;n个表示对每种基因型或每种处理从18到24个根中分析和获得的胞质分裂结束时表皮细胞的数量。比例尺为5μm。

cpi1-1突变株中KNOLLE阳性、TGN和MVB的甾醇定位发生改变

接下来，我们研究了甾醇与细胞内吞途径（包括KNOLLE阳性结构）的细胞隔室之间的联系cpi1-1突变体。定量共同定位分析(补充图6Q′)发现与filipin–sterol荧光共存的KNOLLE阳性内膜结构百分比较低cpi1-1(补充图1P–R)与野生型相比(补充图1G–I和6Q′). 同样，在cpi1-1突变体，观察到ARF1-GFP与菲利平-甾醇荧光的共定位减少(补充图6A-C、V-X和Q′)和YFP-RAB-A2a-阳性TGN/EE隔间(补充图6D–F、Y-A′和Q′)以及RAB-F1-GFP(补充图6J-L、E′-G′和Q′)和GFP-RAB-F2b阳性的后期内体隔室(补充图6M–O、H′–J′和Q′). 然而cpi1-1与野生型相比，突变细胞没有减少（数据未显示），这表明这一结果不是因为突变背景中的标记效率较低。与此观点一致，NAG1-EGFP标记的高尔基体堆栈与filipin–sterol荧光共同标记的百分比在cpi1-1与野生型相比，突变体(补充图6P-R、K′-M′和Q′)，证实了生物化学研究报告的甾醇在含高尔基的膜组分中的积累对环丙基甾醇异构化的药理干扰(拉卢瓦等, 2007). 因此cpi1-1突变降低了KNOLLE阳性、早期内吞/TGN和晚期内吞/MVB亚群中的甾醇积累，进一步表明该突变的内吞途径存在缺陷。

内吞缺陷型arf1中KNOLLE在外侧颗粒的积聚^T31N型表达植物

为了解决内吞作用改变是否会导致KNOLLE的横向错位，我们采用显性负性方法检测了其在ARF1功能干扰后的亚细胞分布，早先有报道称其影响内吞示踪剂FM4-64的内吞(Xu和Scheres，2005年). 为此，我们分析了表达热冲击诱导显性负性arf1的植物中的KNOLLE定位^T31N型-CFP突变型。与在自身启动子或热激启动子控制下表达野生型ARF1-GFP的根相反(图7A-H和T)，arf1^T31N型-在晚期胞质分裂期间CFP表达导致KNOLLE的侧化错误(图7I–L和T). 与ARF1类似，我们观察到甾醇与EE/循环内胚体Rab11-like RAB-A2a GTPase，以及位于后期内胚体隔室的RAB-F1和RAB-F2b GTPase共同定位，我们想知道RAB-A2b或RAB-F功能的干扰是否会影响KNOLLE和甾醇定位。因此，我们分析了虚拟专用软件9a-2突变体，主要RAB-F鸟嘌呤核苷酸交换因子缺陷(吴等, 2007)以及表达rab-A2a的植物^第125页KNOLLE和甾醇积累的显性-阴性突变版本。与arf1相比^T31N型-CFP根，在表达rab-A2a的根中未观察到PM处的KNOLLE积累^N125I型(补充图7A–F)也不在虚拟专用软件9a-2突变根(补充图7G–L). 然而，令人惊讶的是，rab-A2a和^N125I型表达和vps9a-2版突变体植物在内膜室中共同积累甾醇和KNOLLE(补充图7D–F和J–L)这表明，这些突变并不主要导致PM中KNOLLE内化的缺陷，而是干扰了KNOLLE和甾醇在内胚小室的运输。综上所述，ARF1干扰导致PM内吞示踪剂内化缺陷(Xu和Scheres，2005年)以及在晚期胞质分裂期间KNOLLE的横向错位，进一步表明有缺陷的内化可能导致无法限制KNOLLE的横向扩散。

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图7

ARF1、网格蛋白和动力依赖性内吞作用将KNOLLE限制在细胞分裂平面。(A类–S公司)晚期细胞因子细胞中的KNOLLE免疫荧光标记。(A类–L（左）)KNOLLE免疫荧光（青色）与filipin–sterol荧光（红色）和荧光融合蛋白（绿色）联合标记。(A类–L（左）)表达以下ARF1荧光蛋白融合的热休克处理植物(A类–D类)pARF1:ARF1-GFP（绿色）(E类–H（H）)pHSP:ARF1-GFP（绿色）(我–L（左）)pHSP:arf1^T31N型-CFP（绿色）。(A类,E类,我)filipin–甾醇(B类,F类,J型)抗KNOLLE。(D类,H（H）,L（左）)的合并图像(A类–C类), (E类–G公司)和(我,J型)分别是。(M（M）–S公司)野生L型DNA（蓝色）的DAPI染色与抗KNOLLE免疫荧光（红色）联合标记呃用…处理(M（M）)1小时，DMSO为0.2%(N个)1小时，50μM酪蛋白A23（TyrA23）(O（运行）)1小时、50μM Tyrphostin A51（TyrA51）(P（P）)1小时，50μM TyrA23，然后1小时冲洗（清洗）。(问)野生型Col-0(R（右）)图纸1A^{相对湿度9}, (S公司)图纸1A^{SALK_060977号}(图1A⁶⁰⁹⁷⁷). (T型)定量显示所示基因型或处理的根系中KNOLLE横向错配的晚期胞质分裂细胞百分比。数据为12至18个独立根的平均值±标准差(n个=12–18），每个基因型或治疗分析84–145个细胞。比例尺为5μm。

KNOLLE在酪蛋白A23治疗后的PM和胞吞缺陷型drp1A突变体中积聚

为了研究氯氰菊酯依赖性内吞是否介导KNOLLE内化并将KNOLLE定位限制在细胞分裂平面，我们用酪氨酸酶A23（TyrA23）处理植物，酪氨酸蛋白酶A23是一种抑制内吞物质募集到氯氰菊酯介导途径的抑制剂(奥尔蒂斯·萨帕特等, 2006;Dhonukhe公司等, 2007). 与未经处理的细胞相比(图7M和T;补充图7M–O)，短期TyrA23治疗在晚期胞质分裂中诱导外侧膜KNOLLE错位(图7N和T;补充图7P–R)在用非活性类似物TyrA51处理的细胞中未观察到(图7O和T;补充图7S–U). 此外，这种TyrA23效应在药物洗脱后是可逆的(图7P). 与KNOLLE内化是由氯菊酯依赖性内吞介导的观点一致，KNOLLE在胞质分裂晚期与CLC-GFP显示出实质性的共定位(补充图7V–X).

我们还讨论了KNOLLE定位是否需要动态蛋白DRP1A，因为drp1a突变体在内吞和胞质分裂方面有缺陷(科林斯等, 2008). 与野生型相比(图7Q和T)KNOLLE在drp1a突变体(图7R、S和T)，强烈表明DRP1A介导的氯氰菊酯依赖性内吞作用在胞质分裂晚期限制了KNOLLE定位。

抑制剂处理

在抑制剂试验中，幼苗在含有1×Murashige和Skoog、1%蔗糖、2.5 mM吗啉乙醇磺酸（Sigma）的液体培养基（LM）中处理，pH 5.8。将溶解在二甲基亚砜中的BFA（Sigma）在25μM下使用2小时，或将50μM下用于1小时。将溶解在DMSO中的TyrA23和TyrA51（Sigma1）在50μM条件下使用1小时。通过使用与抑制剂处理样品相同浓度的含有二甲基亚磺酸的LM进行洗脱实验来执行TyrA33（50μM，1小时）。从50 mM水溶液中添加CHX至最终浓度50μM。0.02%叠氮化钠和50 mM 2-脱氧剂处理幼苗-D类-葡萄糖如前所述(男人等, 2008). 将fen（PESTANAL，Sigma）以200 mg/ml溶解在DMSO中。对于fen处理，幼苗在含有0.8%植物琼脂（Duchefa）和200μg/ml fen的上述培养基组成的琼脂平板上生长5天。控制板中含有等量的0.1%二甲基亚砜溶剂。

免疫细胞化学、FM4-64染色和共焦激光扫描显微镜

如所述，使用安装在Leica DM IRE2倒置显微镜上的Leica TCS SP2 AOBS（Leica）光谱CLSM系统，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行整体免疫标记和荧光检测(男人等, 2008). 抗体稀释液为兔抗KNOLLE，1:4000(洗衣工等, 1997); Cy5-coupled，驴抗兔IgG，1:300（Jackson ImmunoResearch）。在GFP-KNOLLE背景中，FM4-64染色是通过在LM中培养幼苗，在25μM的FM4-64（分子探针）（来自DMSO中的10 mM库存）存在下，在冰上培养5分钟来完成的。然后用LM在冰上进行两次清洗，按照规定安装在含有抑制剂的LM介质中的盖玻片上，随后由CLSM进行观察。不同荧光团的激光激发线分别为：费利平-甾醇364 nm，DAPI 405 nm，CFP、GFP和YFP荧光458、488、514 nm，FM4-64和Cy5荧光561 nm。在400–484 nm处检测到荧光发射（对于filipin–sterol），410–484纳米（对于DAPI），505–600纳米（对于CFP），492–557纳米（对于GFP），518–557 nm（对于YFP），600–700纳米（对于FM4-64）和637-750纳米（对于Cy5荧光）。在多标记研究中，检测是以连续的线扫描模式进行的，线平均值为8。油校正63×物镜，NA=1.4（HCX PL APO 63.0×1.40 OI BD UV，徕卡）用于免疫和鱼肝素固醇标记研究。FM4-64检测采用水校正63×物镜，NA=1.2（HCX PL APO 63.0×1.20 W BD UV，徕卡）。根的菲林固醇染色和荧光检测如所述(格雷布等, 2003;男人等, 2008). 图片在Adobe Photoshop CS2中叠加，并在Adobe Illustrator CS2（Adobe）中组装。

菲林-甾醇和免疫荧光联合标记

对于filipin–甾醇和抗KNOLLE联合标记，采用两步filipin-训练程序(格雷布等, 2003)使用时进行了微小修改。在filipin标记后，将根尖一分为二，并让其在聚乙烯上干燥-L（左）-赖氨酸载玻片（VWR国际）。随后，为了优化KNOLLE-抗体标记，引入了以下小修改：将2%的driselase应用45分钟而不是30分钟，并且在随后的膜渗透过程中，DMSO被以1 mg/ml（来自10 mg/ml的储备溶液）溶解在DMSO中的filipin III（Sigma）和IGEPAL（Sigma1）取代包括在3%（v/v）。

FLIP和FRAP分析

FLIP和FRAP分析在早期制定的协议之后进行(格雷布等, 2003;男人等, 2008)，使用上述Leica CLSM和Leica TCS FRAP软件。有关详细说明，请参见补充数据.

DRM分析

DRM提取按所述进行(博纳等, 2005). 简言之，200毫升拟南芥根细胞悬浮培养（Col-0）在25°C的16小时光照/8小时暗周期下生长3天。培养物在1600时通过离心法获得克10分钟后，重新悬浮在两卷均质缓冲液和所述收集的TM中(博纳等, 2005). 使用比钦酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（Termo Scientific）进行蛋白质定量。在100转/分的搅拌下，将2.5 mg TM蛋白与0（比率0）、10 mg（比率4）或20 mg（比率8）Triton-X-100在冰上孵育35分钟。不同比率下的最终体积保持恒定，以便Triton-X100的百分比在比率8下不超过3%。在蔗糖-颗粒离心后，按照说明收集DRM(博纳等, 2005). 使用BCA试剂盒测定DRM蛋白浓度。用SDS-PAGE分离不同组分或提取物中等量的蛋白质，并进行蛋白质印迹。使用以下抗体和稀释液：兔抗KNOLLE，1:4000(洗衣工等, 1997); 小鼠单克隆抗Hsc70抗体，植物ER BiP，1:1000（Nordic Biosite AB）；小鼠单克隆抗体，抗PM-H⁺-ATP酶，克隆46E5B11D5，1:1000(朗汉斯等, 2001); 兔抗SMT1，1:50（见补充数据); 山羊抗鼠IgG-HRP结合物（1:3000，Bio-Rad）；ECL驴抗兔IgG-HRP-连接全抗体，1:8000（Amersham）。使用ECL蛋白质印迹检测试剂盒（Amersham）进行检测。

我们感谢S Bednarek、T Gaude、J Haseloff、W Michalke、B Scheres、K Schumacher、K Schrick和R Williamson分享对本研究重要的已发表研究材料。我们还感谢J Alonso和J Ecker从Salk收集和诺丁汉获得T-DNA插入线拟南芥库存中心进行配送。此外，我们感谢巴莱罗对该文件的有益评论。这项工作得到了瑞典环境、农业科学和空间规划研究委员会（Formas）对MG的资助，以及卡尔·特里格斯基金会对YB的博士后津贴。