CREB调节杏仁核神经元亚群的兴奋性和记忆分配

HSV-CRB小鼠恐惧记忆的细胞特异性破坏

接下来，我们确定用HSV-CREB转染的杏仁核外侧神经元亚群的失活是否破坏了音调调节的记忆。如果较高水平的CREB不成比例地将转染神经元用于编码音调恐惧条件反射的记忆^5,6那么，这些神经元的失活对回忆的影响应该比用对照HSV-LacZ病毒转染的神经元失活的影响大得多。为了验证这一假设，在紧张恐惧条件反射前约3天，将两种病毒制剂双侧微融合到外侧杏仁核⁵。通过测量小鼠在条件反射24小时后进行的声调呈现期间冻结的时间百分比来评估声调条件反射的记忆。为了测试失活转染神经元的影响，在恢复听觉恐惧记忆前约30分钟，将AL（10μM，0.5μl）或载体双侧注入外侧杏仁核。值得注意的是，经AL处理的HSV-CREB转染小鼠（HSV-CREB小鼠）表现出更少的冷冻（41.4%±3.7%，t吨= 2.58,P（P）<0.05），而AL对HSV-LacZ小鼠的冷冻没有影响(补充图3).

作为对照，我们还将AL或载体注入不同组小鼠的外侧杏仁核，并等待4小时（而不是30分钟），然后测试音调条件反射(补充图4). 我们的结果表明，在试验前4小时输注AL对恢复没有影响，表明AL的影响体内持续至少30分钟，但不超过4小时。此外，在感染对照病毒的小鼠中没有记忆效应，这强烈表明AL对外侧杏仁核神经元功能没有非特异性影响。因此，这些数据支持这样的假设，即CREB功能较高的神经元不成比例地参与外侧杏仁核中编码音调恐惧记忆的神经元表达。

为了测试AL的作用是否可逆，我们重复了刚才描述的实验，但这次在第一次测试24小时后增加了第二次测试。在第二次试验中，我们逆转了治疗方法，使在第一次试验中获得AL的小鼠在第二个试验中获得VEH（以及副病毒）。结果(图2a)表明AL的作用是完全可逆的，因为在第一次试验（试验1，50.7%±5.7%冷冻）中用AL处理的HSV-CREB小鼠在第二次试验（实验2，67.1%±5.1%，t吨= 2.14,n个= 15,P（P）<0.05）。此外，HSV-CREB小鼠在第一次试验中用生理盐水处理（71.1%±4.8%冷冻），表现出记忆障碍（冷冻时间47.3%±5.8%，t吨= 3.17,n个= 17,P（P）与试验1相比，<0.01）。

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图2

局部注射AL可选择性损害HSV-CREB小鼠的听觉恐惧记忆。(a–c)左图：实验设计示意图。中：音调呈现前的冻结测量（预调）；右：音调呈现（tone）过程中的冻结测量。(一)直方图显示AL的作用是可逆的。小鼠被测试两次（测试1和测试2），间隔一天。VEH-AL组(n个=17）表示在试验1期间接受VEH的小鼠和在试验2期间接受AL的小鼠。AL-VEH组(n个=15）接受了相反的治疗**P（P）<0.01和*P（P）<0.05，如图所示。(b条)汇总图显示，尽管试验期间的AL会削弱训练期间无AL小鼠的冷冻（VEH/AL与VEH/VEH），但它对训练期间接受AL的小鼠没有影响（AL/AL与AL/VEH）。VEH/VEH或AL/AL代表在训练和测试期间接受VEH或AL的小鼠。VEH（AL）/AL（VEH）表示训练期间的VEH（AI），测试期间的AL（VIH）。n个=每个实验组12只小鼠。单向方差分析，F类_3,44=2.96，费希尔PLSD*P（P）<0.05，如图所示。(c（c）)直方图显示AL选择性地阻断HSV-CREB小鼠的短期恐惧记忆。费希尔PLSD*P（P）< 0.05,n个每组12只小鼠。

如果较高的CREB功能增加外侧杏仁核神经元编码音调记忆的可能性⁵然后，在音调调节过程中使这些神经元失活应该会阻止它们参与编码过程，从而防止HSV-CREB偏向记忆分配。为了验证这个假设，我们在训练和测试期间都进行了AL操作(图2b). 与CREB在内存整合中的角色一致^13,14我们发现，训练期间HSV-CREB神经元的激活增强了紧张相关恐惧记忆（VEH/VEH，70.0%±5.5%，n个= 12); 而训练期间用AL使HSV-CREB神经元失活会将紧张相关的恐惧记忆降低到控制水平(图2b，AL/VEH，47.4%±6.4%，n个= 12). 更重要的是，我们发现，尽管在试验期间AL破坏了训练期间接受盐水的小鼠的冷冻（VEH/AL vs.VEH/VEH），但同样的治疗对训练期间接受AL的小鼠的冰冻没有影响(图2b，铝/铝，49.5%±6.6%；AL/VEH，47.4%±6.4%，n个=每组12人，Fisher's PLSD，P（P）> 0.05). 这一结果表明，在试验期间给予AL不会影响训练期间接受AL治疗的小鼠的记忆恢复，这表明HSV-CREB只能在转染细胞在训练期间处于活动状态时影响记忆分配。总之，这些结果表明，训练期间的神经元激活对CREB在记忆分配中的作用至关重要。

因为我们在训练后至少24小时采取了记忆分配措施(图2a–b)CREB对记忆巩固的众所周知的影响^13,14可能会混淆我们对CREB在内存分配中的作用的解释。因此，我们在训练后30分钟测试了记忆分配，这是记忆巩固之前已知的一个时间点^13,14事实上，在训练后30分钟进行测试时，HSV-CREB小鼠没有表现出比HSV-LacZ小鼠更高的冷冻水平，这表明HSV-CREB不会增强训练后30 min的音调恐惧记忆(图2c). 然而，训练后立即局部给予AL确实会破坏HSV-CREB小鼠30分钟的声调调节记忆（HSV-CRIB/VEH，50.9%±5.5%，HSV-CREB/AL，28.9%±5.2%，F类_3,44=6.93，费希尔PLSD，P（P）< 0.05,n个=12/组），而对HSV-LacZ小鼠（HSV-Lac Z/VEH，48.1%±7.5%，HSV-LaC Z/AL，52.9%±5.7%，图2c). 这些发现表明，CREB在记忆分配中的作用不能归因于它对记忆巩固的影响。此外，这些发现表明，在训练后的30分钟内就可以观察到记忆分配。先前的结果表明，HSV-CRB转染在编码过程中不会募集到更多的杏仁核外侧神经元，并且在各种CREB操作中，参与特定记忆的杏仁核外侧神经元的总数保持不变^5,6这意味着我们在训练后24小时的语气恐惧结果不仅仅是由于HSV-CRB驱动的杏仁核记忆轨迹中的神经元沉默。

为了测试HSV-CREB对记忆影响的行为特异性，我们通过两个重要的修改重复了上述实验：首先，我们担心使小鼠产生条件反射之前（而不是在）病毒注射后。然后，我们在病毒感染后3天对相同的小鼠进行了味觉厌恶条件反射（CTA）训练(图3). 我们选择CTA是因为它也依赖于杏仁核^15–17正如预测的那样，我们发现AL输注会损害CTA记忆(图3bHSV-CREB/VEH，71.9%±7.7%，HSV-CREB/AL，50.0%±5.9%，t吨= 2.31,P（P）<0.05），但对音调恐惧记忆没有影响(图3cHSV-CREB/VEH，50.6%±8.6%，HSV-CREB/AL，49.9%±9.8%，P（P）> 0.05). 重要的是，不同治疗组在CTA测试中的液体消耗总量是相同的。这些数据证明了HSV-CREB效应的行为特异性，也表明训练前而非训练后HSV-CREB输注会影响外侧杏仁核的记忆分配。重要的是，这些数据也证明了CREB在CTA记忆分配中的作用，这表明我们的研究结果可能普遍适用于杏仁核依赖性学习。

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图3

AL不会破坏病毒转染前建立的HSV-CREB小鼠的条件反射。(一)实验设计示意图。(b条)直方图显示，AL输注会损害CTA记忆，而CTA记忆是在病毒输注（输注病毒后的训练）后产生的。厌恶指数（AI）定义如下：[耗水量毫升/（耗水量毫升+耗糖精毫升）]×100%。AI越高，小鼠越喜欢水而不是糖精，CTA记忆越好。未付款t吨测试*P（P）<0.05，如图所示。(c（c）)AL对已建立的音调恐惧记忆（病毒输注前的训练）没有影响。预色调：在色调呈现之前冻结。音调：在音调呈现期间冻结。n个=AL组和n个VEH组为6。

HSV-CREB神经元突触效能增强

以往对紧张恐惧条件反射后丘脑-LA突触的研究表明，突触传递增加，配对脉冲促进（PPF）减少^18,19为了测试外侧杏仁核中的HSV-CREB神经元是否优先被招募来编码恐惧记忆，我们研究了幼年小鼠和条件小鼠（训练后24小时）同一切片中HSV-CREB神经元和非转染相邻细胞的突触传递和PPF。与之前的调查结果一致^18,19我们对丘脑-LA通路的全细胞记录研究表明，恐惧条件作用增强了突触传递(图4a左，双向方差分析，F类_1,37个=7.68；P（P）<0.01）并降低PPF(图4a右，双向方差分析，F类_1,82= 26.35; P<0.001）。

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图4

条件性小鼠HSV-CREB神经元突触效能增强(一)幼年小鼠与条件小鼠LA突触特性的比较。“天真”，未经训练的小鼠的神经元；“条件反射”，训练小鼠的神经元。左：丘脑-LA突触中诱发的EPSC在条件反射后增强。双向方差分析，F类_1,37= 7.68;P（P）< 0.01. 天真，n个= 15; 有条件的，n个=每组6只小鼠中的24只。右：条件反射后丘脑-LA突触的PPF降低。双向方差分析，F类_1,82= 26.35;P（P）< 0.001. 天真，n个= 37; 有条件的，n个=每组8只小鼠中的47只。(b条)HSV-CREB病毒转染的幼年小鼠与条件小鼠LA突触特性的比较。“Naive CON”和“Conditioned CON”指未感染（GFP⁻)LA神经元，而“Naive HSV-CREB”和“Conditioned HSV-CREB”指转染（GFP⁺)来自幼稚和条件反射小鼠的神经元。左：HSV-CREB神经元(n个=12）与其他组（幼稚CON，n个= 5; 单纯HSV-CREB，n个= 7; 条件CON，n个=8只，每组5-6只小鼠）。单向重复方差分析，P（P）<0.001，纽曼-凯尔斯多重比较（NKMC）试验，P（P）< 0.001. 右：HSV-CREB神经元在条件反射后PPF降低。HSV-CREB神经元，n个= 13; 天真的CON，n个= 10; 单纯HSV-CREB，n个= 11; 条件CON，n个=8，每组6只小鼠。单向方差分析，P（P）<0.001，NKMC测试，P（P）< 0.001. 插入物：如图所示，从不同神经元采集痕迹样本。刺激强度为30μA，PPF中的刺激间隔为35ms。

重要的是，我们发现，与其他三个对照组相比，条件小鼠中的HSV-CREB神经元（条件HSV-CREB）既增强了突触传递，又降低了PPF，包括条件小鼠中没有病毒转染的邻近神经元（条件CON）、HSV-CRIB神经元（单纯HSV-CROB）和幼年小鼠中相邻的未转染神经元（幼年CON）(图4b，单向重复测量方差分析，P（P）< 0.001). 统计分析表明，条件化HSV-CREB神经元的诱发EPSCs和PPF与其他三组有显著差异（Newman-Keuls多重比较试验，P（P）< 0.001). 相反，尽管条件CON神经元中诱发的EPSCs也不同于单纯HSV-CREB和单纯CON神经元(P（P）<0.05~0.01），这三组的平均PPF相同(P（P）> 0.05). 在单纯HSV-CREB组和单纯CON组中，突触EPSCs和PPF均无法区分，表明单纯、无条件小鼠中HSV-CREB没有改变丘脑-LA突触的诱发基底突触传递和PPF。综上所述，这些数据为以下假设提供了令人信服的额外证据，即CREB功能更高的神经元不成比例地参与了在外侧杏仁核中编码音调恐惧记忆的神经元表征。

HSV载体

使用了两种载体，HSV-CREB-AlstR（HSV-CREB载体）和HSV-LacZ-AlstR-（控制载体）。感兴趣的基因(Creb1号机组,LacZ公司和阿尔斯特R)克隆到双顺反子HSV扩增子中⁷为了可视化转基因表达，我们将eGFP融合到CREB和LacZ cDNA的5′端。CREB或LacZ由IE 4/5启动子表达，AlstR由CMV启动子表达。扩增子是按照公开的方法包装的³⁹.

手术和病毒输注

用硫酸阿托品（0.1 mg kg）预处理小鼠⁻¹，i.p.），用水合氯醛麻醉（400 mg kg⁻¹（i.p.），并放置在立体定向框架中。根据Paxinos和The Franklin小鼠大脑图谱，将皮肤缩回，并在左心房上方的头骨两侧钻孔（AP=−1.3，ML=±3.3，V=−4.8 mm）⁴⁰为了进行行为实验，将一个不锈钢外套管（塑料套管）植入LA，并用牙科水泥固定在颅骨上。插管植入后，小鼠被单独饲养并每天处理。病毒输注被推迟到手术后7天，以确保身体康复。将病毒溶液（1.3μl；双侧）以0.065μl/min的流速通过内注射套管（塑料管，22号）输送至外侧杏仁核，内注射套管由聚乙烯管连接至安装在输液泵（哈佛仪器）上的Hamilton微量注射器。将输液套管再放置10分钟，以确保载体扩散。对于电生理研究，在钻孔后立即通过玻璃微移液管（Sutter仪器）将病毒溶液（1.3μl）输送至LA超过5分钟。注射后将微量移液管放置在原位5分钟。在病毒输注后3天进行电生理或行为实验⁴¹.

AL管理

肽尿苷抑素（AL）¹²（新英格兰）在ddH解散₂O制备2.5mM储备溶液。添加盐以将其稀释至每个特定实验的适当最终浓度。将AL溶液（0.5μl）或等量的溶媒（生理盐水）通过内注射套管以0.25μl/min的流速双侧输送至清醒动物的LA。注射后将套管留在原位2分钟。注射后约30分钟开始行为程序。

听觉（音调）恐惧条件反射

训练包括将小鼠置于调节室（上下文a），2分钟后发出一种音调（2800 Hz，85 dB，30秒），与电击同时终止（2秒，0.5 mA）。小鼠在房间里再呆1分钟。30分钟或24小时后进行听觉恐惧条件反射测试。将小鼠置于一个新的房间（上下文B），2分钟后出现CS音（持续1分钟）。通过自动评分系统（Med Associates Inc.）以30帧/秒的采样率评估我们的记忆指数，即冻结（除呼吸外所有运动的停止）；这些动物需要连续冷冻至少1秒，然后才能计算冷冻次数。在电生理研究中也使用了相同的训练方案。训练24小时后切下切片。

条件味觉厌恶（CTA）

CTA培训在手术后7天的周期中进行。小鼠断水24小时，然后预处理5天，每天从两个试管（10毫升）获得40分钟内的每日饮水量。2小时后^第训练前一天，将HSV病毒注入两侧LA。注射病毒3天后开始调节日。

在调理日，用0.2%糖精钠盐（w/v，味道CS）代替水填充两个试管。给予CS 20分钟和20分钟后，用萎靡诱导剂氯化锂（LiCl；0.06 M，2%体重i.p.）治疗小鼠。

24小时后进行了糖精厌恶测试。试验前30min注入AL/vehicle。将两个试管（一个装有水，另一个装有糖精）放置40分钟。测量每种液体的摄入量，厌恶指数（AI）定义如下：[耗水量毫升/（耗水量毫升+耗糖精毫升）]×100%。50%的AI具有相同的偏好水平，AI越高，小鼠越喜欢水而不是糖精）。

组织学

在行为实验之后，用在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的4%多聚甲醛经心灌注小鼠。大脑冠状切片（40μm）。每次实验结束时，用结晶紫染色法确认套管尖端的位置。只有双侧位于杏仁核基底外侧复合体的小鼠才被纳入分析。

使用NIH图像处理系统对感染水平进行定量分析。共焦成像前，我们使用透射光显微镜和丘脑-双侧杏仁核纤维（ic）和皮质-双侧杏仁纤维（oc）定位LA的背侧和外侧边界。用固定的取样窗（0.1mm）双侧计数LA中GFP阳性细胞的总数²)从每只小鼠的前后位水平进行至少六个切片。为了评估计数区域中的细胞核数量，在洗去FITC-结合GFP一级抗体后，使用4'，6'-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对切片进行重新染色。GFP阳性细胞的百分比计算为GFP阳性细胞核占LA中DAPI标记细胞核总数的百分比。免疫荧光研究后，用结晶紫对脑片进行反染，以确定输液套管的位置。

电生理学

病毒输注后2至3天，将成年小鼠（3至4个月大）的大脑迅速取出，并置于含有（mM）：120 NaCl，20 NaHCO的冰冷人工脑脊液（ACSF）中_三，3.5 KCl，1.25 NaH₂人事军官₄，2.5氯化钙₂，1.3百万硫酸镁₄和10d-葡萄糖。制备含有杏仁核的冠状切片（400μm厚），并允许其在含氧（95%O₂/5%一氧化碳₂)在进行实验之前，ACSF在室温下至少保持1小时。在所有溶液中加入95%的O₂/5%一氧化碳₂并在31°C下以约2 ml/min的速度在切片上灌注。使用红外或外荧光照明在直立显微镜下观察细胞，并使用Dagan 3900A放大器和Multicamp 700A从LA的神经元进行全细胞电流灯记录。mM中包含的电极（3~6 MΩ）：120 K-甲磺酸盐、20 KCl、10 HEPES、0.2 EGTA、2.0 MgCl₂，2毫克₂ATP，0.3钠_三GTP，7磷酸肌酸（pH 7.2~7.4；290~300 mOsm）。Alexa 568（0.2毫克毫升⁻¹，分子探针，OR）包含在内部溶液中。响应在2 kHz下过滤，在10 kHz下数字化。使用pClamp9.0（Axon仪器）和Matlab（R2007a）采集、存储和分析所有数据。在整个实验过程中，对接入电阻进行了监测。在整个实验过程中，通过施加超极化电流（−100 pA）监测输入电阻。本研究的分析仅包括达到健康和稳定性最低标准的细胞（静息膜电位大于−55 mV，接入电阻小于20 MΩ）。如前所述，根据动作电位（AP）半宽度和棘波频率适应来识别LA中的金字塔神经元，以响应长时间去极化电流注入²⁴在静息电位（RP）下检测细胞被动膜特性。从每条记录道中的第一个棘波开始测量棘波振幅、半宽度和棘波阈值，该记录道显示了对去极化步骤（50100或150 pA，600 ms）的响应中最小数量的诱发棘波（通常只有1个棘波）。从RP测量尖峰振幅。尖峰起始阈值被视为AP上击的开始。AP半宽度被测量为半最大电压下的尖峰宽度。输入电阻通过线性回归拟合I-V曲线进行校准。为了研究神经元的放电特性，从−200到500 pA以50 pA的增量提供15个电流注入步骤（持续时间600 ms）。该方案重复三次，以获得稳定的响应。对于AL实验，该方案重复六次，两次获得对照反应，两次在应用AL后重复，两次洗脱AL后再次重复。根据尖峰频率适应将记录的LA细胞进一步分为两组²⁴：快速适应（RA）细胞在电流注入开始时（600 ms，400 pA）仅激发1–5个峰值，在其余电流脉冲中保持沉默。慢适应（SA）细胞激发了6个以上的棘波。通过从−60 mV的保持电位施加50 ms的阈上刺激（≥400 pA，大多数为400 pA）电流阶跃，在电流钳中诱发后超极化（AHP），以诱发至少2个峰^42,43。电池仅在注入电流变化时点火一次，不包括在进一步分析中。在两个时间点测量AHP：AHP的负峰值和50 ms脉冲结束后300 ms。将药物添加到适当浓度的超滤液中。HSV-CREB小鼠未感染细胞的神经元兴奋性(n个=40，8只小鼠），HSV-LacZ载体转染细胞(n个=12只小鼠）和附近未感染的细胞(n个=12，2只小鼠）没有显著差异（P>0.05），我们将数据合并并用作对照。

丘脑-LA通路用双极铂电极刺激。记录点和刺激点之间的距离在150至450μm之间。每隔10秒进行100us刺激。对于基础突触传递研究，通过改变刺激强度（10至100μA）并测量相应的EPSC振幅来构建输入-输出曲线。峰值EPSC被测量为峰值内向电流。对于配对脉冲易化（PPF）研究，个体反应的峰值振幅被测量为刺激伪影前的电流水平与EPSC峰值之间的差异¹⁸.设置刺激位置和强度以诱发约50–200 pA的EPSC。对于在训练动物上进行的实验，采用相同的训练方案（参见音调恐惧条件反射部分的描述），并在训练后24小时进行记录。

为了比较诱发突触传递的AMPA/NMDA比值，将AMPA分量测量为−70 mV的EPSC峰值振幅；NMDA组件已确定n个通过测量30 mV下EPSC开始后100 ms的电流振幅⁴⁴.设置刺激位置和强度以诱发约50–200 pA的EPSC。在AMPA/NMDA比率研究中，实验是在GABA存在的情况下进行的_一个受体阻滞剂苦毒毒素（100μM）。

对于突触诱发兴奋性研究，在使用的每种刺激强度下都会发出一系列脉冲（至少60个脉冲，每个刺激强度10个脉冲）（涵盖从阈下到最高的一系列反应）。E-S曲线是通过将EPSP斜率的总和装箱，并绘制箱子的平均值与箱子中成功动作电位的百分比来构建的²⁹刺激强度为30至300μA。数据点采用S型拟合：S=1/（1+exp[（E50-E）/K]），其中E50是产生动作电位50%概率（I/O阈值）的EPSP斜率。增益是通过计算乙状结肠线性药液的斜率来确定的。

我们感谢Tiago Carvalho、Yong-Seok Lee、Peyman Golshani、Dean Buonomano、Brian Wiltgen、Wenbin Tan、Justin Shobe、Jack Feldman和John Guzowski提供的有用建议、Edward Callaway提供的AlstR cDNA、Katie Cai提供的技术支持。这项工作得到了NIH（P50-MH0779720和R37-AG13622）对AJS的资助，以及欧洲委员会玛丽·居里出外奖学金（PIOF-GA-2008-219622）对PP的资助。