蛋白激酶Cδ通过抑制ERK1/2通路支持MDA-MB-231乳腺癌细胞的生存^*

转染

对于小干扰RNA（siRNA）转染，将细胞接种在35–50%的汇合处，并在不含抗生素的完整培养基中培养24小时。然后，使用4μl/ml Lipofectamine 2000（Invitrogen）和40 n米siRNA（Invitrogen）(表1)根据供应商协议，在Opti-MEM I（Invitrogen）中。如有指示，17β-雌二醇（10 n米)，4-羟基-三苯氧胺（1μ米)，ICI 182780（50 n米)，苄氧羰基-Val-Ala-Asp-(O（运行）-甲基）氟甲基酮（Z-VAD-fmk；20μ米)，U0126（20μ米)，PD98059（50μ米)，SB203580（10μ米)，SP600125（20μ米)（均来自Sigma）、索拉非尼（0.3或1μ米; LC实验室），MG132（10μ米; 钙生物化学）或等量二甲基亚砜从转染开始或持续6小时。对于17β-雌二醇处理，细胞转染在不添加酚红的RPMI 1640培养基中，补充10%炭化物剥离的胎牛血清（均来自Invitrogen）。

对于质粒转染，细胞以～80%的合流率接种，培养24小时，然后用含有2μl/ml Lipofectamine 2000和2μg/ml DNA的Opti-MEM I替换正常培养基转染5小时。用编码全长PKCδ和PKCϵ的质粒或与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合的亚型的分离催化域转染细胞，如前所述(24,25). 在转染结束时，去除含有Lipofectamine 2000的Opti-MEM I，并用常规培养基替换。

样品制备和西方印迹法

使用放射免疫沉淀分析缓冲液（10 m米三氯化氢（pH 7.2），160 m米氯化钠、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、1 m米EDTA和1 m米EGTA）含有40μl/ml完整蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学公司），并在冰上培养30分钟。通过14000×克在4°C下保持10 min，在含有β-巯基乙醇的样品缓冲液中稀释，并煮沸5 min。蛋白质在10%NuPAGE Novex BisTris凝胶（Invitrogen）上电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。用含有5%脱脂牛奶的磷酸盐缓冲盐水封闭膜，并用PKCδ（1:500）、PKCϵ（1:500；caspase-3、磷酸化-ERK1/2、ERK1/2、磷酸化-MEK1/2、MEK1/2、磷化-Akt和Akt（均为1:500；细胞信号传导）；Nedd4（1:500；Millipore）；SMURF2（1:1000；上游）；MKP3（2μg/μl）(26); 和肌动蛋白（1:2000；MP生物医学）。用辣根过氧化物酶标记的二级抗体（Amersham Biosciences），以SuperSignal系统（Pierce）为底物，观察蛋白质。化学发光由CCD摄像机（富士胶片）检测。

活细胞数分析

细胞以2000个细胞/孔的密度接种在96周的培养板中，用siRNA转染，然后培养24小时。活细胞的数量通过WST-1细胞活性测定进行评估（罗氏应用科学）。在Anthos 2020酶联免疫吸附测定板阅读器（Anthos Labtec Instruments）中测量吸光度。

膜联蛋白V的流式细胞术分析

MCF-7细胞以125000个细胞/35-mm细胞培养皿的密度接种，MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞接种在150000个细胞/35mm细胞培养皿并转染siRNA。随后细胞生长24小时。漂浮细胞与胰蛋白酶粘附细胞混合，用膜联蛋白V-别藻蓝蛋白（APC；Pharmingen），并使用FACSCalibur细胞仪（BD Biosciences）定量结合膜联蛋白V-APC的量。对于膜联蛋白V-APC信号，在FL-4通道上采集了10000个事件。用APC结合的山羊抗鼠抗体（Pharmingen）染色的细胞作为阴性对照。

核形态分析

对于siRNA转染，MDA-MB-231细胞以100000个细胞/35-mm细胞培养皿的密度接种在玻璃盖玻片上，并转染siRNA。对于质粒转染，250000个细胞接种在玻璃盖玻片上。

转染后细胞生长24小时，固定在4%多聚甲醛中；用磷酸盐缓冲盐水清洗；用含有3.5μ米三氯化氢（pH 7.6），10 m米NaCl、50μg/ml碘化丙啶、20μg/ml核糖核酸酶和0.1%IGEPAL CA-630在黑暗中放置20分钟。用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，并按照说明安装(25). 使用荧光显微镜对200个转染的细胞的凋亡细胞核进行评分。

PKCδ和PKCϵ支持MDA-MB-231细胞的存活

由于细胞生长减少可能是由于增殖减少或细胞死亡增加所致，并且由于细胞周期分析表明PKCδ和PKC不促进增殖（数据未显示），我们分析了PKC下调后的细胞死亡。如膜联蛋白V阳性所示，MDA-MB-231细胞中PKCδ的耗竭导致52%的细胞死亡，而对照条件下为13%。PKC耗竭也导致细胞死亡增加，而PKCα的敲除并不会改变细胞存活率(图1E类). 敲除MCF-7细胞中的PKCδ并不影响其生存，而PKC下调可诱导细胞死亡(图1F类).

为了确定PKC沉默诱导的MDA-MB-231细胞死亡不是由于siRNA的非靶向效应，在annexin V分析之前，用靶向PKCδ和PKCϵ的额外siRNA转染细胞(图1,G公司和H（H）). 对于PKCδ，两种siRNA均导致膜联蛋白V阳性增加。对于额外的PKC siRNA（ϵ#2)细胞死亡有增加的趋势，但没有达到统计学意义。然而，这种siRNA并没有有效下调PKC的表达。

由于膜联蛋白V阳性增加不能区分凋亡细胞和坏死细胞，我们研究了PKCδ和PKCϵ在MDA-MB-231细胞中诱导的细胞死亡是否是凋亡的。为此，在碘化丙啶染色后分析细胞的细胞核形态。此外，我们分析了应用泛酶抑制剂Z-VAD-fmk抑制caspase的效果(图1,我和J型). 只有1%的对照细胞有凋亡形态，即凝聚核或碎裂核。对于PKCδ和PKCϵ下调的MDA-MB-231细胞，相应数量分别为12%和6%。Z-VAD-fmk治疗可消除这些效应，表明PKCδ或PKCϵ的下调可诱导MDA-MB-231细胞凋亡。凋亡细胞的百分比低于在膜联蛋白V分析中获得的死亡细胞的数量。可以想象，这在很大程度上是因为核形态分析将只捕获那些凋亡但尚未从盖玻片上脱落的细胞。在膜联蛋白V检测中，对漂浮细胞和附着细胞进行分析。此外，下调PKCδ和PKCϵ诱导caspase-3的裂解(图1K（K）)进一步证实细胞死亡是凋亡性的。如果用Z-VAD-fmk处理细胞，caspase-3的切割被取消。

PKCδ和PKCϵ的自由催化结构域诱导乳腺癌细胞凋亡

我们的结果表明PKCδ和PKCϵ是MDA-MB-231乳腺癌细胞的生存因子。然而，在许多细胞类型中，PKCδ（尤其是其自由催化域，在半胱氨酸蛋白酶激活后释放）是促凋亡的(2,三). 为了评估乳腺癌细胞中是否也存在这种情况，用编码全长PKCδ和PKCε及其游离催化结构域的载体转染MDA-MB-231和MCF-7细胞，并分析凋亡形态。与仅表达EGFP的MDA-MB-231细胞相比，PKCδ或PKCϵ的分离催化域的表达导致凋亡增加3.5–4倍(图2A类). 与EGFP表达细胞相比，PKCδ和PKCϵ的自由催化域也显著增加了MCF-7细胞的凋亡(图2B类). 因此，与大多数其他细胞类型一样，PKCδ的自由催化结构域诱导乳腺癌细胞凋亡。然而，全长PKCδ的过度表达并没有在两种细胞系中诱导凋亡。

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图2。

PKCδ和PKCϵ的自由催化域诱导乳腺癌细胞凋亡。MDA-MB-231型(A类)和MCF-7(B类)用编码全长的载体转染细胞(佛罗里达州)PKCδ或PKCϵ或其自由催化域(光盘)融合到EGFP或EGFP单独培养24小时，然后固定并用碘化丙啶染色。通过EGFP荧光鉴定的转染细胞，对凋亡细胞核形态进行评分，或对EGFP和肌动蛋白进行Western印迹。数据（平均值±S.E。，n个=3）显示转染细胞的凋亡细胞核形态百分比。星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页与EGFP转染的细胞相比，差异有显著性（P<0.01）。分子质量标记的位置（以千道尔顿为单位）表示为左边和EGFP融合蛋白的位置显示给正确的EGFP印迹中有一些非特定的条带。

ERK1/2通路介导PKCδ下调诱导的细胞死亡

PKC亚型缺失诱导细胞死亡的程度表明PKCδ是MDA-MB-231细胞中最强大的凋亡抑制因子。我们进一步研究了PKCδ沉默通过抑制MAPK信号对MDA-MB-231细胞凋亡作用的潜在机制。PD98059或U0126抑制MEK使PKCδ下调诱导细胞凋亡(图3,A类和B类). 此外，索拉非尼是一种Raf抑制剂，是ERK1/2上游的激酶，其浓度可降低这些细胞中ERK1/2的磷酸化(27)还减少了PKCδ沉默诱导的细胞死亡(图3C类). 索拉非尼的作用小于MEK抑制剂的作用。然而，索拉非尼会影响许多其他途径，因为Raf是MEK的上游，可以磷酸化其他几种底物，而且索拉非尼布还抑制Raf以外的其他激酶。因此，Sorafenib和MEK抑制剂的作用程度不同并非不合理。另一方面，抑制p38（SB203580）或JNK（SP600125）并不影响PKCδ下调的凋亡效应(图3D类). 此外，PKCδ缺失导致ERK1/2磷酸化增加3倍以上(图3,E类和F类)表明PKCδ通过抑制ERK1/2通路发挥其生存支持作用。

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图3。

PKCδ缺失通过ERK1/2途径诱导MDA-MB-231细胞死亡。用靶向PKCα（α）、PKCδ（δ）、PKC-（δ）或对照寡核苷酸的siRNA模拟处理或转染MDA-MB-231细胞(c（c）)并在完整培养基中培养24小时，然后进行膜联蛋白V分析(A–D)或采收用于免疫印迹(E类和H（H）). 如有指示，50μ米PD98059型(A类), 20 μ米U0126号机组(B类)，0.3或1μ米索拉菲尼布(C类), 10 μ米SB203580或20μ米SP600125型(D类)或等量的二甲基亚砜(二甲基亚砜)从转染开始就存在。通过Western blotting分析所示乳腺癌细胞系的全细胞裂解物(G公司). 磷-ERK(磷酸化细胞外信号调节激酶)印迹G公司暴露的时间比E类因为与MDA-MB-231细胞相比，T47D、MCF-7和MDA-MB-468细胞中磷酸化ERK的基础水平较低。中的数据F类（平均值±S.E。，n个=3）是E类中的数据A–D（平均值±S.E。，n个=3）显示膜联蛋白V阳性细胞的百分比。蛋白质印迹是三个独立实验的代表。星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页<0.01）。

不同乳腺癌细胞株之间的比较表明，与其他被研究的乳腺癌细胞系相比，MDA-MB-231细胞在正常生长条件下具有高磷酸化ERK1/2(图3G公司). 因此，PKCδ下调从已经很高的水平增强了MDA-MB-231细胞中ERK1/2的磷酸化。

最近，在包括MDA-MB-231细胞在内的许多乳腺癌细胞系中，PI3K途径被ERK1/2途径负调控(28). 此外，PKCδ已被证明通过组成激活的Ras通路诱导细胞中Akt的激活来支持生存(29). 这些数据共同表明，Akt可能是PKCδ效应的介体。然而，我们不能观察到PKCδ下调后Akt磷酸化的降低(图3H（H）). 因此，Akt信号减少不能解释PKCδ沉默在MDA-MB-231细胞中诱导的凋亡。

PKCδ通过对抗MKP3降解和抑制MEK1/2磷酸化抑制ERK1/2磷酸化合

MDA-MB-231细胞中ERK1/2磷酸化水平相对较高，PKCδ缺失进一步升高，这表明PKCδ影响ERK1/2调节因子的水平或活性。ERK1/2磷酸化增加可能是由于激酶活性升高或磷酸化位点磷酸化酶活性降低。激活后，ERK1/2可以被MKP3去磷酸化，MKP3是一种双特异性磷酸酶，通过激活环中酪氨酸和苏氨酸的去磷酸化使ERK1/2失活(23). 为了研究PKCδ是否调节MKP3水平，从而调节ERK1/2磷酸化，我们分析了下调PKCδ后MKP3的表达。PKCδ的耗竭，而不是PKCα或PKCϵ的耗竭导致MKP3蛋白水平的降低(图4,A类和B类). 在所调查的乳腺癌细胞系中，MKP3仅在MDA-MB-231细胞中检测到(图4C类)这使得该细胞系在这些细胞系中独一无二，并可以解释MDA-MB-231细胞中PKCδ缺失的细胞特异性效应。

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图4。

PKCδ缺失导致MKP3下调。用靶向PKCα（α）、PKCδ（δ）、PKC-（δ）或对照寡核苷酸的siRNA模拟处理或转染MDA-MB-231细胞(c（c）)或与靶向MKP3的两种不同的siRNA结合(#1和#2)并在完全培养基中培养24小时，然后收获进行Western blotting(A类,D类,F类,G公司、和我)或进行annexin V分析(E类). 如有指示，20μ米U0126，10μ米在收获前6小时添加MG132或等量的二甲基亚砜(我). 在C类，对在完全培养基中生长的指示的乳腺癌细胞系的全细胞裂解物进行蛋白质印迹。中的数据B类（平均值±S.E。，n个=3）是控制和PKCδsiRNA的量化A类中的数据E类（平均值±S.E。，n个=3）显示膜联蛋白V阳性细胞的百分比。中的数据H（H）（平均值±S.E。，n个=3）是G公司.蛋白质印迹是三个独立实验的代表星号表示具有统计学意义的差异（*，第页< 0.05; **,第页<0.01）。磷酸化细胞外信号调节激酶，磷酸-ERK。

我们的数据表明，MKP3的下调可能是PKCδ缺失导致ERK1/2磷酸化增加和细胞死亡的机制。因此，我们研究了是否仅下调MKP3(图4D类)PKCδ下调后可诱导细胞死亡。与对照细胞相比，MKP3缺失显著增加了细胞死亡(图4E类). 然而，MKP3下调的影响与PKCδ耗竭的程度不同。此外，尽管MKP3缺失增加了ERK1/2磷酸化，但在PKCδ缺失细胞中并未达到磷酸化水平(图4F类). 因此，通过PKCδ缺失下调MKP3似乎不能完全解释PKCδ缺乏对ERK1/2磷酸化和细胞存活的影响。

因此，我们还研究了PKCδ下调后MEK1/2的磷酸化。PKCδ缺失导致MEK1/2磷酸化增加2.5倍(图4,G公司和H（H）). 这些结果表明，PKCδ通过调节ERK1/2活化上游（MEK1/2）和下游（MKP3）的ERK1/2磷酸化来诱导细胞凋亡。

因为MKP3水平在很大程度上受泛素化和随后蛋白酶体介导的降解调节(30)，在培养的最后6小时内，我们用蛋白酶体抑制剂MG132处理PKCδ缺失细胞(图4我). 这导致MKP3水平显著增加，也逆转了PKCδ缺失细胞上调的ERK1/2磷酸化。这表明PKCδ缺失增强了MKP3的蛋白酶体降解。MG132处理后，对照细胞和PKCδ缺失细胞之间MKP3水平的剩余差异可能至少部分是由于细胞仅在最后6小时的培养期间暴露于MG132。因此，在最后6小时之前的时间段内可能出现的MKP3水平的任何差异都不会受到MG132的影响。

蛋白酶体介导的MKP3降解可通过ERK1/2磷酸化自身进行调节，其中ERK1/2可在血清中磷酸化MKP3¹⁵⁹和Ser¹⁹⁷以蛋白酶体降解为目标(31). 然而，当细胞同时被MEK抑制剂U0126处理时，我们没有观察到MKP3水平增加(图4我)表明PKCδ下调导致ERK1/2磷酸化增加不是MKP3降解的原因。

Nedd4是MKP3降解的潜在介体

由于MKP3被蛋白酶体降解，我们的目的是寻找潜在的E3泛素连接酶，它可以介导PKCδ缺失诱导的MKP3降解。通过分析PKCδ下调和对照MDA-MB-231细胞mRNA微阵列分析数据，^三我们发现E3泛素连接酶SMURF2的信使核糖核酸(性虐待AD公司u个回避对调节（f）演员2)和Nedd4(n个神经前体细胞e（电子）表达的d日发展中的d日自我调节4)PKCδ下调后上调。因此，我们研究了这些蛋白质的蛋白质水平。与对照细胞相比，Nedd4蛋白水平上调了3倍以上(图5,A类和B类). 这一点通过额外的PKCδsiRNA寡核苷酸得到了证实(图5C类). 然而，PKCδ缺失后SMURF2的蛋白水平没有上调。至于MKP3，Nedd4仅在所调查的四种乳腺癌细胞系的MDA-MB-231细胞中检测到(图5D类).

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图5。

PKCδ缺失导致Nedd4上调，从而抑制MKP3水平。用靶向PKCδ的siRNA转染MDA-MB-231细胞(#1或#2)、Nedd4（#1或#2)或对照寡核苷酸(c（c）)并在完全培养基中培养24小时，然后收获进行Western blotting。在D类，对在完全培养基中生长的指示的乳腺癌细胞系的全细胞裂解物进行蛋白质印迹。中的数据B类（平均值±S.E。，n个=3）是A类.蛋白质斑点(A类和C–E类)是三个独立实验的代表。星号表示具有统计学意义的差异（**，第页<0.01）。

我们进一步研究了Nedd4是否调节MKP3的稳定性。MDA-MB-231细胞中Nedd4的下调导致MKP3水平升高(图5E类)表明Nedd4参与了MKP3的失稳。Nedd4有几种基质(32)这可以解释为什么我们观察到Nedd4下调后MDA-MB-231细胞死亡略有增加（数据未显示）。这使得我们无法研究Nedd4的耗竭是否足以挽救PKCδ或MKP3下调诱导的细胞凋亡。