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大脑行为免疫。作者手稿；PMC 2011年1月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
大脑行为免疫。2010年1月；24(1): 54–57.
2009年6月9日在线发布。 数字对象标识：10.1016/j.bbi.2009.06.001
预防性维修识别码：项目经理2787978
美国国立卫生研究院：尼姆斯130973
PMID：19520155

睡眠不足激活炎症细胞标记物：性别差异

迈克尔·R·欧文,卡门·卡里略、和理查德·奥姆斯特德
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

睡眠障碍与炎症和相关疾病有关，包括心血管疾病、关节炎和糖尿病。考虑到女性炎症性疾病发病率的性别差异与更强的相关性，本研究旨在测试睡眠不足对促炎细胞因子活性的细胞机制的影响。在26名健康成年人（11名女性；15名男性）中，在基线期间的08:00、12:00、16:00、20:00和23:00以及部分睡眠剥夺后（从晚上11点到凌晨3点清醒），重复评估单核细胞内促炎细胞因子的产生。在睡眠不足一晚后的第二天早上，白细胞介素6和肿瘤坏死因子-α的单核细胞生成在两性之间发生了差异。尽管雌性和雄性在PSD发生后的第二天早上，脂多糖（LPS）刺激的IL-6和TNF-α的产生显著增加，但与雄性相比，雌性在傍晚早些时候和晚些时候这些细胞因子的产生增加。睡眠不足会导致单核细胞炎性细胞因子反应的功能改变，与男性相比，女性表现出更大的细胞免疫激活。这些结果有助于理解睡眠障碍在不同性别炎症性疾病风险预测中的作用。

介绍

流行病学数据表明，睡眠障碍和睡眠时间短对人体健康有不利影响(Gangwisch等人，2007年)和死亡风险(Dew等人，2003年;Gangwisch等人，2008年;Shankar等人，2008年). 虽然睡眠与健康之间的这些联系的生物学基础尚不清楚，但包括心血管疾病、关节炎、糖尿病、某些癌症、肥胖和功能衰退在内的广泛疾病的风险与激活细胞信号有关，这些信号会启动炎性细胞因子的表达(卡林，2005年;沃尔帕托等人，2001年).

研究发现睡眠不足会对炎症机制产生影响。实验性睡眠剥夺导致炎症标记物循环水平升高，如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和C反应蛋白（CRP）(Irwin等人，2004年;Meier-Ewert等人，2004年;希勒等人，2001年). 此外，早晚部分睡眠剥夺（PSD）激活IL-6和TNF-α的细胞表达，对细胞炎性细胞因子表达的上游来源产生影响(Irwin等人，2006年). 此外，睡眠缺失后炎症基因表达的上调(Irwin等人，2006年)是由于核因子（NF）-κB转录控制的激活(Irwin等人，2008年)在控制促炎基因的细胞表达中起关键作用(Pascual and Glass，2006年). 然而，睡眠不足后NF-κB的激活主要发生在女性身上，而不是男性身上(Irwin等人，2008年).

炎症性疾病的患病率存在众所周知的性别差异，女性患关节炎和糖尿病等自身免疫性疾病的可能性是男性的2-9倍(惠塔克，2001). 此外，虽然心血管疾病被认为具有炎症基础，并且男性比女性更普遍，但最近的流行病学数据表明，睡眠障碍和睡眠时间短的主观症状与女性比男性患心血管疾病的风险更大有关，即使在控制了相关混杂因素（如体重指数和体力活动）之后(Cappuccio等人，2007年;纽曼等人，2000年). 此外，苏亚雷斯(苏亚雷斯，2008)最近发现，睡眠质量差和自我报告的睡眠潜伏期延长与女性CRP和IL-6升高有关，而与男性无关。因此，在本研究中，我们试图通过测量Toll样受体4（TLR4）与脂多糖（LPS）连接后单核细胞产生的促炎细胞因子，来确定实验性睡眠不足对炎症反应影响的性别差异。TLR介导对常见病原体的先天免疫反应(库克等人，2004年)TLR活性的异常增加与风湿性关节炎等炎症疾病有关(Andreakos等人，2004年)克罗恩病(Andreakos等人，2004年)和心力衰竭(Satoh等人，2005年).

方法

2006年10月至2008年6月，共招募了26名健康受试者（11名女性和15名男性），这些受试者的健康状况由病史、体检和实验室测试确定。所有受试者均符合诊断和统计手册第四版（SCID）结构化临床访谈确定的从未患有精神病的标准。女性和男性的平均±SD年龄没有差异（37.2±9.6 vs.36.3±10.4岁；t吨= 0.2,P（P）=0.82），教育水平（15.9±1.8 vs.15.3±1.8；t吨= 0.9,P（P）=0.37）平均体重指数[BMI]（23.8±3.8 vs.24.9±3.7；t吨= 0.7,P（P）=0.47），或种族（非白人：36.4%对20.0%；χ2= 0.86,P（P）=0.35）8=26.9[SD=3.6]；35.7%为非白人）。在不将评估限制在月经周期的某一点的情况下，女性和男性的孕酮平均水平没有差异（1.2±0.6 ng/ml vs.1.0±0.6；t吨= 1.1,P（P）=0.30）或雌二醇（67.1±62.3 ng/ml对37.5±9.7 ng/ml；t吨= 1.9,P（P）= 0.08). 过去或现在的Axis I DSM-IV精神障碍、使用精神药物、定期使用非甾体抗炎药以及吸烟都是排除因素。两周睡眠日记证实，受试者通常在22:30至7:30之间睡觉。这项研究得到了加州大学洛杉矶分校机构审查委员会的批准。

受试者参与了在加州大学洛杉矶分校综合临床研究中心（GCRC）进行的PSD方案，如前所述(Irwin等人，2006年). PSD之夜紧随基线之夜，所有受试者白天都在GCRC上接受行为监测，以防止任何打盹行为。在基线检查期间和PSD后的08:00、12:00、16:00、20:00和23:00时，通过留置前臂静脉导管采集血样。因此，在睡眠剥夺前（即基线）共获得5项测量值，在PSD后获得5项额外测量值。血液样本在采集和化验之间在室温下保存，因为我们发现间隔10小时不会影响化验结果；基线和PSD样品在保持时间方面被类似地处理。

使用周蛋白-叶绿素蛋白标记的CD14单克隆抗体、别藻蓝蛋白标记的抗肿瘤坏死因子-a单克隆抗体和藻红蛋白标记的IL-6抗体，通过流式细胞术评估单核细胞内IL-6和TNF-α的产生。(Collado-Hidalgo等人，2006年). 将肝素处理过的血液（1 mL）与100 pg/mL LPS（西格玛，密苏里州圣路易斯）和10 Ag/mL brefeldin A（西格马）混合，并在37°C的平台混合器中培养4小时，然后在4°C下培养过夜。在荧光激活的细胞分选裂解溶液（BD Biosciences）中裂解RBC，将剩余细胞在荧光激活的细胞分选透化缓冲液（BD Biosciences）中透化，并在室温下在黑暗中加入荧光偶联抗体30分钟。然后清洗细胞并将其重新悬浮在1%多聚甲醛中，以便使用Coulter Elite软件在Coulter精英流式细胞仪上进行分析。前向散射和侧向散射用于单核细胞和粒细胞的选通。计算了大约12000个CD14+事件，以确定分泌细胞因子的单核细胞的百分比，象限坐标基于未刺激的单核细胞核设置。为了确定表达TNF-α、IL-6或共同表达TNF--α和IL-6的受刺激细胞的百分比，从受刺激百分比中减去未受刺激的细胞因子阳性事件百分比，以获得净受刺激细胞因子阳性事件百分比。我们以前曾报道过PSD不会改变单核细胞的绝对数量（Irwin等人，1996年）。

统计分析

使用SAS 9.13 for Windows对数据进行分析。为了确定PSD对女性和男性单核细胞内促炎细胞因子表达的影响，采用2（性别：女性，男性）×2（条件：基线，PSD）×5（时间：08:00，12:00，16:00，20:00，23:00 h）设计，对年龄、教育程度、种族、BMI、，孕酮和雌二醇。对表达TNF-α、IL-6的单核细胞或联合表达TNF--α和IL-6的单个核细胞以及聚集物进行分析。

结果

与基线条件相比，部分夜间睡眠剥夺导致单核细胞表达TNF-α和IL-6的能力发生差异性变化，表达TNF--α、IL-6的细胞的条件×时间相互作用，以及TNF-(图1) (F类(4,183)= 3.9,P（P）< 0.01;F类(4,183) = 25.8,P（P）< 0.001;F类(4,183) = 8.2,P（P）< 0.001;F类(4,183) = 5.8,P（P）< 0.001). 值得注意的是，女性和男性在PSD发生后的第二天早上，IL-6和TNF-α的刺激生成量都显著增加，这与我们之前的研究结果一致(Irwin等人，2006年). 对于表达TNF-α、IL-6、共表达TNF--α和IL-6的细胞，时间固定效应显著，总测量值(F类(4,184)= 4.3,P（P）< 0.01;F类(4,184)= 18.7,P（P）< 0.001;F类(4,184)= 21.1,P（P）< 0.001;F类(4,184)= 11.5,P（P）< 0.001). 此外，表达TNF-α、IL-6、共表达TNF--α和IL-6的细胞也存在条件效应(F类(4,184)= 8.2,P（P）< 0.01;F类(4,184)= 15.7,P（P）<0.001；F类(4,184)= 6.8,P（P）<0.01），但不适用于总计量(F类(1,185)= 0.8,P（P）= 0.37).

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脂多糖刺激的CD14+细胞中白细胞介素（IL）6和肿瘤坏死因子-α（TNF）的聚集表达在基线和部分睡眠剥夺PSD条件下的性别差异。在TNF-α和IL-6的聚集表达中发现了一个显著的条件×性别交互作用，其中女性TNF-β和IL-6聚集表达相对增加，而男性则相对减少(F类(1,184)= 13.7,P（P）>0.001）。数据表示为平均值±SEM。

PSD后，单核细胞表达促炎性细胞因子的能力存在性别差异，表达TNF-α、共表达TNF--α和IL-6的细胞存在显著的条件×性别交互作用，以及总的测量值(图1) (F类(1,184)= 3.8,P（P）< 0.06;F类(1,184)= 14.4,P（P）< 0.001;F类(1,184)= 13.7,P（P）>0.001），但不适用于表达IL-6的细胞(F类(1,184)= 0.3,P（P）= 0.84). 其他分析检查了个别时间点的差异反应，发现共表达TNF-α和IL-6的细胞的条件×性别交互作用以及两个时间点的总测量值：20:00(F类(1,19.0)= 9.4,P（P）< 0.01;F类(1,19.0)= 6.0,P（P）<0.05）和23:00(F类(1,19.0)= 4.7,P（P）< 0.05;F类(1,19.9)= 7.4,P（P）<0.05），与男性相比，女性TNF-α和IL-6的联合表达和聚集表达增加。图2显示各个时间点TNF-α和IL-6表达的总测量结果。在8:00、12:00和16:00时，性别之间的反应相似（全部P（P）>0.1）和在所有时间点表达TNF-α或IL-6的细胞（所有P（P）> 0.1). 对于表达TNF-α、IL-6、共表达TNF--α和IL-6的细胞以及聚集物（所有P（P）> 0.1).

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基线（•-•）和部分睡眠剥夺之间脂多糖刺激CD14+细胞中白细胞介素（IL）6和肿瘤坏死因子-α（TNF）总表达的性别差异(哦—哦)PSD条件。在两个时间点发现TNF-α和IL-6的聚集表达存在显著的条件×性别交互作用：20:00(F类(1,19.0)= 6.0,P（P）<0.05）和23:00(F类(1,19.9)= 7.4,P（P）<0.05），与男性相比，女性TNF-α和IL-6的总表达增加。数据表示为平均值±SEM。

讨论

在这里，我们提出证据表明，急性睡眠不足会导致功能性细胞先天免疫反应发生差异性改变。睡眠不足一晚后的第二天早上，LPS结扎TLR4或CD14后，外周血单核细胞群中IL-6和TNF-α的生成量显著高于连续睡眠后的早晨水平。尽管女性和男性早上IL-6和TNF-α水平的升高相似，但在随后的白天，两性的细胞免疫激活有所不同。与男性的反应相比，女性在晚上的早期和晚期表现出这些促炎细胞因子的细胞表达增加。与这些观察结果一致，苏亚雷斯（2008）研究发现，睡眠质量差和睡眠潜伏期延长与女性循环CRP和IL-6水平升高有关，但与男性无关。此外，我们先前的研究结果表明，睡眠不足后NF-kB核转位的性别差异(Irwin等人，2006年)其中，雌性在睡眠不足后的早晨表现出NF-kB升高。尽管之前的工作没有评估PSD后夜间NF-kB的水平，但这种转录因子可能在夜间在两性中被类似激活，这反过来又导致早上IL-6和TNF-α水平的增加。为了解释白天IL-6和TNF-α表达的性别差异，我们假设女性NF-kB的这种激活持续到早上，而男性没有，并导致女性在一天的后半段时间内促炎细胞因子的升高。总的来说，这些数据进一步证明，与男性相比，睡眠不足会增强女性的炎症生物学，这对理解女性炎症疾病风险增加的情况具有意义。

促炎性细胞因子单核细胞生成的短暂变化，即使持续一天，也可能不会转化为疾病风险的增加。然而，众所周知，TLR活性的异常增加与类风湿关节炎有关(Andreakos等人，2004年)克罗恩病(Andreakos等人，2004年)和心力衰竭(Satoh等人，2005年). 此外，单核细胞对LPS刺激反应的增加与循环炎症标记物的增加相关(Collado-Hidalgo等人，2006年)例如，循环炎性介质的微小升高与胰岛素抵抗综合征和II型糖尿病相关，与肥胖无关(Festa等人，2000年).

PSD导致心血管反应显著增加(欧文和齐格勒，2005年)以及觉醒时的交感神经肾活动(Irwin等人，1999年;欧文和齐格勒，2005年). 反过来，肾上腺素能输出被认为有助于体内炎症介质释放到循环血液中(Friedman和Irwin，1997年;Johnson等人，2005年). 尽管儿茶酚胺在体外据报道可抑制促炎细胞因子的产生(Cole等人，1998年;Wahle等人，2005年)据报道，去甲肾上腺素的生理浓度足以导致体外NF-kB结合活性的显著剂量依赖性增加(Bierhaus等人，2003年)这可能会导致促炎细胞因子的单核细胞表达增加。据我们所知，之前没有研究检测性别差异是否会改变睡眠不足后的肾上腺素能流出，尽管在女性中，而不是男性中，以心率变异性为指标的交感迷走神经平衡与单核细胞IL-6表达呈负相关(O'Connor M等人，2007年). 此外，在女性中，而不是在男性中，迷走神经张力与这种细胞因子的产生呈正相关(O'Connor M等人，2007年). 反过来，交感神经输出的昼夜变化可能有助于刺激单核细胞产生促炎性细胞因子的昼夜改变，我们之前已经证明了这一点(O'Connor等人，2007年;Irwin等人，2006年). 最后，生殖激素的差异，包括月经期这类激素水平的变化，可能是造成这些差异的原因，尽管即使在对孕酮和雌二醇水平进行了统计调整后，这些发现也得到了证实。

经历环境或心理压力的人最常见的投诉之一是在夜间部分时间睡眠不足(Akerstedt等人，1990年;McDermott等人，1997年). 在本研究中，PSD被用作入睡困难的实验模型。我们的结果表明，与男性的反应相比，女性适度的睡眠不足会激活炎症细胞标记物。鉴于这些数据，需要进行进一步研究，以确定睡眠不足对女性和男性炎症机制的影响，从而了解女性慢性炎症疾病风险的增加。

致谢

作者没有与本研究结果相关的财务收益，也没有潜在的利益冲突。这项工作得到了T32-MH19925、HL 079955、AG 026364、CA 10014152、CA116778、RR00827、P30-AG028748、普通临床研究中心计划、塞梅尔神经科学研究所加州大学洛杉矶分校表亲中心和加州大学洛杉矶大学老年美国人独立中心炎症生物学核心基金的部分支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。在以最终可引用的形式出版之前，手稿将经过文案编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于期刊的所有法律免责声明都适用。

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