HNF6在胰腺内分泌和导管分化中的多种时间特异性作用

整个早期胰腺中HNF6的失活导致上皮分支和生长缺陷

HNF6的胚胎表型^Δpanc胰腺癌，同时与全球性疾病有一些相似之处六氟化氢无鼠标(Jacquemin等人，2000年)也表现出明显的差异。与全球一致六氟化氢e14.5敲除HNF6上皮^Δpanc胰腺显示较少分支（比较图3A和B)与对照组相比，未能完全伸向周围间质的远端。突变的胰腺上皮在出生后从未完全填满间质（数据未显示），这表明e14.5 HNF6^Δpanc胰腺的远端生长并不仅仅是发育迟缓。我们观察到HNF6中Ngn3阳性细胞显著减少^Δpance13.5时的胰腺(图3D)与报告内容类似六氟化氢^−/−小鼠(Jacquemin等人，2000年). 以前的研究表明，胰高血糖素表达细胞的数量在六氟化氢^−/−e12.5和e15.5的胚胎，尽管突变体中的α细胞簇总数没有差异(Jacquemin等人，2000年). 在e13.5或e14.5时，我们没有观察到胰高血糖素阳性细胞簇的减少(图1B和图3B、D)尽管α和β细胞的数量在e18.5时减少（数据未显示）。内分泌细胞数量的急剧减少导致HNF6的血糖水平升高^ΔpancP2周龄和3.5周龄小鼠(补充图1). 雄性和雌性之间没有观察到表型差异。六周大时，一些HNF6的随机血糖水平^Δpanc小鼠大于500mg/dl（血糖仪的检测限），因此检测空腹血糖浓度。六氟化氢^Δpanc小鼠的空腹血糖水平明显高于对照组(补充图1). 因此，HNF6^Δpanc出生后不久，小鼠表现出葡萄糖稳态受损，随着年龄的增长，这种情况更加严重。

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图3

HNF6的上皮分支缺陷和内分泌规范_Δpanc胰腺

对照（A）和HNF6^Δpanc（B） 在e14.5时对整个胰腺进行Pdx1（红色）和胰高血糖素（绿色）表达分析。Pdx1阳性免疫标记显示HNF6的上皮分支较少^Δpanc胰腺与对照组比较。（C，D）对照组中Ngn3（绿色）和胰高血糖素（红色）的定位（C）和Hnf6型^Δpanc（D） e13.5胰腺。白线表示内分泌索。D中的箭头表示单个Ngn3号机组⁺此视野中检测到的单元格。

Ngn3表达细胞中HNF6的缺失对β细胞末端分化没有影响

上述表达数据为模型提供了支持，其中仅在发育早期需要HNF6来启动内分泌程序（通过激活Ngn3），但对于进一步的成熟或终末分化步骤不是必需的。为了直接验证这个假设，我们有条件地使其失活六氟化氢在进入内分泌前谱系的细胞中使用Ngn3Cre公司^{生物活性炭}(Schonhoff等人，2004年). 该Cre转基因介导的重组模式重述了内源性Ngn3号机组在内分泌胰腺和肠内分泌细胞中均有表达，非内分泌重组极少（>1%）。使用R26R型报告菌株(索里亚诺，1999年)，我们在e15.5的内分泌簇和内分泌索内的细胞亚群中检测到重组[通过X-gal染色检测β-半乳糖苷酶（β-gal）](图4A、B). 早在e13.5检测到β-gal阳性细胞(图4C)e15.5时，几乎每个Ngn3阳性细胞都表达β-gal(图4D). 许多β-gal阳性细胞不表达Ngn3，很可能是因为这些细胞已经开始分化，不再表达Ngn2，而Ngn3在激素阳性细胞中不表达(Gradwohl等人，2000年). 这些数据表明Ngn3Cre公司^{生物活性炭}转基因能够在发育中的胰腺内早期有效地指导细胞特异性重组。

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图4

Ngn3核心^{生物活性炭}-介导重组有效灭活六氟化氢多能干胰腺祖细胞

Ngn3核心^{生物活性炭};R26R型（对照组）e15.5胰腺全山（A）和横截面（B）用X-gal染色检测重组，并用曙红复染。A中的白线表示胰腺背侧。X-半乳糖染色在内分泌索（箭头）和从内分泌索移出的内分泌簇（箭头）中检测到。通过β-gal（红色）和Ngn3（绿色）在共焦1µm光学切片上的共同定位，早在e13.5（C）时就在对照胰腺中检测到重组；到e15.5（D）时，几乎所有Ngn3都发生了重组⁺细胞。β-gal（红色）和HNF6（绿色）在e13.5的共定标表明，HNF6中的大多数细胞已丢失HNF6蛋白^Δendo胰腺（F）与野生型（E）的比较。箭头表示β-gal和HNF6的共同表达。锂、肝脏；标准、胃；服务提供商、脾脏；整数，肠；dp（差分）胰腺背侧；基，肾脏。比例尺表示10µm（A、B）或20µm。

因为Ngn3⁺/六氟化氢⁺细胞是一个暂时的群体，我们担心Ngn3Cre公司^{生物活性炭}转基因可能不会介导六氟化氢^弗洛克斯等位基因早到足以对内分泌谱系产生影响。Ngn3表达始于e9.5，在e15.5左右达到峰值(Gradwohl等人，2000年;Jensen等人，2000年;Schwitzgebel等人，2000年). 我们发现，在e13.5，Ngn3表达细胞中有很大比例（约70%）共同表达HNF6。e13.5时HNF6和β-gal的表达分析(图4E、F)发现HNF6在约79.3±5.5%的β-gal阳性细胞中共表达六氟化氢^+/+;Ngn3Cre公司^{生物活性炭};R26R型（对照组）胰腺（n=266个细胞）。相比之下，只有27.5±4.8%的β-gal阳性细胞（n=202个细胞）共同表达HNF6六氟化氢^{flox/flox公司};Ngn3Cre公司^{生物活性炭};r26年（HNF6^Δendo)胰腺。这些数据表明Ngn3Cre公司^{生物活性炭}在内分泌谱系中HNF6下调的正常时间之前处于激活状态，并成功灭活大部分暂时性Ngn3中的HNF6⁺/六氟化氢⁺细胞数量。此时仍表达HNF6的剩余β-gal阳性细胞可能代表HNF6蛋白的半衰期更长，或者可能反映出与单个R26R等位基因相比，重组两个HNF6浮动等位基因的延迟时间。

为了确定内分泌特异性HNF6失活对随后的β细胞分化和功能的影响，我们检查了六氟化氢^−/−纳入β和α细胞系的细胞，以及突变细胞是否表达成熟β细胞的已知标记。对照组和HNF6中大多数X-gal阳性细胞^Δendo胰腺共表达胰岛素或胰高血糖素(补充图2). 为了进一步评估β细胞分化，我们分析了Pdx1、MafA和葡萄糖转运蛋白GLUT2的表达(补充图2). 这些蛋白质的定位与对照组相当。

评估β细胞功能体内在八周大时进行IP-GTT。对照组和HNF6组的空腹血糖、血浆胰岛素水平和糖耐量曲线无明显差异^Δendo动物（数据未显示）。此外，在P1或8周龄时，HNF6组的总胰岛素含量相似^Δendo和对照动物（数据未显示）。综上所述，这些数据表明六氟化氢特别是在内分泌谱系的细胞中，不能阻止β细胞末端分化或损害β细胞功能。

持续的HNF6对于将适当数量的祖细胞分配给内分泌谱系是必要的

P2胰腺的形态分析显示HNF6的总内分泌面积略有下降，但具有统计学意义^Δendo突触素免疫组化测定胰腺(图5)与年龄匹配的对照组相比。即使将小鼠置于高脂肪饮食中诱导外周胰岛素抵抗，这种差异也不会对葡萄糖稳态产生负面影响（数据未显示）。谱系标签的形态检测(图5B-E)发现HNF6中非内分泌β-gal表达细胞的数量^Δendo与对照组相比，胰腺增加。重组Ngn3核心^{生物活性炭};R26R型以前曾报道过小鼠的腺泡细胞（0.5–1.8%）或导管细胞（1–5%）比例很小(Schonhoff等人，2004年). 同样，在P2，我们观察到对照小鼠中2.48±0.6%的X-gal表达细胞是非内分泌细胞（n=5；六氟化氢^+/+;Ngn3Cre公司^{生物活性炭};R26R型或六氟化氢^{佛罗里达州/+};Ngn3Cre公司^{生物活性炭};R26R型). 有趣的是，HNF6^Δendo胰腺中X-半乳糖表达细胞并入非内分泌组织的百分比大约增加了六倍（14.60±3.2%；n=3，第页= 0.06). 在腺泡和导管结构中均检测到X-gal表达细胞，且不表达内分泌激素（数据未显示）。

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图5

停用六氟化氢在里面Ngn3号机组-表达细胞导致祖细胞向外分泌谱系的分配增加

（A） 内分泌面积百分比的形态计量分析（突触素⁺细胞）和HNF6^Δendo（n=5）P2胰腺*第页=0.007，由学生的t检验确定；误差条表示平均值的标准误差。P2胰腺的（B，C）X-gal染色表明HNF6外分泌室中重组细胞的比例更大Δendo（C） 胰腺与年龄匹配的对照组相比（B）。X加仑⁺HNF6中的细胞^Δendo胰腺位于腺泡（D）和导管（E）结构中（箭头所示）。是，小岛。比例尺表示200µm（B，C）或50µm。

HNF6中的管道形成缺陷^Δpanc老鼠

肝脏缺陷六氟化氢^−/−导致75%的动物在P1和P10之间死亡(Jacquemin等人，2000年). 由于HNF6在肝脏中的表达在HNF6中没有改变^Δpanc动物（数据未显示），这些动物应考虑出生后HNF6胰腺功能的分析。从e18.5开始，HNF6^Δpanc胰腺在尾部和身体（背胰腺；图6B). 囊肿的大小逐渐增大，到6周龄时，62.5%的突变小鼠（n=16）的囊肿平均为4.19±2.19 cm^三(图6C). 虽然大囊肿主要位于胰腺背侧，但在整个胰腺内都可见扩张的导管上皮。在与囊性上皮密切相关的突变动物中，仅能检测到一小部分腺泡组织，而缺乏囊肿的动物只显示了分支最少的背胰腺（数据未显示）和/或具有扭曲的不规则导管和钙化（数据未示出）。HNF6扩张导管上皮^Δpanc胰腺是多层的(图6E、G)与正常胰腺导管的简单立方到低柱状上皮形成对比(图6D). 胰高血糖素-（数据未显示），胰岛素-(图6E)或在HNF6的多层上皮中检测到Pdx1阳性细胞（数据未显示）^Δpanc但未观察到明确的胰岛。

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图6

HNF6导管异常^Δpanc动物

（A） 野生型消化器官e18.5。（B） HNF6消化器官的大体分析^Δpanc动物胰腺e18.5显示囊性结构（箭头所示）。胰腺囊肿随着动物年龄的增长而逐渐增大（C）。（D） 细胞角蛋白抗体（红色）勾勒出野生型胰腺导管中的简单立方上皮。HNF6中^Δpanc胰腺（E）上皮为多层，在多层上皮内异常发现胰岛素阳性细胞（绿色）。HNF6的H&E染色^{Δ平面布置图}胰腺提示腺泡-导管化生（F，箭头）。细胞角蛋白标记也显示HNF6中鳞状细胞化生的区域^{Δ平面布置图}胰腺（G，箭头）。dp：背胰腺，int：肠，sp：脾，st：胃，vp：腹胰腺。比例尺：单位为A，A和B为100 mm；在F中，D–F为20µm；以G计，20µm。

检测HNF6的多层上皮^Δpanc小鼠增殖活跃，在处死小鼠前6h注射BrdU。用抗pan细胞角蛋白抗体标记导管上皮细胞。在HNF6中观察到导管细胞增殖显著增加^Δpance17.5小鼠（对照组，n=4:4.02%vs.HNF6^Δpanc，n=4:7.79%，p≤0.01）和6周龄（对照组，n=5:0.81%vs.HNF6^Δpanc，n=4:4.66%，p≤0.01）。

HNF6型胰腺炎的形态学和分子特征^Δ潘克动物

在所有HNF6中观察到腺泡导管化生^Δpanc早在P2的小鼠(图6F). 导管上皮中也观察到鳞状细胞化生(图6G). 所有HNF6^Δpanc胰腺（3-6周龄）表现出胰腺炎的形态学特征，包括严重萎缩、腺泡组织丢失和腺泡炎症，腺泡炎症主要为淋巴细胞性(图7B). 胰腺导管高度弯曲(补充图3)，包含分泌物、含铁血黄素的巨噬细胞和腔内的中性粒细胞（数据未显示）。扩张的导管表现为导管周围炎症(图7B、C)，出血(图7D)和纤维化(图7F). 邻近脂肪中存在营养不良钙化(补充图3)表明之前有脂肪坏死。一些HNF6^Δpanc小鼠表现出胰腺炎的其他特征，包括（数据未显示）：胰腺周围脂肪中的中性粒细胞；小导管管腔和导管上皮中的中性粒细胞；肺泡内中性粒细胞和淋巴细胞混合炎性浸润，腺泡损伤区；中性粒细胞散布在导管周间质中；具有侵蚀和急性炎症的大导管。

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图7

HNF6的胰腺炎^Δpanc动物

（A） 野生型成人胰腺切片（i：胰岛）。（B–D）成人HNF6中未检测到胰岛结构^{Δ平面布置图}胰腺。胰腺炎的形态学变化特征包括：腺泡炎症，主要为淋巴细胞（B，星号）、导管周围炎症（C）、管腔中性粒细胞（C，星号。胰腺三色染色显示HNF6导管周围纤维化（蓝色）^{Δ平面布置图}动物（F）与对照组（E）比较。对照组和HNF6胰腺总蛋白的（G，H）Western blot分析^{Δ平面布置图}动物显示HNF6中CTGF和MMP7的表达增加了2.8倍^{Δ平面布置图}动物与对照组的比较。使用密度测定法将蛋白质水平归一化为β-肌动蛋白。Western blot也显示HNF6的p8显著增加^{Δ平面布置图}在对照胰腺（G）中观察到很少p8表达。比例尺：单位为A，A–F为20µm。

以前的研究表明，在人类慢性胰腺炎中，分泌蛋白CTGF的表达增加了4.5倍(di Mola等人，1999年). CTGF参与多种纤维化疾病，并在损伤后的纤维生成和组织重塑中发挥关键作用(di Mola等人，2002年). 一个最近发现的基因，第8页/(核蛋白1;编号1)在人类胰腺炎中也上调，但在正常胰腺中几乎检测不到(Mallo等人，1997年).第8页/编号1在慢性胰腺炎发病期间在腺泡细胞中诱导，作为对抗促凋亡损伤的自卫机制的一部分(Motoo等人，2001年)，在急性胰腺炎中也上调(Mallo等人，1997年). 此外，基质金属蛋白酶-7（MMP7，matrilysin）是锌依赖性细胞外蛋白酶MMP家族的成员，与腺泡-导管化生和胰腺炎相关(克劳福德等人，2002年). 自HNF6^Δpanc小鼠出现胰腺炎和导管周围纤维化，我们检测了HNF6中CTGF的表达^Δpanc和对照小鼠。免疫组织化学显示，正常成人胰腺导管中CTGF的表达水平很低，而HNF6导管中的CTGF表达显著增加^Δpanc动物(补充图4). 胰腺总蛋白提取物的Western blot分析证实HNF6^Δpanc胰腺CTGF和MMP7均增加2.8倍(图7G、H). 我们还观察到HNF6的p8显著增加^Δ潘克胰腺，正常对照组p8表达很少(图7G).

HNF6突变表型的比较揭示了相似性和差异性

尽管HNF6中胰高血糖素阳性细胞的数量在e14.5时没有变化^Δpanc胚胎，我们确实观察到HNF6中Ngn3表达减少^Δpanc在e14.5时，以及随后在e18.5和P2时，胰岛素和胰高血糖素阳性细胞的数量减少，与报道的情况类似六氟化氢^−/−出生后早期没有动物。因此，在这两种模型中，内分泌细胞的减少很可能是由于Ngn3表达细胞数量的减少。

两者之间的差异六氟化氢^−/−和HNF6^Δ潘克观察动物出生后早期的葡萄糖稳态。之前的分析六氟化氢^−/−新生儿P4时血糖下降(Jacquemin等人，2000年); 然而，HNF6^Δpanc在P2时，动物的葡萄糖水平显著升高。六氟化氢在肝脏中高度表达，以前的研究表明HNF6刺激两者的转录葡萄糖激酶(Lannoy等人，2002年)和葡萄糖-6-磷酸酶在肝脏里(Streeper等人，2001年). 观察到的低血糖六氟化氢失去六氟化氢导致肝内糖原储存、糖原分解或糖异生缺陷。HNF6早期高血糖^Δpanc新生儿在没有因失去六氟化氢在肝脏中。

在原始描述中六氟化氢^−/−在新生期存活到成年期的动物中观察到了胰岛，但这些胰岛的结构受到破坏，功能受损(Jacquemin等人，2000年). 相反，HNF6^Δpanc成人胰腺含有单个胰岛素阳性细胞或少于8个细胞的小内分泌簇，但没有明确的胰岛。这种差异的原因目前尚不清楚，但可能是由于两项研究中所用小鼠的遗传背景不同。

HNF6中的管道缺陷^Δpanc动物包括胰腺炎和化生

绝大多数六氟化氢全球零动物在P1和P10之间死亡(Jacquemin等人，2000年). 限制六氟化氢灭活pdx1型-使用Cre-lox技术的表达域允许分析六氟化氢所有突变动物出生后的功能。尽管在六氟化氢无动物(Jacquemin等人，2000年)，这是第一项研究中描述胰腺炎是由于六氟化氢胰腺失活。

CTGF具有多种细胞功能，包括细胞粘附、细胞迁移、生长因子诱导的增殖增强、炎症、纤维化、肿瘤生长和肿瘤转移(Dornhofer等人，2006年). 其表达与胰腺纤维化增加密切相关(di Mola等人，1999年). 因此，HNF6中观察到的纤维化^Δpanc胰腺可能由CTGF增加引起。有趣的是，我们发现发育中胰腺中HNF6的过度表达会导致CTGF表达的减少(Wilding Crawford等人，2008年). 综上所述，我们的结果表明，HNF6对CTGF表达具有负调节作用，尽管目前尚不清楚这是否是由于HNF6与CTGF启动子直接结合所致。

HNF6中观察到p8的增加^Δpanc胰腺进一步支持了这些动物胰腺炎的发展。p8/Nupr1是一种转录辅因子，在正常胰腺中仅低水平表达，但在胰腺炎的初始阶段被诱导，与腺泡再生和增殖相关(Mallo等人，1997年)最近，β细胞增殖(Yanagita等人，2006年). 因此，HNF6中p8表达的诱导^Δpanc胰腺癌可能表明突变腺泡细胞对细胞应激产生保护性反应(Motoo等人，2001年)和/或刺激腺泡细胞和少量β细胞的增殖。

虽然已知胆管阻塞是人类胰腺炎的病因六氟化氢在我们的模型中从总胆管中删除（数据未显示），我们不认为六氟化氢从胆管是观察到的胰腺炎的原因。来自HNF6的胆管^Δpanc动物体型稍小，但没有膨胀或堵塞（数据未显示）。相反，我们假设原发性纤毛的缺陷是HNF6中导管囊肿和化生的主要原因^Δpanc胰腺。初级纤毛存在于大多数脊椎动物的上皮细胞上，对上皮细胞增殖起着负面作用(Pugacheva等人，2007年)通过充当化学或机械传感器，特别是在肝脏、肾脏和胰腺中(达文波特和约德，2005年). 初级纤毛功能是胰腺中适当组织组织成熟和维持所必需的(Cano等人，2004年)橡树岭多囊肾纤毛减少(奥普克)突变小鼠导致异常的管状结构和大量腺泡细胞丢失，与我们在HNF6中观察到的情况类似^Δpanc胰腺。在六氟化氢^−/−与导管细胞中初级纤毛的异常发育和多囊疾病相关基因（即编码HNF-1β和纤毛相关蛋白的基因）的表达降低有关(Pierreux等人，2006年).

包含同源盒的转录因子Prox1，与果蝇属基因繁荣在发育早期几乎所有胰腺祖细胞中表达(Wang等人，2005年). 我们的免疫组织化学分析表明，HNF6在Prox1上游发挥作用，并可能通过Prox1部分调节胰管形态发生。

在HNF6中观察到腺泡-导管和鳞状细胞化生^Δpanc胰腺。慢性胰腺炎引起的导管化生患者患胰腺导管腺癌（PDAC）的相对风险增加16倍(Lowenfels等人，2000年). MMP7在乳腺、前列腺和肠等多种腺组织的癌前病变上皮中表达(Powell等人，1996年)并被认为影响胰腺上皮化生事件的发生和维持(克劳福德等人，2002年). 我们检测到HNF6中MMP7水平升高^Δ潘克动物。此外，在PDAC中检测到CTGF水平升高，并且用人单克隆抗体抑制CTGF已被证明可以减少PDAC小鼠模型中原发性和转移性肿瘤的生长(Dornhofer等人，2006年). 因此，综合起来，这些结果表明六氟化氢胰腺癌可能会增加PDAC或更罕见的胰腺癌，如鳞状细胞癌的风险。

组织学和免疫标记

将解剖组织固定（4%多聚甲醛，4°C，2小时），在乙醇系列中脱水，包埋在石蜡中，并切片至5µm的厚度。冷冻切片用组织固定过夜4°C，在30%蔗糖中培养过夜4℃，嵌入OCT复合物（宾夕法尼亚州西切斯特市VWR Scientific），并在徕卡CM 3050 S低温恒温器上切割5μm切片。

石蜡切片在Citrisolv（Fisher）中脱蜡，并在逐渐减少的乙醇系列中重新水化至蒸馏水。苏木精和伊红（H&E）染色如所述(Offield等人，1996年). 按照制造商的说明（Sigma）进行Masson三色染色。主要抗体按以下稀释液使用：豚鼠抗胰岛素（1/1000，Linco）、兔抗胰高血糖素（1/1000；Linco），兔抗MafA（1/500，Calbiochem）、兔抗体GLUT2（1/500是洛桑大学伯纳德·索伦斯的礼物）、豚鼠抗Pdx1（1/1000是范德比尔特大学克里斯·赖特的礼物），小鼠抗突触素（1/500，Chemicon）、豚鼠抗Ngn3（1/1000，加州大学欧文分校Maike Sander博士赠送）、大鼠抗BrdU（1/400，Accurate Chem Scientific Corp.）、兔抗CTGF（1/1000；俄亥俄州立大学David Brigstock博士赠送），兔抗细胞角蛋白（1/1000、Dako），小鼠抗乙酰化β-微管蛋白（1/5000，Sigma）、兔抗Arl13b/Hennin（1/500，埃默里大学Tamara Caspary博士赠送）、兔抗病毒Prox1（1/500）。检测MafA需要Tris/EGTA抗原检索，检测Pdx1和GLUT2需要柠檬酸钠抗原检索，如前所述(Tweedie等人，2006年); 细胞角蛋白和Arl13b/Hennin的检测需要在初级抗体前用1:1000（Dako）稀释的蛋白酶K进行5分钟的抗原回收。

将冷冻切片解冻至室温，并在PBS中的0.1%Triton中渗透45分钟。主要抗体按以下稀释液使用：兔抗HNF6（1/250，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、豚鼠抗Ngn3（1/1000）、兔抗β-gal（1/5000，MP Biomedicals）、兔反淀粉酶（1/500，德克萨斯西南大学Ray MacDonald的礼物）、抗胰岛素和抗胰高血糖素（如上所述）。所有初级抗体在4°C的加湿室中培养过夜。初级抗体由与Cy2、Cy3或Cy5荧光团结合的驴种特异性二级抗体检测（1/500，Jackson Immunoresearch）。

如有必要，使用蔡司LSM 510共焦显微镜在免疫荧光标记组织上观察1µm光学切片。使用Olympus BX41显微镜和配备Magnafire程序的数码相机（Optronics，Inc.），在亮场照明或适当的滤光片（免疫荧光）下观察其他样品。使用奥林巴斯SZX9解剖显微镜观察整件样品，并使用尼康CoolPix 4300数码相机拍照。每个实验中的TIFF图像在Adobe Photoshop中进行了同等的亮度和对比度处理。

如前所述，使用X-gal检测β-gal活性(Wu等人，1997年). 固定后，在渗透溶液中清洗胰腺两次，每次30分钟。样品在室温下在染色溶液中培养过夜，在4°C的PBS中用4%多聚甲醛固定一小时，并如上所述进行脱水，用异丙醇代替二甲苯，以尽量减少沉淀物的浸出。切片用曙红（Surgipath）反染色进行对比。

形态分析

蛋白质提取和蛋白质印迹

将成年胰腺切开，并立即放入含有蛋白酶抑制剂混合物（0.5 mg/L TPCK、0.5 mg/L TLCK、0.6µM亮肽和2µM pepstatin）、DTT和PMSF的提取缓冲液中。样品均化、离心，上清液根据制造商的说明通过Bio-Rad DC蛋白质分析进行定量。

蛋白质在4–20%Tris-glycine凝胶（Invitrogen）上电泳，并印在PVDF膜上（Amersham Bioscience）。使用以下稀释液在4°C下培养一级抗体过夜：兔抗CTGF（1/5000）；兔抗MMP7抗体（1/1000；范德比尔特大学芭芭拉·芬格尔顿博士赠送）；兔抗p8抗体（1/3500(Path等人，2004年); 兔抗β-肌动蛋白（1:5000；圣克鲁斯生物技术公司）；和兔抗CFTR（1/1000；ABR-亲和生物试剂）。HRP-结合种特异性二级抗体在1%非脂肪乳中稀释至1/10000（抗兔IgG，Santa Cruz）或1/5000（抗鼠IgG（Amersham））或在TBS中稀释至1%BSA，并在室温下孵育1小时。按照制造商的说明，ECL检测系统（Amersham）有助于蛋白质检测。使用Quantity One 4.6软件（Bio-Rad）在分子成像仪FX密度计（Bio-Rad）上定量蛋白质水平，并将其归一化为β-actin，其中对照水平的值为1.0。

我们要感谢Young Ah Oh、Nikul Patel、David Lowe、Kathy D.Shelton、Xue Feng和Venus Childress为本项目提供的专业技术援助，以及Gannon实验室其他成员在整个工作过程中提出的批判性意见和建议。我们感谢Dr。Maria Pino协助BAC文库筛选，Doug Mortlock博士协助BAC重组，Stacey Huppert博士协助胆管检查。试剂由Guoqiang Gu、Ray MacDonald、Maike Sander、Bernard Thorens、Chris Wright和David Brigstock慷慨提供。特别感谢Beatriz Sosa-Pineda博士在出版前传达成果。本研究涉及使用范德比尔特转基因小鼠/ES细胞共享资源、细胞成像共享资源和范德比特激素检测核心（部分由NIH Grants CA68485和DK20593支持）。资金来源：NIH拨款R01 DK65131-01和JDRF职业发展奖，向M.G.拨款2-2002-583。；U19 DK042502-17和U01 DK072473-02至上午。；NIH向A.B.L.拨款DK43673和DK67166。；NRSA发育生物学培训项目，向E.T.A.授予NICHD 5-T32-HD05702。；和JDRF博士后奖学金#3-2006-61至H.Z。