介绍
Akt(也称为蛋白激酶B或PKB)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGC家族的成员,有三种亚型(Akt1、2和3)。Akt是生长因子信号传递过程的积极调节器,包括增殖和存活1–三作为生长因子信号的中心节点,Akt活动受到多种监管输入的影响1–三在缺乏生长因子的情况下,Akt是细胞质的,不活跃。在生长因子刺激PI3K活性后,Akt通过其蛋白同源性(PH)结构域与PI3K产生的PIP3结合而被招募到质膜上。Akt的转位使其活化环上的Thr308残基通过膜定位磷脂酰肌醇依赖性激酶1(PDK1)磷酸化(参见)4,5Akt的进一步激活需要通过雷帕霉素不敏感的mTORC2复合物对位于Akt C末端疏水基序(HM)中的Ser473进行磷酸化6–8Akt的异常激活是通过多种突变在多种人类癌症中观察到的,包括PI3K激活突变、PTEN磷酸酶失活、Akt过度表达、导致构成膜定位的PH域Akt点突变等1,三,9癌症中PI3K/Akt/mTORC1通路的频繁突变激活导致了该通路中多种激酶抑制剂的开发,包括生长因子酪氨酸激酶10,11,PI3K三,11–13,PDK1三,11,12,阿克特三,12和mTORC1抑制剂三,11,14.
实现Akts特异性抑制的化学遗传策略(一)野生型Akt抑制与作为Akt抑制。A-443654抑制内源性Akt的所有三种亚型(左),而作为Akt特异性抑制剂如PrIDZ和3-IB-PP1仅抑制相应的作为Akt亚型,可在细胞中过度表达(右)。(b条)化学结构和在体外Akt抑制剂对所有三种Akt亚型的抑制活性。这个作为Akt抑制剂特异性阻断作为Akt活动。集成电路50值由在体外myr-HA的IP激酶分析-重量Akt1/2/3和myr-HA-作为Akt1/2/3在HEK293T细胞中表达。(C类)Akt2与A-443654的共晶结构(PDB:2JDR)28Akt2和A-443654中的守门人蛋氨酸以棒状表示。颜色如下:淡蓝色、碳纤维;红色,氧气;蓝色、氮气;黄色,硫磺。
并非所有PI3K/Akt/mTORC1途径抑制剂都拮抗该途径。令人惊讶的是,在一些患者中,mTORC1抑制剂雷帕霉素导致完全意外的上游激活,导致肿瘤组织中Akt活性增加15几组研究表明,雷帕霉素诱导的Akt反馈激活是由于支架蛋白胰岛素受体底物-1(IRS-1)的S6K(p70S6K)失稳所致16–19为了开发最有效的PI3K/Akt/mTORC1通路拮抗剂,了解该通路中负反馈环路的结构非常重要。
与雷帕霉素一样,另一种PI3K/Akt/mTORC1途径抑制剂ATP-竞争性抑制剂A-443654(1)也被报道会引起异常的Akt磷酸化。Abbott实验室发现A-443654,并显示其在异种移植动物模型中抑制PC-3、MiaPaCa-2和3T3-Akt1肿瘤生长20在抑制肿瘤生长所需的剂量下,观察到对下游Akt信号的有效抑制。然而,矛盾的是,在Thr308和Ser473诱导了Akt过度磷酸化。在多个癌细胞系中观察到A-443654诱导Akt过度磷酸化,因此无论细胞类型如何,这似乎都是一种普遍现象21虽然最初认为过度磷酸化是通过Akt/mTORC1/S6K负反馈引起的,类似于之前描述的雷帕霉素的负反馈,但随后的研究表明,即使在TSC2−/−MEF细胞中也观察到a-443654的过度磷酸化21由于TSC2是Akt的直接下游靶点,并且是mTORC1激活的抑制剂,因此结果表明过度磷酸化独立于Akt/mTORC1/S6K通路的抑制。然而,尚不清楚Akt是否仅通过磷酸化TSC2来控制mTORC1的激活22,23TSC2−/−MEF细胞是否具有典型的PI3K/Akt/mTORC1通路。
由于PI3K/Akt/mTORC1途径对癌细胞生存至关重要,并且由于该途径的几种抑制剂已被证明可触发Akt磷酸化,因此我们重点了解Akt抑制剂A-443654导致Akt过度磷酸化的机制。利用化学遗传学,我们探索了A-443654如何导致Akt过度磷酸化的两种不同的机制可能性。在第一种机制中,A-443654抑制一种减少Akt磷酸化反馈抑制的激酶。这种机制在概念上类似于雷帕霉素抑制mTORC1所诱导的反馈,我们称之为外在的反馈,因为它涉及信号级联。我们认为过度磷酸化的第二种可能机制是内在的依赖于与Akt的药物结合。重要的是内在的该模型不涉及通路介导的反馈控制机制。为了区分这些潜在机制,我们结合使用Akt化学遗传学、Akt突变、a-443654类似物的合成、荧光显微镜和磷酸特异性抗体的通路分析。
结果
A-443654分析揭示了激酶靶点的光谱
雅培实验室报告了ATP-竞争性Akt抑制剂A-443654(在体外Akt1 K公司我=160 pM)20.A-443654抑制稳定转染有组成活性肉豆蔻酰化Akt1/2/3的FL5.12细胞中的所有三种Akt亚型,并且在筛选AGC家族中的相关激酶(如PKA和PKC)时表现出适度的选择性20为了获得a-443654细胞靶点的更完整视图,我们针对更大的激酶组进行了测试。在测试的220种纯化激酶中,A-443654抑制了47种激酶(在1µM时抑制率>90%),包括可能影响PI3K/Akt途径的激酶,如PDK1、S6K、PKA、PKC和GSK3β(补充表1在线)。A-443654抑制的激酶谱,尤其是PI3K/Akt通路多个成员的靶向性,使得破译细胞对该化合物的反应极为困难。
Akt亚型模拟敏感等位基因的设计
ATP-竞争性激酶抑制剂(如A-443654)通常会抑制相关的蛋白激酶,因为在激酶组中ATP结合位点的保守性质。为了避免激酶家族中的自然退化,我们采用化学遗传方法来创建选择性Akt抑制剂。该技术结合了模拟敏感技术(作为)激酶等位基因作为等位基因特异性抑制剂以实现Akt的选择性抑制,如24该方法利用激酶活性位点(称为门控)中的一个保守的大疏水残基,该位点与ATP的N6氨基直接接触。
为了建立适用于所有Akt亚型的系统,通过用甘氨酸替代守门员蛋氨酸引入了扩大ATP-结合囊大小的突变(即M227G/M225G/M229G,分别用于作为Akt1/2/3)。突变体以肉豆蔻酰化形式表达,以在HEK293T细胞中表达时提供构成激酶激活。体外免疫沉淀激酶分析显示作为Akt保留了约30%的相应活动重量Akt亚型(补充图1在线)。
asAkt特异性抑制剂的设计与合成
接下来,我们筛选抑制剂类似物,用于有效和选择性地抑制作为Akt亚型。吡唑并嘧啶1(PP1)支架已被证明是许多模拟敏感激酶抑制剂开发的通用起点24,25.筛选了一系列结构多样的PP1类似物作为Akt1/2/3导致3-碘苯类似物3-IB-PP1的鉴定(2)26,抑制作为Akt1/2/3具有良好的效力,并且不抑制重量阿克1/2/3(). 这个在体外3-IB-PP1的效力和选择性作为Akt1(集成电路50=28 nM)与。重量Akt1(集成电路50>10000 nM)为细胞研究提供了宝贵的工具作为Akt1特定功能。相反,3-IB-PP1对作为Akt2(IC50=240 nM)和作为Akt3(IC50=120nM)对于ATP竞争性激酶抑制剂是低的27因此,尽管3-IB-PP1提供的选择性Akt抑制剂的结构不同的化学系列的可用性为评估作为Akt1抑制我们担心的是作为Akt2和作为Akt3目标。
因此,我们试图设计A-443654的模拟物作为Akt亚型,但不与重量Akt亚型。共晶结构的评估28Akt2与A-443654的结合表明,A-443654吲唑环上的C7位置是引入大取代基的有利位置,这将与重量阿克特(). 对各种C7-烷基取代的A-443654类似物的广泛SAR研究表明-n个-丙基吲哚唑类似物PrINZ(三)作为有效抑制剂(低纳米范围IC50针对所有作为Akt亚型,参见). 正如预测的那样,PrINZ没有抑制重量公元1/2/3年。
asAkt特异性抑制剂的细胞效应
接下来,我们验证了3-IB-PP1和PrINZ在细胞中的使用。为了测试3-IB-PP1和PrINZ的正交性,我们研究了IGF-1刺激的非转染HEK293细胞中Akt的激活。用A-442654、PrINZ和3-IB-PP1处理HEK293细胞,并测量Akt和GSK3β(Akt的直接下游靶点)的磷酸化(). 据报道,A-443654治疗能有效抑制Ser9处GSK3β的磷酸化,同时诱导Thr308和Ser473处的Akt磷酸化20相反,经PrINZ和3-IB-PP1处理后,GSK3β和两个Akt位点上Ser9的磷酸化水平未受干扰。总之,这些数据表明抑制剂PrINZ和3-IB-PP1对重量这些化合物的Akt和潜在的离靶效应(如有)对Akt的上游和下游信号传导没有明显影响。
细胞效应作为Akt转染和作为Akt特异性抑制剂处理(一)HEK293细胞需要血清过夜,然后用PrINZ、A-443654或3-IB-PP1处理20分钟,然后用50 ng/ml IGF-1刺激10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物的Akt(Thr308,Ser473)和GSK3β(Ser9)磷酸化。(b条)用myr-HA转染HEK293细胞-重量Akt1/2/3或myr HA-作为公元1/2/3年。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Ser473和Thr308)和GSK3β(Ser9)磷酸化。(c(c))HA转染HEK293细胞-作为用连续稀释的PrINZ或3-IB-PP1处理Akt1 30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。(d日)HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PrINZ或10µM 3-IB-PP1处理Akt1/2/3 30 min。通过免疫印迹法分析细胞裂解物的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。
接下来,我们测试了3-IB-PP1和PrINZ对作为Akt在细胞中发挥作用,以评估Akt下游信号的特异性抑制和/或Akt抑制剂的特异性结合是否会导致Thr308和Ser473上的Akt过度磷酸化。因此作为首次测定了细胞中的Akt1/2/3活性。包含c-Src肉豆蔻酰化识别序列(myr-HA)的Akt结构-作为Akt)是构成膜局部的,因此在没有生长因子刺激的情况下具有组成活性29,30如预期的那样,myr HA的表达-作为Akt1/2/3和myr-HA-重量HEK293细胞中的Akt1/2/3导致GSK3β在Ser9的磷酸化升高(). myr-HA提高GSK3β磷酸化-作为Akt1/2/3转染与myr-HA转染相当-重量Akt1/2/3转染,确认每个细胞的细胞活性作为Akt亚型类似于重量Akt亚型。
确定抑制剂的作用体内,然后用HA转染HEK293细胞-作为Akt1并用连续稀释的3-IB-PP1或PrINZ处理(). 透明质酸-作为3-IB-PP1和PrINZ以剂量依赖性方式诱导Akt1过度磷酸化,强烈建议磷酸化的诱导源于Akt下游信号的特异性抑制和/或Akt抑制剂与激酶的特异性结合,而不是源于A-443654的非靶向激酶抑制活性。两种结构不同的Akt抑制剂诱导Akt过度磷酸化的事实表明,Akt过磷酸化可能是多种ATP-竞争性Akt抑制药的普遍现象。
然后,我们评估了剩余部分中该现象的普遍性作为Akt2和作为Akt3亚型,并再次观察到这些亚型的过度磷酸化,证明ATP-竞争性Akt抑制剂对Akt的所有亚型持续诱导过度磷酸化().
在转染了组分活化的myr-HA的HEK293细胞中评估3-IB-PP1和PrINZ诱导的Akt过度磷酸化的下游后果-作为Akt1。这两种抑制剂都以剂量依赖性的方式降低GSK3β上Ser9的磷酸化水平,从而诱导Akt过度磷酸化,这表明PrINZ和3-IB-PP1阻断Akt下游信号传导,同时诱导Akt-过度磷酸化(补充图2在线)。
Akt磷酸化的上游调节器
生理性Akt激活由三种上游激酶调节1–三:1)PI3K产生PIP3,用于Akt的PH域补充到膜;2) 激活环Thr308的PDK1磷酸化;和3)HM Ser473的mTORC2磷酸化(). 我们询问Akt的每一个激酶输入是否仍然调节抑制剂诱导的过度磷酸化。使用上游激酶的抑制剂和Akt的突变分析来探索每种上游激酶的作用。
Akt抑制剂诱导的Akt过度磷酸化上游调控因子的药理学和遗传解剖(一)分析了生理性Akt激活的调节因子包括:1)PI3K,它产生PIP3,用于Akt向膜的PH域募集;2) PDK1,磷酸化Thr308;和3)mTORC2,磷酸化Ser473。PI3K、PDK1和mTORC2分别被抑制:PIK90、BX-795和PP242。(b条)HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PIK90处理Akt1/2/3 10 min,然后再添加2.5µM PrINZ 30 min。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。(c(c))转染HA的HEK293细胞-作为Akt1或HA-作为Akt1公司R25C型用2.5µM PrINZ处理30分钟。通过免疫印迹法分析细胞裂解液的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。(d日)myr-HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PrINZ处理Akt1 30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。(电子)HA转染HEK293细胞-作为在额外添加2.5µM PrINZ 30分钟之前,用10µM BX-795处理Akt1/2/3 10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。((f))HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PP242处理Akt1/2/3 10 min,然后再添加2.5µM PrINZ 30 min。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。
膜定位在过度磷酸化中的作用
为了评估Akt过度磷酸化中Akt膜移位的需要,我们使用抑制剂PIK90(4),一种选择性pan-PI3K抑制剂31.HA的预处理-作为用PIK90转染Akt1/2/3的HEK293细胞可显著降低三者的过度磷酸化作为PrINZ诱导的Akt亚型(). 这些结果与之前关于PIP3在两种典型Akt激活中的作用的研究一致1和A-443654诱导Akt过度磷酸化21.
对PI3K的药物阻断可能会影响多条下游通路,从而使PI3K活性在抑制剂诱导的过度磷酸化中的需求更加复杂。作为Akt对PIP3结合需求的直接测试,我们使用了一个Akt突变株(R25C),该突变株与PIP3的亲和力显著降低()32.HA的转染-作为Akt1和HA-作为阿克特12005年2月进入HEK293细胞,然后用PrINZ处理,表明R25C突变大大降低了PrINZ诱导的Thr308和Ser473的磷酸化水平,证实了Akt通过与PIP3结合实现Akt膜移位以实现过度磷酸化的需要。
接下来,我们询问膜定位是否足以导致Akt过度磷酸化。构建膜定位myr-HA转染细胞内-作为Akt1,PrINZ治疗导致myr-HA过度磷酸化-作为阿克特1(). 这些数据表明,Akt的膜定位不足以产生激酶的过度磷酸化,并且定位于膜的Akt仍然受到Thr308和Ser473磷酸化的药物诱导调节。
我们想知道组成性膜定位结构myr-HA-作为Akt1/2仍然需要PIP3结合进行过磷酸化。换句话说,Akt过度磷酸化可能需要Akt与PIP3结合,但膜定位本身并不重要。我们研究了PIK90治疗或在PH域引入R25C突变是否影响myr-HA的过度磷酸化-作为Akt1.用PIK90预处理可减少HA的过度磷酸化-作为PrIDZ诱导的Akt1()而myr-HA过度磷酸化-作为Akt1未被PIK90抑制(补充图3a在线)。构成膜定位myr-HA-作为Akt结合R25C突变也进行了研究,结果类似(补充图3b在线)。这些结果表明myr-HA的过度磷酸化-作为Akt1不需要PH域与PIP3结合。
PDK1和mTORC2负责磷酸化
接下来,我们通过询问上游激酶(PDK1和mTORC2)是否是药物诱导的Akt过度磷酸化所必需的来探索调控的机制基础。Akt的磷酸化一直是深入研究的主题,部分原因是完全激活需要多肽远端两个位点上的两个激酶磷酸化。激酶PDK1负责正常生长因子刺激期间Thr308的磷酸化4,5负责Ser473磷酸化的激酶一直备受争议,尽管现在似乎很清楚雷帕霉素不敏感的mTOR复合物mTORC2是Ser473激酶7,8我们询问Akt抑制剂诱导的过度磷酸化是否也依赖于细胞中的上游激酶。
为了评估PDK1的相关性,我们使用了Berlex Biosciences报道的抑制剂BX-795(5)33对一组220激酶进行BX-795筛选显示,BX-795PI3K-mTORC1途径中仅对PDK1有选择性(补充表1在线)。HA转染HEK293细胞-作为在添加PrINZ之前,用BX-795对Akt1进行预处理(). 观察到PrINZ诱导的Thr308磷酸化显著降低,证实PDK1参与Akt过度磷酸化。有趣的是,BX-795也降低了药物诱导的Ser473的过度磷酸化。虽然目前还不清楚BX-795对Ser473状态的影响的机制基础,但对Akt、HA的非磷酸化Thr308型进行同样的治疗-作为阿克特T308A型发现BX-795不直接影响Ser473磷酸化状态(补充图4在线)。
接下来,我们使用PP242研究了mTORC2的作用(6)是一种ATP-竞争性mTOR激酶抑制剂,它同时抑制mTORC1和mTORC2,并且不抑制PI3K-mTORCl途径中的任何PI3Ks或蛋白激酶8当用HA转染HEK293细胞时-作为Akt1/2/3在用PrINZ治疗前用PP242治疗,Ser473的过度磷酸化被完全抑制(). 在这些条件下,Thr308的磷酸化诱导不受影响。这些结果表明,mTORC2复合物是负责药物诱导的Ser473的Akt过度磷酸化的激酶。
过度磷酸化与Akt信号传导无关
在确定相同的上游激酶导致生长因子信号中的Akt激活和抑制剂诱导的Akt-过度磷酸化后,我们试图了解Akt抑制剂如何导致其过度磷酸化。我们考虑两大类机制——激酶外在的和激酶内在的.一种激酶外在的抑制剂诱导的过度磷酸化机制包括任何形式的抑制剂诱导的通路反馈,它导致通路抑制丧失,导致Akt过度磷酸化。一种激酶内在的其机制包括任何药物引起的对激酶本身的改变,这些改变要么使其成为上游活化剂的更好底物,要么使其失活磷酸酶的更差底物。
激酶的可能性外在的由于下游底物众多,抑制剂诱导的Akt过度磷酸化形式众多1–三是处于已知或未知反馈循环中的候选者。最有可能外在的如雷帕霉素的报道,Akt过度磷酸化的机制是mTORC1/S6K介导的反馈15–19先前的研究表明,A-443654的过度磷酸化发生在TSC2−/−细胞中,该细胞在激活mTORC1方面存在缺陷通过Akt和TSC221然而,mTORC1活性可能由Akt以TSC2独立的方式控制。事实上,最近发现mTORC1激酶活性也受Akt的直接靶点PRAS40调节22,23此外,尚不清楚TSC2−/−细胞是维持正常的PI3K/Akt/mTORC1通路,还是以某种未知的方式补偿TSC2的丢失。
我们使用DG2的研究(7),一种新型选择性S6K抑制剂34然而,与Akt抑制剂诱导的过度磷酸化相比,抑制S6K并不诱导Thr308和Ser473的Akt磷酸化(补充图5在线)。因此,S6K抑制似乎不足以引起直接Akt抑制剂的磷酸化诱导。
自从测试激酶以来外在的抑制剂诱导的Akt过度磷酸化途径需要为每个候选途径开发新的药理学工具,我们试图排除激酶内在的模型,然后进一步研究外在的模型。我们利用了Akt的突变破坏其催化活性。这种突变体不能激活任何下游信号通过底物磷酸化,因此如果需要阻断下游信号来触发Akt过度磷酸化,则在抑制剂存在或不存在的情况下不应诱导过度磷酸化。
结合门卫突变的双突变结构(例如.M227G/M225G用于作为Akt1/2),具有消除激酶活性的突变,Akt1/2的D292A/D289A,缺乏DFG基序的活性位点Asp残基35这是螯合催化必需镁所必需的2+制备并转染到HEK293细胞中。表达激酶死亡(KD)突变体myr-HA的细胞的治疗-作为Akt1-KD或myr-HA-作为带有PrINZ或3-IB-PP1的Akt2-KD诱导Thr308和Ser473显著过度磷酸化。KD突变体上药物诱导的过度磷酸化在数量上与催化活性变体myr-HA相当-作为Akt1或myr-HA-作为Akt2公司(). 非肉豆蔻酰HA-作为Akt1-KD也进行了评估,结果类似(). 在多个细胞系(HEK293、MiaPaCa-2、MCF-7和PC-3)中,包括转化细胞和非转化细胞中,进一步证实了药物诱导的KD变体的过度磷酸化(补充图6在线)。这些结果证实了抑制Akt信号传导与过度磷酸化无关的假设,并支持激酶内在的与ATP位点结合的抑制剂触发过度磷酸化的模型。
过度磷酸化独立于Akt信号转导,由与Akt结合的抑制剂引起(一)激酶活性myr-HA转染HEK293细胞-作为myr-HA的Akt1/2或激酶死亡(KD)形式-作为用2.5µM PrINZ或10µM 3-IB-PP1处理Akt1/2 30 min。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Thr308,Ser473)和GSK3β(Ser9)磷酸化。(b条)激酶活性HA转染HEK293细胞-作为HA的Akt1或激酶死亡(KD)形式-作为用2.5µM PrINZ或10µM 3-IB-PP1处理Akt1 30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt(Thr308,Ser473)和GSK3β(Ser9)磷酸化。(c(c))预期结果示意图外在的和内在的Akt对PrIDZ治疗和HA联合转染的调控-作为Akt1和旗帜-重量如果通路介导的反馈导致Akt过度磷酸化(激酶外在的)然后同一细胞中的所有Akt分子包括HA-作为Akt1和旗帜-重量Akt1应同样过磷酸化。相反,如果ATP位点的占有是过度磷酸化(激酶)的唯一决定因素内在的),则只有能够与药物结合的Akt(HA-作为Akt1)应该被过度磷酸化。(d日)HA共转染HEK293细胞-作为Akt1和旗帜-重量用不同浓度的PrINZ处理Akt1 30 min。细胞裂解物通过以下两种方法进行免疫沉淀反对的-HA或反对的-标记抗体和免疫沉淀通过免疫印迹分析Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。
药物诱导的内在的激酶调节性磷酸化是前所未有的。已经开发出数百种蛋白激酶抑制剂,它们不会触发其靶激酶在激活位点上过度磷酸化。作为对该模型的进一步测试,为了排除来自Akt的任何非催化活性介导信号,我们进行了双Akt转染实验。该实验依赖于HA的联合转染-作为Akt1和旗帜-重量Akt1公司(). 如果ATP位点的占有是过度磷酸化(激酶)的唯一决定因素内在的),则只有能够与药物结合的Akt(HA-作为Akt1)应过磷酸化。HA共转染细胞内-作为Akt1和旗帜-重量Akt1,用PrIDZ处理显示Thr308和Ser473磷酸化仅在HA上诱导-作为Akt1和不在药物不敏感标志上-重量免疫沉淀后的Akt1(). 这一发现表明,Akt下游信号介导的反馈与Akt的过度磷酸化无关(). 标记Akt1的Akt1被Akt抑制剂过度磷酸化的能力被单独确认(补充图7在线)。第二个标记的构造作为还研究了含有mCherry的Akt1,其与内源性Akt的凝胶转变量较大,结果类似(补充图8在线)。
Akt抑制剂诱导Akt膜定位
药物与Akt结合导致激酶介导的Akt过度磷酸化的发现内在的鉴于我们早期发现Akt的膜定位(和补充图3超磷酸化需要药物结合。激酶的一种预测内在的抑制剂诱导的Akt过度磷酸化模型是,药物结合会导致Akt从细胞质重新定位到膜。我们尚未发现已知的激酶抑制剂在结合时诱导其靶激酶的细胞移位。为了确定这种药物诱导的细胞重定位是否确实发生,我们对Akt进行了免疫荧光研究。我们选择使用未转染的HEK293细胞和A-443654,而不是作为Akt转染细胞和PrIDZ,以避免激酶过度表达。特别是,未转染的细胞维持PIP3和Akt之间的生理化学计量,而过量作为Akt分子可能定位错误作为由于PIP3不足,Akt过度表达细胞。用A-443654处理HEK293细胞后,用抗Akt和抗pThr308对固定细胞进行染色,以确定Akt与pAkt的位置。在没有任何生长因子刺激的情况下,A-443654治疗导致Akt移位到质膜(). 此外,膜定位的Akt在Thr308处被磷酸化。此外,PIK90预处理抑制了移位和磷酸化事件。
Akt抑制剂A-443654诱导Akt膜定位在以下所述的各种条件下处理HEK293细胞后,用兔抗Akt或鼠抗pAkt(p308)固定并染色细胞,然后用Alexa 488-共轭山羊抗兔和Alexa 568-共轭羊抗鼠,并用荧光显微镜检查。用载体(DMSO)处理细胞15分钟(顶面板),用2.5µM A-443654处理细胞15 min(中面板),或在添加2.5µM-443654之前,用2.5μM PIK90处理细胞10 min(底面板)。比例尺10µm。
Akti-1,2抑制高磷酸化
默克公司报道了一种变构Akt抑制剂Akti-1,2(8),它在活性位点外结合并抑制在体外激酶活性。有趣的是,在细胞内,Akti-1,2还通过阻止Thr308和Ser473的磷酸化以PH域依赖的方式抑制生长因子刺激的Akt活化36,37虽然Akti-1,2是否能阻止生长因子刺激引起的Akt易位仍存在争议36,37,我们询问Akti-1,2是否抑制ATP-竞争性抑制剂PrIDZ诱导的过度磷酸化。在转染HA的HEK293细胞中-作为Akt1,在PrIDZ诱导过度磷酸化之前用Akti-1,2处理,导致过度磷酸化的剂量依赖性抑制(补充图9在线)。因此,Akti-1,2抑制Akt的生理激活和药物诱导的Akt过度磷酸化。这些结果进一步支持这样的观点,即Akt过度磷酸化的上游调控与生理磷酸化相似,因为两者对Akti-1,2表现出相同的药理学敏感性。
过磷酸化Akt的催化活性
关于药物诱导的Akt过度磷酸化的一个药理学重要问题是,如果抑制剂在Akt被过度磷酸化后解离,那么过度磷酸化Akt是否更具催化活性。我们测量了在体外HA激酶活性-作为PrIDZ诱导细胞过度磷酸化后的Akt1(). HA转染HEK293细胞-作为Akt1用PrIDZ和高磷酸化HA处理-作为Akt1被免疫沉淀。安在体外在彻底清洗免疫沉淀物后进行IP激酶分析,以确保PrIDZ会解离。高磷酸化作为Akt1的活性约为作为根据两个调节位点的磷酸化状态,未经活性位点Akt抑制剂处理的细胞产生的Akt1免疫沉淀。
高磷酸化Akt是高活性的在体外Akt抑制剂解离后HA转染HEK293细胞-作为在有或无血清的情况下培养Akt1过夜,然后用2.5µM PrIDZ处理30分钟,然后用IGF-1(50 ng/ml)刺激10分钟-作为从细胞裂解物中免疫沉淀Akt1并检测Akt活性。数据表示为平均值±SEM(n=8)和IGF-1刺激HA的相对值-作为Akt1活性。通过免疫印迹分析免疫沉淀物的Akt(Thr308,Ser473)磷酸化。
讨论
异常蛋白激酶信号在疾病中的广泛参与,使得蛋白激酶抑制剂的开发成为过去十年来药学研究的主要焦点。大多数激酶抑制剂已被证明通过阻断目标激酶的底物磷酸化和随后的下游通路成分来抑制激酶信号通路。然而,矛盾的是,一些激酶抑制剂,如mTORC1抑制剂雷帕霉素,由于抑制了负反馈回路而激活了靶通路16–19。由于癌症靶向的途径是促进生长的,因此了解哪些途径可能具有主动反馈回路以及哪些激酶负责其控制至关重要,以避免患者中抑制诱导的途径激活15其他激酶抑制剂,包括p38抑制剂SB20358038,Raf抑制剂ZM33637239以及此处研究的Akt抑制剂A-44365421诱导途径成分的磷酸化。我们推断,阐明抑制剂诱导这些激酶磷酸化的机制可能会影响下一代药物的开发。
与雷帕霉素不同,大多数激酶抑制剂具有ATP竞争性,由于脱靶效应,使其作用的分离更加困难。第一个报道的Akt抑制剂A-443654就是一个很好的例子。因此,我们转向化学遗传方法来开发高选择性Akt抑制剂。Akt中的门控蛋白从蛋氨酸突变为甘氨酸,可通过两种抑制剂(3-IB-PP1和PrINZ)选择性抑制,这两种抑制剂对Akt上游或下游的激酶没有影响。所有三种ATP-竞争性抑制剂均诱导其靶点发生相同的过度磷酸化,这表明A-443654诱导的效应也将是其他Akt抑制剂的代表性。事实上,葛兰素史密斯·克莱因发现了另一种ATP-竞争性Akt抑制剂GSK690693,其结构与a-443654完全不同,这也诱导了Akt的过度磷酸化40,41化学遗传抑制剂还证明,所有Akt亚型(1、2和3)都受到相同抑制剂诱导的过度磷酸化作用的影响。
有确凿证据表明ATP-竞争性抑制剂诱导的Akt过度磷酸化具有类别特异性,我们转向对其机制的剖析。我们对新型S6K抑制剂的研究表明,对雷帕霉素驱动反馈的关键介质S6K的抑制不足以引起直接Akt抑制剂的磷酸化诱导。
由于无法通过抑制Akt通路的下游成分诱导Akt过度磷酸化,因此我们研究了药物诱导的Akt超磷酸化的非途径机制。事实上,我们观察到药物诱导的Akt过度磷酸化,无论该激酶是活性的,还是能够在通路下游转导信号,还是它是非活性的。
ATP-竞争性抑制剂结合足以诱导过度磷酸化,而Akt-下游信号抑制的丢失则不会,这一中心结果非常令人惊讶。据我们所知,这种形式的药物诱导激酶调节是前所未有的。我们将这种新形式的激酶调节称为“激酶激活的抑制剂劫持”或内在的与雷帕霉素抑制mTORC1所述的通路水平负反馈调节缺失相区别15–19.
在没有任何Akt通路刺激的情况下,药物与激酶的结合如何诱导其过度磷酸化?我们的研究表明,ATP囊中Akt配体的结合模板Akt磷酸化敏感性的两个变化。第一个作用是通过药物诱导增强Akt PH结构域与PIP3基础水平的结合,从而促进Akt的膜定位。如果药理学或遗传学手段破坏了膜定位,则不会发生药物诱导的Akt过度磷酸化。药物与Akt催化结构域的结合如何影响PH结构域与PIP3的结合?这里的结果表明,Akt抑制剂使PH结构域敏感,从而结合PIP3的基础水平,从而可能通过构象变化促进膜定位模板化的通过抑制剂。最近对Akt动力学的FRET研究表明,Akt的PH结构域通过与Akt激酶结构域的相互作用被隔离在细胞质中,并被诱导可与PIP3结合37,42.
我们对组成性膜定位Akt的研究表明,仅膜定位不足以诱导Akt过度磷酸化。因此,除了膜定位外,Akt的第二个药物依赖性变化是发生过度磷酸化所必需的。第二步涉及两个磷酸化位点(Thr308和Ser473)活性的改变。两种最容易想象的机制要么是对Akt构象的影响,使其更容易受到激酶磷酸化的影响,要么是构象变化,使其不太容易受到磷酸酶去磷酸化的影响。无论是单独机制还是联合作用都可能导致药物诱导的Akt过度磷酸化。然而,考虑到已知Akt的双重磷酸化可将其催化活性提高几个数量级,这表明Thr308-P/Ser-473-P和ATP活性位点之间存在通信方式,因此这种调节可能并不奇怪。
最近对Akt的FRET研究表明,细胞质中PH结构域和激酶结构域之间的分子内相互作用可通过PDK1阻止Thr308磷酸化37,42我们的结果是,通过类比基于FRET的模型,构建了一个缺乏PH结构域的组成性膜定位Akt结构体,该结构体被预测为组成性磷酸化,结果表明a-443654仍然诱导了过度磷酸化(补充图10在线)。因此,PH-激酶结构域界面的破坏似乎不足以单独诱导T308磷酸化。
其他机制内在的激活是可以想象的。Akt相关蛋白伴侣可能负责药物诱导的调节,如蛋白-蛋白联合调节的一些激酶所示43事实上,许多蛋白质被认为参与Akt调节,包括CTMP和Cdc37/HSP9044药物诱导的Akt构象变化随后诱导蛋白质-蛋白质结合的变化将类似于在调节小GTP结合蛋白(小GTP酶)如Ras和Rho中观察到的机制45,46小GTP酶由GTP结合触发,以调节蛋白质相互作用。
在小GTP酶的情况下,配体结构(GTP vs.GDP)控制蛋白质的不同输出(GTP-on/GDP-off)。传统上,激酶被认为是将ATP作为磷酸供体而不是激酶功能的调节器。然而,最近对未折叠蛋白反应调节器Ire1的化学遗传学研究表明,Ire1激酶抑制剂可以绕过对Ire1酶活性的需要来触发未折叠蛋白响应47,48Ire1/激酶抑制剂复合物的结构研究表明,药物结合诱导激酶的构象变化,从而触发Ire1 RNA酶结构域的寡聚和激活49这一先例表明,激酶可以通过配体结合到ATP结合位点的方式进行调节,而不依赖于典型的ATP依赖性磷酸转移反应。随着越来越多的激酶表现出催化活性无关的功能,这些功能可以通过“抑制剂”结合来控制,也许有可能揭示假激酶的功能,即10%的天然缺乏催化活性的人类激酶50.
我们的发现对基于激酶抑制剂的治疗方法的发展意味着什么?我们的研究表明,抑制剂诱导的Akt过度磷酸化在ATP-竞争性Akt抑制剂解离后极为活跃。这些观察结果表明:体内用ATP-竞争性Akt抑制剂治疗,如果药物与Akt分离,酶将是高活性和磷酸化下游靶点,可能促进肿瘤发生。然而,重要的是要认识到,我们只在分离激酶后观察到Akt活性的增强,而在细胞中,我们从未观察到Akt底物磷酸化的增加(以及未示出的数据)。也许T308P和S473P的磷酸酶活性很高,去磷酸化速度足够快,或者我们的洗脱研究从未充分去除Akt中的药物。我们的发现确实增加了许多研究的数量,这些研究揭示了在细胞中观察到的各种形式的激酶抑制剂诱导的反馈激活的重要性,从而保证了对反馈网络的进一步研究外在的(雷帕霉素样)和内在的(Akt-抑制剂类)。
方法
化学合成
除Akti-1/2外,所有化合物均由市售起始原料合成,并通过RP-HPLC进行纯化。请参见补充方法在线获取完整的详细信息。Akti-1/2购自Calbiochem(Akt抑制剂VIII)。
缓冲溶液
缓冲液A:20 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、1%Triton X、2.5 mM焦磷酸钠、1 mMβ-甘油磷酸钠、Complete™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学)、磷酸酶抑制剂鸡尾液1(Sigma-Aldrich)、磷酸化酶抑制剂鸡尾酒2(Sigma Aldric)和20 nM微囊藻毒素LR。缓冲液B:25 mM Tris(pH 7.5)、10 mM氯化镁、5 mMβ-甘油磷酸、0.1 mM正钒酸钠和2 mM DTT。
基于细胞的分析
我们使用HEK293细胞进行基于细胞的分析,而不是使用用于在体外IP激酶分析,因为后者显示PI3K/Akt信号的结构性激活,如Akt的Thr308和Ser473以及GSK3β的Ser9的高水平磷酸化所示(补充图11在线)。相反,HEK293细胞仅表现出基本的PI3K/Akt活性,并且通过IGF-1刺激显著激活。将细胞接种在六孔培养皿中,并根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)与各种质粒以80-90%的汇合率转染。除非另有说明,否则在含有生长因子的正常培养基中对这些Akt表达的HEK293细胞进行药物治疗,如细胞培养截面(补充方法在线)。在所有情况下,二甲基亚砜抑制剂库存均以1:1000的比例使用。
细胞溶解
在药物治疗和/或刺激后,用冰钙分离细胞2+,镁2+游离含0.04%EDTA的PBS(对于HEK293和HEK293T)或用PBS洗涤(对于MCF7、PC-3、MiaPaCa-2和L6),然后在缓冲液A(对于HEK 293、HEK293CF7、PC-3、Mia PaCa-2)或RIPA缓冲液(L6)中溶解。对全细胞裂解物进行离心(14000克然后使用Bradford分析(蛋白质分析试剂盒,Bio-Read实验室)定量上清液中的蛋白质量。
免疫印迹
对细胞裂解物样品进行SDS/PAGE,将蛋白质转移到硝化纤维素膜上(Bio-Rad Laboratories),并用5%脱脂牛奶在0.1%吐温20/Tris缓冲盐(TBST)中封闭。用图图例中描述的5%BSA/TBST中的各种抗体(所有主要抗体均来自细胞信号技术)探测硝化纤维素膜。在5%BSA/TBST中使用适当的过氧化物酶缀合的IgG(Pierce Biotechnology或Santa Cruz Biotechnology)检测一级抗体,并通过暴露于CL-X Posure™膜(Pierce Biotechnology)使用增强化学发光(Pierce Biotechnology)观察蛋白质信号。
免疫沉淀
在缓冲液A中进行细胞裂解后,将每个样品的蛋白质量调整为相同。在4°C的温度下,使用抗-HA亲和矩阵(Roche Applied Science)或抗-Flag®M2琼脂糖(Sigma-Aldrich)对每个样品进行免疫沉淀,每个样品在4°C的温度下用1%的BSA在PBS中预先封闭3小时。用缓冲液A洗涤三次后,用加载缓冲液煮沸使免疫沉淀物变性,并进行免疫印迹。
免疫荧光
HEK293细胞在涂有聚赖氨酸(Aldrich)的盖玻片上培养。在使用图图例中描述的药物处理后,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞一次,并在室温下用4%多聚甲醛在PBS中固定15分钟(rt)。用PBS冲洗三次后,用0.2%Triton X-100在PBS中渗透细胞5分钟,然后用PBS清洗三次。用5%BSA/PBS封闭1小时后,用小鼠单克隆抗Akt抗体和兔单克隆抗pAkt(p308)抗体(均来自Cell Signaling Technology)在4℃过夜培养细胞在2%BSA/PBS中。用PBS洗涤三次后,用Alexa Fluor®488-共轭山羊抗兔IgG和Alexa Fuor®568-共轭羊抗鼠IgG1(均来自Invitrogen)在rt下进一步培养细胞1小时。在用PBS清洗三次和用水清洗一次后,用含有4',6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)的VECTASHIELD®安装介质(Vector Labs)将盖玻片安装在盖玻片上。荧光图像是使用配备有apotome(允许对细胞进行光学切片)的蔡司Axiovert 200M荧光显微镜,使用AxioVision Rel.4.6软件获得的。图中所示的图像是使用蔡司Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil Dic物镜拍摄的。