HIF-1α基因治疗与HIF-1激活的骨髓源血管生成细胞在小鼠肢体缺血模型中的协同作用

摘要

腿部供血血管的狭窄会导致严重的肢体缺血(1)这种情况下，灌注不足以维持组织的生存能力，导致坏死，最终截肢，尽管现有的医疗手段有所进步(2,三). 缺血诱导血管生成细胞因子的产生，从而引发新毛细血管的萌芽（血管生成）和现有导管血管的重塑（动脉生成）。在小鼠模型中，肢体缺血诱导骨髓源性血管生成细胞（BMDAC）异质群体的动员，促进灌注恢复和肢体挽救(4). 人们认为BMDAC通过将内皮祖细胞并入新血管或重塑血管发挥其有益作用(5)和/或髓系、间充质和造血干细胞产生血管生成细胞因子(6,7). 最近的研究表明，许多先前的研究使用了不充分的标准来定义内皮祖细胞，并且大多数BMDAC实际上是促血管生成的髓样细胞(8).

低氧诱导因子（HIF）-1是一种调节低氧/缺血适应性反应的转录因子。HIF-1是一种由O组成的异二聚体₂-调节HIF-1α和组成性表达HIF-1β亚单位(9). HIF-1α也是O₂-与HIF-1β二聚体调节，并与缺血血管反应有关(10,11). HIF-1调节血管生成细胞因子编码基因的表达，如VEGF、胎盘生长因子（PLGF）、基质衍生因子（SDF）-1及其同源受体VEGFR1、VEGFR2和CXCR4(12–14). HIF-1活性随着年龄的增长而降低，与老年动物的不良血管生成反应有关，这反映了血管生成细胞因子的生成不足和BMDAC动员受损(4,15,16). AdCA5是一种腺病毒，编码HIF-1α的组成型活性形式，在动物模型中增强血管生成、动脉生成和循环血管生成细胞的数量(4,12,17). 稳定形式HIF-1α的腺相关病毒转导在刺激骨骼肌血管生成方面优于VEGF(18). 一项针对患有严重肢体缺血的无反应患者的I期试验显示，在注射编码HIF-1α/VP-16融合蛋白的腺病毒后，无明显不良反应(19).

尽管AdCA5输送到肌肉可以提高血管生成细胞因子的产生，但它并不能解决与衰老相关的BMDAC的功能损害(20,21). 为了促进血管重塑，必须招募BMDAC并将其保留在缺血组织中。BMDAC中整合素的表达可能对其与内皮细胞的相互作用及其促血管生成作用至关重要(22). HIF-1依赖性诱导β₂整合素(23). 基于这些发现，我们假设在BMDAC中诱导HIF-1会增加其在缺血组织中的滞留。为了诱导HIF-1，我们在二甲基草酰甘氨酸（DMOG）中培养BMDAC，DMOG是一种脯氨酸-4-羟化酶抑制剂，它可以阻断氧自由基₂-HIF-1α和HIF-2α的依赖性降解，并已证明可改善肠缺血和脑缺血小鼠模型的恢复(24–26).

结果

年轻和老年小鼠的灌注恢复、运动恢复和肢体挽救。

为了分析缺血诱导的血管重构，进行单侧股动脉结扎，并通过激光多普勒灌注成像检测血流恢复情况。肢体灌注比（LPR），即缺血肢体相对于非缺血肢体的血流比率，在年轻（3个月大）小鼠手术后14天和老年（13个月大(图1A类,左侧和赖特分别）。老年小鼠的最大LPR（maxLPR）低于年轻小鼠（0.12±0.02 vs.0.59±0.07，P（P）< 0.01;图1B类). 同样，老年小鼠的运动障碍评分较高（2.8±0.2 vs.1.0±0.5；P（P）< 0.05;图1C类)肢体坏死率（100vs.33%；图1D类)与幼鼠相比。

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图1。

DMOG处理的BMDAC和AdCA5联合治疗可改善股动脉结扎后的预后。(A类)年轻（3个月）和老年（13个月）小鼠的肢体灌注率（LPR）。用生理盐水（黑色）、IM AdCA5（蓝色）或IM AdCA 5+IV DMOG处理的BMDAC（绿色）治疗小鼠。结扎后立即注射IM AdCA5，结扎24小时后静脉注射DMOG处理的BMDAC。在股动脉结扎后的指定时间（天）进行激光多普勒灌注成像，并测定平均缺血：非缺血LPR。(B类)使用S形非线性拟合计算每个治疗组的最大LPR（maxLPR）。(C类)运动障碍评分如下：0=正常反应（足底/脚趾屈曲对尾部牵引的反应）；1=足底屈曲，但不包括脚趾屈曲；2=无足底或脚趾屈曲；3=拖曳脚。(D类)显示各组患肢体挽救（即无组织坏死）或坏死的小鼠的百分比。肌注腺病毒治疗；四、 静脉治疗；S、 盐水；LZ；AdLacZ；CA5、AdCA5；C、 BMDAC。显示了在DMOG（+）或载体（−）存在下培养BMDAC。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）与生理盐水对照组相比<0.001。#，P（P）< 0.05; ###,P（P）<0.001 vs.AdCA5+盐水治疗；n个=每组4-7只小鼠。术后28天测量运动损伤和缺血性组织损伤。

DMOG处理的BMDAC的分子特征。

免疫印迹分析显示，暴露于DMOG 4h后，HIF-1α和HIF-2α蛋白均显著诱导(图2A类). 反转录（RT）和定量实时PCR（qPCR），使用特定引物(表S1)显示GLUT1增加25倍，VEGFR1 mRNA表达增加5.2倍，而在DMOG处理的BMDAC中，VEGFR2、CXCR4和CXCR7 mRNA的表达没有增加(图2B类). 我们假设DMOG可能通过HIF-1介导的同源受体（即VEGFR2、VEGFR1和CXCR4）上调，增加BMDAC对血管生成性细胞因子（如VEGF、PLGF和SDF-1）的敏感性，从而增加BMDACs对缺血肢体的归巢。在内皮生长条件下培养骨髓细胞4天，选择表达CD45、VEGFR1和VEGFR2的细胞(图2C类). 接触DMOG显著增加CD31的百分比⁺细胞，还增加了VEGFR2的百分比和平均荧光强度⁺单元格(图2C类). 携带Sca1等祖细胞标记物的BMDAC的百分比⁺和c-kit⁺经DMOG治疗后降低（分别为15%至8%和5%至2%；P（P）< 0.05). 相反，DMOG增加了VEGFR1的百分比⁺/CD31型⁺和VEGFR2⁺/CD31型⁺单元格(图2D类).

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图2。

BMDAC的特征。(A类)用0.1 mM DMOG处理BMDAC 4 h，并进行免疫印迹分析。(B类)在内皮生长条件下，在DMOG或载体存在下培养BMDAC 4 d，通过逆转录和定量实时PCR（RT-qPCR）分析mRNA，并在对数上绘制折叠变化（DMOG vs.载体）₂比例尺。(C类)BMDAC在载体（蓝色）或DMOG（红色）存在下培养4天，并使用特异性抗体通过流式细胞术分析细胞表面标志物(表S3). 显示每个标记的阳性细胞百分比。(D类)流式细胞术检测CD31的百分比⁺/血管内皮生长因子受体1⁺和CD31⁺/血管内皮生长因子2⁺BMDAC在载体（蓝色）或DMOG（红色）存在下培养4天后*，P（P）< 0.05; **,P（P）<0.01 DMOG与车辆(n个= 4–6).

BMDAC归位和保留。

IM AdCA5注射液先前显示可诱导缺血肌肉中VEGF和PLGF的表达(4,17). 由于在大多数BMDAC中观察到VEGFR1/VEGFR2表面表达，我们研究了静脉注射载体或DMOG处理的细胞后，AdCA5注射是否增加了BMDAC归巢。在股动脉结扎24小时后，将来自雄性供体的BMDAC注射到年轻雌性小鼠体内。为了分析BMDAC早期归巢到缺血组织（与随后的滞留相反），我们在静脉注射BMDAC 8小时后分离出缺血和非缺血腓肠肌，并使用特异性引物进行qPCR斯里(表S2)，一个位于Y染色体上的基因。该分析的对数线性范围为四个数量级，检测下限为2.7拷贝(图S1). 金额斯里假手术小鼠腓肠肌中的DNA低于检测极限，表明BMDAC很少或没有归巢到非缺血组织。在所有条件下，缺血诱导BMDAC显著归巢（合并平均值=51±7拷贝；图3). IM AdCA5足以增加BMDAC对缺血肌肉的归巢，因为它同时招募了载体和DMOG处理的BMDAC（合并平均值=208±29拷贝；图3). 与所有未使用AdCA5的实验组相比，BMDAC归巢水平明显更高。这些结果证实了我们的期望，即通过增加血管生成细胞因子的产生，AdCA5增加BMDAC的归巢。然而，与我们的预期相反，静脉注射细胞8小时后，骨髓基质干细胞的DMOG治疗并没有增加其对缺血组织的归巢。

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图3。

BMDAC返回缺血肢体。股动脉结扎24小时后，通过尾静脉注射DMOG（+）或载体（−）治疗的BMDAC，并通过IM注射腺病毒（AdLacZ或AdCA5）或生理盐水。8小时后分离腓肠肌，提取DNA，进行qPCR检测斯里基因序列，表示为每100 ng基因组DNA的拷贝数。**，P（P）< 0.01; ***,P（P）与假手术相比<0.001（无局部缺血；第一棒打开左侧). ##,P（P）与假手术、车辆处理的BMDACs+AdCA5和DMOG处理的BMDA Cs+AdCA5相比，<0.01(n个=每只3-4只小鼠）。

为了解释DMOG处理的BMDACs与IM-AdCA5联合使用的有益效果，我们假设在归巢后，DMOG处理可能促进BMDACs在缺血组织中的保留。功能β₂整合素是CD11和CD18亚单位的异二聚体，在缺血组织中血管生成细胞的滞留中起重要作用(22). 与载体相比，DMOG治疗BMDAC增加了编码CD11a（6.3倍）、CD11b（2.8倍）、CD11c（3.4倍）和CD18（9.5倍）的mRNA的表达(图4A类). DMOG增加了CD11a的BMDAC百分比⁺/CD18型⁺（LFA-1）⁺)，CD11b⁺/CD18型⁺（Mac-1型⁺)和CD11c⁺/CD18型⁺（CR4⁺)，通过流式细胞术测定(图4B类). 已知LFA-1和Mac-1都参与白细胞与内皮细胞的粘附，并且在缺氧中性粒细胞表面的数量较多(29,30).

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图4。

BMDAC暴露于DMOG可诱导整合素mRNA和蛋白表达。(A类)CD11a（α）的RT-qPCR分析_L（左）)，CD11b（α_M（M）)，CD11c（α_X（X）)和CD18（β₂)mRNA，表达为DMOG处理细胞与载体处理细胞的倍数增加。(B类)CD11a的流式细胞术分析⁺/CD18型⁺（LFA-1）⁺)，CD11b⁺/CD18型⁺（Mac-1型⁺)和CD11c⁺/CD18型⁺（CR4⁺)BMDAC公司(n个= 3). 抗体列于表S3.

为了测试BMDAC与内皮的结合，我们使用了动态微流体粘附试验，在生理剪应力（0.1 Pa）条件下，通过预先暴露于缺氧的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的通道灌注BMDAC，以模拟缺血组织微环境(图5A类和电影S1). 粘附在血管内皮细胞上的灌注DMOG处理的BMDAC的数量比粘附载体处理的BMDAC的数量高2.5至±0.6倍(图5B类;P（P）< 0.001). 当用培养于20%O或1%O的HUVEC进行检测时，DMOG处理增强了BMDAC粘附₂将灌注压力从0.1 Pa增加到2.5 Pa足以去除与20%O培养的HUVECs结合的BMDACs₂但不在1%O₂，这与已知的缺血组织中血管内皮的激活一致。为了确定DMOG的作用是否依赖于HIF-1，BMDAC在DMOG和地高辛的存在下培养，地高辛抑制HIF-1α和HIF-2α蛋白的合成(31). 地高辛阻断DMOG对低氧内皮细胞粘附BMDAC的影响(图5B类).

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图5。

微流控BMDAC粘附试验。在通道表面播种之前在1或20%O温度下培养的HUVEC₂24小时。在96 nL/min（壁切应力=0.1 Pa）的灌注速率下进行10分钟的试验(A类)冲洗掉未附着的细胞后，从通道中采集图像。DMOG处理(顶部渠道）和车辆处理(底部通道）BMDAC用CMFDA染色并用FITC过滤器检测。HUVEC单层在相差显微镜下可见。(B类)BMDAC在内皮生长条件下，在载体、0.1 mM DMOG或0.1 mM DMAG+0.1 mM地高辛存在下培养4 d，并进行微流控分析。结果被归一化为对照条件下粘附BMDAC的平均数(左侧大多数酒吧）。(C类)用编码增强型绿色荧光蛋白（LvEGFP）的对照慢病毒或编码HIF-1α组成活性形式（LvCA5）的慢病毒转导BMDAC，并分析内皮粘附。(D类)用流式细胞术分析在20%（蓝色）或1%（红色）O₂24小时内，阳性细胞的百分比由水平条确定。(E类)用阻断CD18（αCD18）抗体或同型对照预孵育BMDAC，并分析内皮粘附。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001 (n个=3–6个独立实验）。

除了调节HIF-1α和HIF-2α的羟化酶外，DMOG还可以抑制BMDAC中的许多羟化酶。为了确定组成活性形式HIF-1α的表达是否足以增加BMDAC对体外内皮细胞的粘附，用慢病毒载体LvCA5转导BMDAC。与对照慢病毒载体LvEGFP转导的BMDAC相比，在微流体分析中，LvCA5使BMDAC与非缺氧和缺氧HUVEC的粘附性分别增加1.9倍和4.0倍(P（P）< 0.01;图5C类). 因此，HIF-1α对于调节BMDAC在生理相关灌注压力下对血管内皮细胞的粘附性增加是必要且充分的。

因为HUVEC暴露于1%O₂我们研究了内皮细胞表面蛋白ICAM-1和E-selectin的表达，它们通过与β₂整合素。HUVEC的流式细胞术分析表明，>95%的细胞间粘附分子-1⁺E-selectin和>50%⁺HUVEC暴露于1%O₂24小时后，ICAM-1的平均荧光强度增加⁺和E-selectin⁺电池分别增加1.6倍和1.4倍(图5D类). 这些结果为BMDAC和缺氧HUVEC之间相互作用的稳定性增加提供了分子机制。

确定β₂内皮粘附需要整合素，BMDAC与抗CD18抗体孵育。DMOG处理的BMDAC与同型匹配的对照抗体孵育后，与HUVEC的粘附增加了3.1倍，然而，与CD18的中和抗体孵育相比，微流体分析中粘附细胞的数量减少到与用同种匹配的对照抗体孵育车用处理的BMDAC没有显著差异的水平(图5E类). 这些结果表明，DMOG处理的BMDAC对内皮细胞的粘附增加依赖于β₂整合素功能。

讨论

本研究表明，基于HIF-1α基因治疗和BMDAC联合治疗的治疗策略能够改善严重肢体缺血小鼠模型的灌注，减少运动损伤，并增加肢体挽救。值得注意的是，联合治疗在老年小鼠中诱导了显著的恢复，而在与年轻和中年小鼠显著反应相关的剂量下，单靠基因治疗是不够的(4). BMDAC表面受体的特征表明，这些细胞与骨髓髓样细胞相似，尽管BMDAC表达高水平的VEGFR1和VEGFR2。DMOG治疗BMDAC增加HIF-1α和HIF-2α蛋白水平和转录活性，这反映在已知HIF-1靶基因GLUT1和VEGFR1编码的mRNA增加。DMOG还增加了CD31（PECAM-1）的细胞表面水平，这是内皮细胞和前血管生成性髓样细胞的标记物(7). 我们之前显示，IM AdCA5诱导BMDAC动员进入外周血(4)并且本研究的结果表明，AdCA5还显著增加了BMDAC向缺血肌肉的归巢。补充IM AdCA5对归巢的影响，我们的结果表明β₂在DMOG处理的BMDAC中，整合素表达在mRNA和蛋白质水平上都增加。使用定制的微流体装置，我们发现DMOG在生理相关灌注压力下增加了BMDAC与HUVEC的粘附。HUVEC暴露于1%O₂增加ICAM-1和E-selectin的表达，β₂已知参与白细胞与内皮细胞粘附的整合素配体。BMDAC与低氧HUVEC的粘附非常强，因为在灌注压力为2.5 Pa时不可能分离BMDAC，这与动脉壁切应力水平相当(32). HIF-1α的表达对于增加BMDAC与内皮细胞的粘附是必要的和充分的。最后，CD18（β₂整合素）功能阻断可消除DMOG处理的BMDAC增加的内皮粘附。

虽然这项工作正在进行中，但有几次尝试通过表达HIF-1α来提高所谓的“内皮祖细胞”治疗的疗效，这些载体通过电穿孔转导(33)或腺病毒转导(34)报告了个。尽管前景看好，但这些报告使用了野生型HIF-1α序列，因此依赖持续低氧培养来避免HIF-1降解。此外，髓样细胞对电穿孔或腺病毒感染的转导具有众所周知的抵抗力。最后，大量细胞（5×10⁶)注入缺血受体。为了克服这些技术局限性，我们在体外用DMOG处理BMDAC，以诱导HIF-1α和HIF-2α，而无需将细胞暴露于重组载体，并避免全身DMOG治疗可能发生的来自缺血肢体的归巢信号的潜在钝化。由于剂量定标在临床研究中是一个重要问题，我们使用了之前研究中描述的具有积极血管生成作用的最低AdCA5剂量(4,12,17). 我们还注射了少量BMDAC（5×10⁵单元格）。尽管缺乏DMOG处理细胞的单独作用，但静脉注射DMOG治疗的BMDAC和IM AdCA5联合使用可诱导老年小鼠的功能恢复和肢体挽救，与年轻小鼠相比，血管生成反应受损(4,16)因此更像是患有严重肢体缺血的患者。最后，除了IM AdCA5和IV DMOG处理的BMDAC的协同治疗作用外，血管内皮细胞低氧诱导表达ICAM-1和E-selectin（已知与β₂最近研究表明，整合素与BMDAC归巢至缺血心肌有关(35)和肌肉(36,37).

本研究的结果表明，联合AdCA5基因治疗和DMOG治疗的BMDAC治疗协同作用，可增加股动脉结扎后的血流量恢复，从而防止组织坏死。在分子水平上，这种协同效应至少部分是由于AdCA5增强了BMDAC的初始归巢，而DMOG治疗增加了缺血组织中募集细胞的滞留。该治疗策略的疗效提高解决了腺病毒和BMDAC所需剂量的可行性问题，以及在与衰老相关的严重肢体缺血情况下改善预后的能力，所有这些都是潜在临床应用所必需的。

材料和方法

详细的材料和方法在以下网站上提供SI文本.

补充材料

致谢。

脚注

工具书类