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临床癌症研究。作者手稿；PMC 2010年11月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
《临床癌症研究》，2009年11月15日；15(22): 6820–6829.
2009年11月3日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1078-0432.CCR-09-1558
预防性维修识别码：项目经理2783274
NIHMSID公司：NIHMS141660标准
PMID：19887480

蜗牛促进非小细胞肺癌CXCR2配体依赖性肿瘤进展

Jane Yanagawa女士,1,2,5 托尼亚·瓦尔泽,1,2 李X.朱,1,6 龙胜红,1,三 迈克尔·菲什宾,1,三 Vei Mah公司,三 大卫·恰,1,三 李·古德利克,1,三 大卫·A·埃拉肖夫,1,2,4 杰罗,1,2 克拉拉·马扎尔,三 玛丽亚姆·多哈德瓦拉,1,2,6 杰伊·M·李,1,5 Maie A.圣约翰,1,5 罗伯特·斯特里特,7 谢尔文·夏尔马,1,6和史蒂文·杜比内特1,2,三，6
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

目的

蜗牛作为E-钙粘蛋白的转录抑制因子，主要与上皮-间质转化（EMT）、侵袭和转移有关。然而，其他重要的蜗牛依赖性恶性表型尚未得到充分研究。在这里，我们研究了蜗牛对非小细胞肺癌（NSCLC）进展的贡献。

实验设计

采用免疫组织化学方法对人肺癌组织中蜗牛进行定量和定位，并利用组织芯片分析（TMA）将这些结果与生存率相关联。对基因修饰稳定过表达蜗牛的NSCLC细胞株进行了评估体内在两个严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠肿瘤模型中。使用基因表达微阵列分析评估蜗牛过表达细胞系和对照细胞系之间的差异基因表达。

结果

蜗牛在人类非小细胞肺癌组织中上调，蜗牛高表达与生存率降低相关（p<0.026）。在一个异位模型中，携带蜗牛过表达肿瘤的小鼠产生了增加的原发性肿瘤负担（p=0.008）。在原位模型中，携带过表达蜗牛肿瘤的小鼠也表现出转移增加的趋势。此外，根据肿瘤匀浆中MECA-32（p<0.05）阳性和CXCL8（p=0.002）和CXCL5（p=0.003）浓度，蜗牛过度表达导致原发性肿瘤中血管生成增加。为了证明这些促血管生成化学因子的重要性，通过阻断CXCR2可以消除蜗牛介导的肿瘤负担增加。基因表达分析还揭示了蜗牛相关差异基因表达可能影响血管生成和肺癌进展的不同方面。

结论

蜗牛上调通过促进CXCR2配体介导的肿瘤进展在人类非小细胞肺癌中发挥作用。

关键词：蜗牛、肺癌、血管生成、CXCL8、CXCL5

翻译相关性陈述

我们的研究首次证明了转录抑制因子蜗牛对肺癌进展的贡献，并提出了新干预的潜在途径。首先，我们发现人类肺癌标本中蜗牛的高表达与生存率降低有关，这表明蜗牛的过度表达具有临床意义。其次，我们证明蜗牛过表达导致体内肿瘤生长增强，与血管生成增加和血管生成性CXCR2配体、CXCL8和CXCL5水平相关。重要的是，通过CXCR2阻断可以消除蜗牛介导的肿瘤生长。Snail和CXCR2配体之间的联系引入了Snail表达的操纵，作为影响CXCR2轴和肿瘤血管生成的另一种途径。最后，基因表达谱分析表明，蜗牛过表达影响多种恶性表型，表明以该途径为靶点可以同时解决肿瘤进展的不同方面，并最终改善肺癌患者的预后。

介绍

肺癌的死亡人数超过了前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌的死亡人数之和，使肺癌成为癌症死亡的第一大原因(1). 在这里，我们研究了转录抑制因子蜗牛对非小细胞肺癌进展的作用，以确定改进治疗的潜在途径。

SNAI1（称为蜗牛）是一种锌指转录因子，由一个高度保守的C末端区域组成，该区域包含4-6个锌指，作为识别共有E2-盒型元件（CAGGTG）的DNA结合域(2). 蜗牛通过与启动子内的CAGGTG序列结合，转录抑制粘附连接蛋白E-cadherin，最终诱导EMT(三). E-钙粘蛋白下调和EMT均与肿瘤进展有关(4,5). 蜗牛也被发现在几种恶性肿瘤的发病机制中发挥作用，主要是增强侵袭性和转移行为(6-10). 然而，最近的研究表明，蜗牛可能在致癌过程中发挥更广泛的作用(11). 例如，Kudo-Saito等人(10)研究表明，蜗牛的上调会导致黑色素瘤的促肿瘤免疫抑制。蜗牛上调也与乳腺癌复发有关(12)和对治疗的抵抗(13-15).

一些研究表明，蜗牛也可能在NSCLC肿瘤进展中发挥作用。Dohadwala等人(16)证明PGE2上调NSCLC细胞系（A549）中蜗牛的表达，而Zhuo等人(17)表明Snail在A549中的敲除增加了对顺铂的敏感性。然而，蜗牛在肺癌中的重要性尚不完全清楚。在这里，我们首次证明了蜗牛上调及其与非小细胞肺癌预后的关系。此外，体内利用蜗牛过表达NSCLC细胞系进行的研究表明，蜗牛通过CXCR2配体、CXCL8和CXCL5介导的肿瘤进展和血管生成。

材料和方法

免疫组织化学

切片取自加州大学洛杉矶分校肺癌SPORE组织库（IRB#02-07-011）中存档的人类肺癌标本。用柠檬酸钠10mM pH 6.0（蜗牛和E-钙粘蛋白）或EDTA pH 8.0（Ki67）完成抗原回收。对于单一染色，用10%的正常山羊血清封闭切片，然后用抗蜗牛抗体（ab17732，Abcam，Cambridge，MA）进行探测，使用1:500的工作稀释液进行组织染色，使用1:1600的细胞颗粒染色，或使用1:200的工作稀释度使用Ki67抗体（M7240，Dako，UK）。初级抗体在4°C下培养过夜。与二级抗体孵育后（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA），使用DAB过氧化物酶底物试剂盒（SK-4100，Vector Laboratories）进行染色。为了进行共染色，用蜗牛抗体（1:500）在0.5%酪蛋白中对切片进行检测。添加二级抗体（K4003，Dako）并与DAB一起开发。接下来，将切片与E-cadherin（1:50）在4%℃的2%BSA中培养过夜。用碱性磷酸酶标准物（AK-5000，载体）处理切片，并使用碱性磷酸酶底物试剂盒（SK-5100，载体）进行开发。苏木精可对抗疼痛。为了制造细胞颗粒，将细胞在10%福尔马林中培养6小时，再悬浮在2%琼脂糖中，并包埋石蜡。对于封闭肽控制，按照制造商的说明，用单独的蜗牛抗体（1:500 df）或之前与蜗牛封闭肽（ab19126，Abcam）（1μg/mL）反应30分钟的蜗牛血清（1:500 df）对连续组织切片进行染色。蜗牛的表达由专门研究心肺疾病的病理学家（MCF）进行评估。肿瘤、组织学正常气道和肺泡上皮的评估基于两个标准——强度和阳性率。强度：0级（无染色）到4级（最强烈染色）。阳性率：1级-1-25%，2级-26-50%，3级-51-75%，4级-76-100%。为了比较评估区域，我们将每个区域的强度和阳性率等级相乘，得出代表这两个特征的单个值。使用奥林巴斯BX50显微镜和平面APO物镜获得显微照片。使用Olympus DP11相机和Olympus Cameradia软件生成图像。

为了量化Ki67染色，使用Ariol SL-50自动玻片扫描仪（加利福尼亚州圣何塞市应用成像）对玻片进行分析。使用Ariol分析软件，基于RGB算法、形状和大小等多个参数应用每个图像的阈值。所有分析均采用MultiStain脚本进行。通过合并形状、大小和阈值来提供实际的细胞计数，从而区分单个细胞。最终分析中还包括分析的总组织面积。使用Aperio ImageScope软件获得图像。

肺组织微阵列

TMA是使用加州大学洛杉矶分校病理科存档的石蜡包埋肺样本构建的，这些样本来自根据适当的IRB和HIPAA法规获得的连续累积病例。该TMA的特征已在前面描述过(18)和在中详细表示补充表1蜗牛型肺TMA由一名不了解临床信息的认证病理学家（VM）进行半定量评分。核蜗牛染色根据细胞染色百分比进行量化，与之前描述的方法类似(18). 蜗牛的表达范围为0-100%的综合强度（即频率（F）和强度（i）的测量值；FxI）。因此，蜗牛的表达是一个连续变量。通过使用递归划分结合回归树（rpart软件包）并绘制对数秩P值与风险比的关系，确定75%的临界点。这提供了最佳的二分法点。进行了广泛的内部验证，以防止数据过拟合(19,20).

细胞系

本研究中使用的肺癌细胞系H441（腺癌）、H1437（腺癌细胞）和H292（粘液表皮样细胞）是从美国类型培养收集（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的。细胞稳定转导如下：从含有HindIII和EcoRV的质粒中切除野生型蜗牛cDNA pcDNA3（来自密歇根大学E.Fearon博士的礼物），并将其亚克隆到逆转录病毒载体pLHCX（Clontech，Mountain View，CA）中，其中包括一个耐药性（潮霉素B）标记。所有构建体均通过限制性内切酶消化进行验证。为了生产病毒，70%融合的293T细胞与pLHCX-Snail或pLHCX（单独载体）共同转染。然后用产生蜗牛或pLHCX病毒的高滴度上清液转导肿瘤细胞。转导后，用潮霉素B筛选肿瘤细胞。通过基因分型验证细胞并检测支原体。使用了以下细胞系术语：H441S、H1437S和H292S代表蜗牛过表达细胞系。H441V、H1437V和H292V代表相应的载体控制细胞系。

生长条件

对于二维细胞培养，细胞在含有L-谷氨酰胺（Cellgro，Manassas，VA）的RPMI 1640中生长，并添加10%的FBS（Gemini Bioproducts，加利福尼亚州西萨克拉门托）、1%的青霉素-链霉素（Gibco-Invitrogen，Carlsbad，CA）和350μg/mL的潮霉素B（Hyclone，Logan，UT）。用于三维球体培养(21)，12孔板涂有250μL Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）细胞外基质提取物，生长因子降低，（马里兰州盖瑟斯堡市Trevigen）。然后在37°C下培养板30分钟。在500μL含5%EHS的生长培养基中向每个孔中添加75000个细胞。每三天更换一次这种培养基。细胞保持在37°C和5%CO2使用徕卡DM IRB显微镜、奥林巴斯美国麦格纳菲尔数码相机和软件制作显微照片。

蛋白质斑点

如前所述进行西方分析(16). 根据试剂盒说明书，使用BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce，Rockford，IL）得出蛋白质浓度，并在Bio-rad Benchmark平板读取器（Hercules，CA）上读取。用5%的布洛托脱脂奶粉（加州圣克鲁斯市圣克鲁斯）封闭膜。对于蜗牛（20μg），将膜与抗体（SN9H2，Cell Signaling，Danvers，MA）在4°C下以1:1000的比例孵育过夜，并使用Western Lightning Plus-ECL（NEL105001EA，Perkin Elmer，Waltham，MA）进行培养。对于E-cadherin（20μg），将膜与抗体（610182，BD Transduction Laboratories，San Jose，CA）以1:10000在4°C下培养过夜，并使用Super Signal West Pico化学发光底物（34080，Thermo-Scientific，Waltham，MA）进行开发。

SCID小鼠非小细胞肺癌的生长

在西洛杉矶弗吉尼亚州动物研究中心获得并保存6-12周龄的无病原体SCID米色CB17雌性小鼠。所有研究都得到了该机构动物研究审查委员会的批准。对于异位模型，5×106将每个NSCLC细胞系的细胞植入每只小鼠的左侧皮下。每周评估三次肿瘤生长情况。用卡尺测量每个肿瘤的二等分直径，并用公式0.4×实验室2，其中一表示较长的直径和b条较短的直径。收获时，在含有蛋白酶抑制剂（组织提取试剂I，FNN0071，Invitrogen）的裂解缓冲液中对原发性肿瘤进行均质化。通过离心法清除肿瘤裂解物中的不溶性碎片，以制备用于ELISA分析的匀浆。对于原位模型，1×104将25μl生理盐水中的细胞通过后经胸小切口注入左肺，使用结核菌素注射器和30号针头。在CXCR2阻断实验中，用含有配体结合序列Met-Gly-Glu-Phe-Lys-Val-Asp-Lys-Phe-Asn-Ile-Glu-Asp-Phe-Phe-Ser-Gly的肽（由Robert Strieter博士实验室提供）免疫山羊，产生多克隆山羊抗鼠CXCR2抗体。从接种肿瘤后一天开始，每周五次通过腹腔注射给小鼠注射0.5 ml抗CXCR2抗体或对照抗体（正常山羊血清，G6767，西格玛阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）。

流式细胞术

为了分析瘤内血管形成，用抗MECA-32抗体（553849，BD Bioscience）和同型对照（553927，BD biosciences）评估异种原发性肿瘤的单细胞悬液。为了分析转移的发生率，用CD49b抗体（555498，BD Pharmingen）评估多个器官。使用CellQuest软件在BD FACScan流式细胞仪上分析总共10000个门控事件。

血管生成因子ELISA

根据试剂盒说明书，使用从R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）购买的夹心ELISA试剂盒（DY208和DY254），对初级肿瘤匀浆中的人类CXCL8和CXCL5水平进行定量。A450nm由Vmax动力学微孔板阅读器（分子器件，加利福尼亚州森尼维尔）测定。

增殖试验

为了比较在体外增殖率，细胞被镀在含有100μL/孔生长介质的96周板中，1500个细胞/孔（6孔重复）。24小时后，按照试剂盒说明，在一组平板上进行ATP发光分析（ATPLite 1step luminescence assay Kit，Perkin-Elmer），以获得不同细胞系的基线读数，并使用KCjunior for Windows Data Reduction Software（Bio-Tek）在FLx800微孔板读取器（Bio-Tek、Winooski、VT）中读取。在48小时、72小时和96小时读取随后的平板，并将结果除以相应的基线读数（24小时），以提供随时间的折迭变化。

差异基因表达分析

使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen）采集单个RNA样本。使用Affymetrix基因芯片人类基因组U133 Plus 2.0阵列评估差异基因表达。哈佛dChip软件(22)用于数据分析，并通过西方分析验证了关键发现。对于表1和补充表1，通过比较载体和蜗牛过表达细胞系的总体差异表达情况，使用以下标准进行分析：折叠变化>1.1，组间绝对变化>20，被调用的探针组百分比>20%，配对t检验p值<0.05。为了解释亲本细胞系之间的异质性，补充表2表示探针组在至少一个配对细胞系中发生了显著改变（>10倍）。本出版物中讨论的微阵列数据保存在NCBI的基因表达综合库（GEO系列登录号GSE16194）中。1

表1

与载体控制非小细胞肺癌细胞相比，蜗牛过表达的选定基因经统计学显著性修改（p<0.05）。（↑=上调，↓=下调）

探头组基因加入P值
血管生成
203002_天血管运动素样2（↑）NM_016201号0.044
210845_秒_秒纤溶酶原激活剂尿激酶受体（↑）U08839号0.038
218520_吨坦克结合激酶1（↑）NM_0132540.032
2006年28月_日色氨酸-tRNA合成酶（↑）M61715型0.045
2006年77月_日垂体瘤转化1相互作用蛋白（↑）NM_004339号0.029
204773_吨白细胞介素11受体，α（↑）NM_004512号0.044
227095_安特瘦素受体（↑）AU151151年8月1515日0.028
201109年_月_日血小板反应蛋白1（↑）AV726673号0.048
2011年_月_日血小板反应蛋白1（↑）NM_003246号0.048
211547秒血小板活化因子乙酰水解酶，亚型Ib，α亚单位45kDa（↑）L13387码0.049
2012年6月_日辛迪坎1（↓）Z48199号0.04
201287年_月_日syndecan 1（↓）NM_0029970.034
侵袭和转移
234001天ADP-核糖基化因子GTPase激活蛋白1（↑）AL137744号0.034
214088秒岩藻糖基转移酶3（半乳糖苷3（4）-L-岩藻糖转移酶，包括Lewis血型）（↓）AW080549号0.021
221754秒冠状病毒素，肌动蛋白结合蛋白，1B（↓）AI341234型0.023
细胞周期
202723年_月_日叉头盒O1A（横纹肌肉瘤）（↑）秋冬1174980.038
204604_吨PFTAIRE蛋白激酶1（↑）纳米_0123950.034
1554408_阿特可溶性胸苷激酶1（↓）BC007986号0.008
肿瘤抑制物
213473_安BRCA1相关蛋白（↑）AL042733号0.042
1554006_阿特致死巨型幼虫同源物2（果蝇）（↓）BC006503号0.044

统计

为了比较小鼠实验组之间组织类型之间的染色、细胞系之间的增殖率以及肿瘤重量和分析（流式细胞术和ELISA），使用Wilcoxon检验（秩和或有符号秩，视情况而定）或Student t检验生成p值。为了比较小鼠实验组之间的肿瘤生长曲线，以肿瘤体积为结果，为每个实验构建方差分析（ANOVA）模型。这些模型包括组效应、时间效应和逐时间交互效应。对于CXCR2实验，在对各组进行事后比较之前，进行了总体方差分析模型。对于TMA分析，先前已经描述了统计和合并标准(18). 对于二分法（高表达与低表达）的核蜗牛，使用Kaplan-Meier方法计算存活曲线，并使用log-rank检验进行比较。最佳二分切点位于肺癌组织染色的第75百分位，并使用递归分割回归树确定(23)然后绘制log-rank p值与危险比。使用SOCR进行分析2和R版（2.8）三P值是双侧的，P<0.05被认为是显著的。

结果

蜗牛在人类非小细胞肺癌组织中上调

蜗牛在石蜡包埋肺腺癌（n=11）和鳞状细胞癌（SCC）（n=9）中的免疫定位显示，与周围组织学正常的肺组织相比，肿瘤中的表达增加(图1A类). 淋巴细胞、正常气道和肺泡上皮也偶尔出现蜗牛染色。石蜡包埋的琼脂糖颗粒（由H441V细胞组成）与H1437S颗粒相比，蜗牛染色显示1:1600的差异染色，分别作为阴性和阳性对照。人类非小细胞肺癌组织同型对照样品中没有染色。蜗牛阻断肽能有效抑制腺癌和鳞癌组织的染色(补充图1). 评估蜗牛染色以比较肿瘤和周围正常组织的表达(图1B类). 肿瘤与正常气道之间以及肿瘤与正常肺泡组织之间存在显著差异（p<0.05）。在比较腺癌和鳞癌组织染色时，没有发现显著差异。还对这些NSCLC标本（n=18）进行了共染色，发现在细胞核Snail染色的情况下，膜性E-钙粘蛋白染色呈不均匀模式(图1C类). 在分化较差和浸润性肿瘤较多的区域，E-cadherin的表达往往较少。此外，鳞状细胞癌中心区域的E-钙粘蛋白含量高于正常肺组织附近的浸润边缘。这种表达模式在腺癌中不明显。237例肺腺癌的TMA显示，蜗牛表达水平较高的肿瘤患者的生存率显著降低(图1D类). 对104个肺鳞状细胞癌标本的分析没有发现预后的显著差异（数据未显示）。

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蜗牛在人类非小细胞肺癌组织中表达上调，并与生存率下降相关。A类人非小细胞肺癌组织切片，棕核蜗牛染色。在控件列中，顶部这张图片描绘了石蜡包埋的蜗牛过表达细胞颗粒的蜗牛染色（阳性对照）。中部这张图片显示了载体控制细胞石蜡包埋颗粒的蜗牛染色（阴性对照）。底部这张图片是人类非小细胞肺癌组织，作为阴性的同型对照。B类，评估肿瘤组织以及周围正常气道和肺泡上皮中的蜗牛水平。NS=无统计学意义。误差线代表标准误差（SE），但腺癌与SCC的比较除外，其中误差线代表2SE。C类、非小细胞肺癌组织中的红色膜性E-cadherin和棕色核蜗牛染色，反映了蜗牛存在时E-cadherin的不均匀表达。D类TMA分析生存率与肿瘤蜗牛表达水平的关系，以Kaplan-Meier图表示。（p<0.026）

蜗牛过度表达导致非小细胞肺癌细胞株的形态学改变

Western blot分析证实，在稳定转染到过表达Snail的NSCLC细胞系中，Snail水平升高，E-cadherin相应下调(图2A类). 在二维培养中，蜗牛过表达细胞的特征是具有更多纺锤状形态、更大尺寸和细胞间距增加(图2B类). 三维球体培养中的生长显示H441S与H441V之间的表型差异(图2C类). H441V形成了大的内聚球体，而H441S形成了较小的、明显的非内聚球体。

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蜗牛过度表达导致NSCLC细胞株的形态学改变。A类Western blot分析证实，在稳定转染到过表达Snail的NSCLC细胞系中，Snail上调，同时E-cadherin下调。抗α-管蛋白抗体证实，从全细胞裂解物中获得的蛋白质负载量相等。（全长斑点出现在补充图2.)B类，细胞在传统二维培养中生长。以50倍原始放大倍数获得的图像。比例尺代表100μm。C类，细胞在三维球体培养模型中培养14天。如图所示，在50倍或400倍原始放大倍数下拍摄的照片。原始放大倍数为50倍的照片的比例尺为200μm，而原始放大倍数400倍的照片则为20μm。

蜗牛过度表达促进NSCLC肿瘤进展体内

确定蜗牛过度表达是否调节非小细胞肺癌肿瘤生长体内，我们采用了异位（皮下）SCID小鼠肿瘤模型。随着H441V/H441S或H292V/H292S细胞的植入，蜗牛过表达肿瘤和载体控制肿瘤之间测量肿瘤体积随时间变化的生长曲线显著不同（组和相互作用效应均p<0.001）。最终，与携带载体控制肿瘤的小鼠相比，携带蜗牛过表达肿瘤的小鼠的原发肿瘤负担显著增加（p=0.008）(图3A类/B类). 确定蜗牛过度表达是否影响非小细胞肺癌转移体内，我们使用了原位（经胸）SCID小鼠肿瘤模型。通过流式细胞术对表达CD49b（人类标志物）的肿瘤细胞进行门控，对转移进行定量。虽然没有达到统计学意义，但我们发现H441S肿瘤小鼠的对侧肺、肝脏、骨髓和肾上腺转移增加的趋势(图3C类). H1437V/H1437S原位植入也观察到类似的趋势。使用异位模型，还评估了肝和肺转移的发生率，发现与H441V相比，H441S荷瘤小鼠的肝转移和肺转移发生率升高（数据未显示）。

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蜗牛过度表达导致非小细胞肺癌肿瘤生长增加体内试验。A类，对于异位模型，在生长6周后收获原发肿瘤。（5只小鼠/组）。（p=0.008）B类，肿瘤照片。C类对于原位模型，在生长10周后采集器官（5只小鼠/组），并通过人标志物CD49b门控流式细胞术进行评估。（原发肿瘤部位p=0.025，所有其他部位p>0.05）。误差条代表SE。

蜗牛过度表达与增殖增加有关体内但不是在体外

为了研究蜗牛介导的肿瘤负担增加，采用免疫组织化学方法对从异位模型中获取的H441V/H441S原发肿瘤进行增殖标记Ki67的评估。结果显示蜗牛过表达肿瘤显著升高（p<0.05）(图4A类). 相反，使用在体外增殖试验表明，与配对载体控制细胞系相比，三个过表达蜗牛细胞系中的两个表现出高度显著的增殖劣势(图4B类). （p<0.008）

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蜗牛过度表达导致血管生成增加和血管生成因子水平升高体内试验。A类对从异位模型中获得的肿瘤进行增殖标记Ki67（4只小鼠/组）评估。代表性图像，放大倍数为20倍，插图放大倍数为200倍。20张照片的比例尺等于100μm，而200张照片的比例尺代表25μm。使用Ariol系统量化染色结果。B类，发光分析在体外细胞描述增殖率。结果以发光信号随时间的折叠变化表示。C类，使用异位模型，在生长4周后，通过流式细胞术检测小鼠内皮细胞标记物MECA-32（7只小鼠/组）对产生的原发性肿瘤进行分析。（p<0.05）D类用ELISA法分析原代肿瘤匀浆中两种血管生成因子CXCL8和CXCL5的水平。（12只小鼠/组）误差线等于SE。

蜗牛过度表达导致血管形成增加，血管生成因子CXCL8和CXCL5水平升高

在收获时，人们注意到蜗牛过度表达的肿瘤血管化程度明显更高。为了确定肿瘤生长的增加是否与血管生成的增加有关，采用以小鼠内皮细胞表面标记物MECA-32为门控的流式细胞术对原发性肿瘤进行评估。蜗牛组的水平显著升高(图4C类). 为了评估血管生成因子，还通过ELISA分析了人CXCL8和CXCL5的原代肿瘤匀浆。H441S肿瘤中两种血管生成因子水平均显著升高(图4D类). （p＜0.05）H292S肿瘤也有类似的结果（数据未显示）。相反，通过western blot、多重杂交和ELISA分析，未能显示蜗牛过表达细胞系中CXCL8或CXCL5的持续升高在体外（未显示数据）。观察到CXCR2配体的增加体内可能取决于蜗牛过表达细胞与肿瘤微环境之间的相互作用，而这些微环境没有被表示出来在体外以前的报告也支持肿瘤微环境在CXCR2配体诱导中的关键作用(24,25). 此外，我们的发现得到了文献中几项研究结果的有力支持，这些研究记录了CXCR2配体在人类非小细胞肺癌标本中的水平升高，并与低生存率相关(26-28).

CXCR2阻断可消除蜗牛依赖性肿瘤生长

为了评估蜗牛介导的增殖和肿瘤负担增加在多大程度上依赖于CXCL8和CXCL5水平的升高，我们用中和CXCL8与CXCL5受体CXCR2的抗体治疗了H441S肿瘤小鼠。未经治疗的H441S肿瘤的生长明显大于经CXCR2阻断剂治疗的H44 1S肿瘤（p<0.03）。事实上，抗CXCR2抗体治疗导致H441S肿瘤的生长曲线和重量与H441V肿瘤相当(图5A类/B类). 四个实验组（H441V、未治疗的H441S、用对照抗体治疗的H44 1S和用CXCR2抗体治疗的H 441S）的生长曲线总体比较具有显著的组间和相互作用效应（p<0.001）。当成对检查各组时，除H441V与用CXCR2阻断剂治疗的H441S、未治疗的H44 1S与用对照抗体治疗的H1441S外，所有各组均具有显著的组间和相互作用效应（p<0.001）。

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CXCR2阻断可消除蜗牛依赖性肿瘤生长。使用异位模型，小鼠接种H441V或H441S细胞。携带H441S肿瘤的小鼠被分为三组：未治疗组、用对照抗体治疗组或用抗CXCR2抗体治疗组。A类，生长四周的肿瘤生长曲线（12只小鼠/组）。B类，第五周收获后的肿瘤重量（4只小鼠/组）。误差条代表SE。

蜗牛过表达与肺癌进展的不同方面相关的差异基因表达相关

为了评估上调蜗牛的整体效应，对蜗牛过表达细胞系和相应的载体控制细胞系进行了基因表达分析。dChip分析显示差异基因表达影响肺癌进展的不同方面，包括血管生成、侵袭、细胞周期调节和肿瘤抑制(表1). 中提供了两种分析方法的完整基因列表补充表2和三.

讨论

一些研究表明EMT和E-cadherin减少在非小细胞肺癌中的重要性，但蜗牛对该疾病进展的具体贡献尚未完全探讨。在这里，我们描述了蜗牛在非小细胞肺癌进展中的作用，证明1）蜗牛水平在人类非小细胞肝癌组织样本中升高，并与生存率降低相关；2）蜗牛过表达的非小细胞癌细胞株产生较大的肿瘤体内随着血管生成增强和血管生成因子CXCL8和CXCL5水平升高，以及3）当这些趋化因子的活性被抗CXCR2抗体阻断时，蜗牛介导的肿瘤生长增加被消除。

蜗牛在人类肺癌组织中的免疫定位揭示了重要的意义。首先，蜗牛在非小细胞肺癌组织中显著上调，高表达与预后不良相关。这种相关性与我们的在体外和体内结果包括血管生成增加，E-cadherin下调，CXCR2配体水平升高。事实上，这些事件中的每一个都与非小细胞肺癌预后不良有关(27,29,30)这表明操纵蜗牛可能是解决这些下游事件的一种新方法。其次，免疫组织化学将蜗牛蛋白定位于非小细胞肺癌组织的细胞核。已确定翻译后机制通过调节蜗牛的稳定性和亚细胞定位来控制蜗牛的活动。例如，蜗牛核输出信号和破坏盒的GSK-3β磷酸化诱导其细胞质输出和泛素介导的蛋白酶体降解(31). 另一方面，与炎症微环境的相互作用导致NFkappaB介导的蜗牛核稳定(32). 在这项研究中，蜗牛保持着核的存在，这表明它在非小细胞肺癌的发生中具有转录活性。我们对蜗牛过表达和载体控制细胞系的基因表达分析进一步支持了这一点，该分析揭示了蜗牛促进不同恶性表型的差异特征。最后，尽管在EMT介导的肿瘤进展的经典模型中，转录抑制因子在侵袭边缘表达(33,34)，蜗牛染色出现在整个肿瘤中，侵袭边缘E-cadherin的抑制更为明显。这种E-cadherin梯度在鳞状细胞癌中更为明显，但也与鳞状细胞瘤和腺癌中的浸润性和低分化区域有关。这些结果与其他恶性肿瘤中蜗牛和E-cadherin水平之间存在可变关系的报告一致(35,36). 这种现象发生的机制可能涉及与肿瘤微环境的相互作用(2)并可能反映与其他转录抑制因子（ZEB1）的相互作用(37)和Slug(38)也有人建议在非小细胞肺癌中发挥作用），以及调节蜗牛染色质重塑复合物中的辅阻遏物(39). 这些相互作用是EMT在肿瘤进展研究中的重要研究领域，它们与非小细胞肺癌背景下蜗牛的关系值得进一步研究。

此外，我们的体内和在体外这些发现揭示了蜗牛如何促进非小细胞肺癌的肿瘤进展。在目前的研究中，蜗牛过表达细胞系没有显示出增殖优势在体外其他研究也描述了类似的结果，包括蜗牛介导的部分细胞周期阻滞诱导(2,40,41). 这与我们的调查结果一致；蜗牛过表达细胞系揭示细胞周期相关基因的差异表达(表1). 然而，蜗牛过表达细胞的生长体内导致肿瘤负担显著增加，表明肿瘤生长增强是通过与肿瘤微环境的相互作用介导的。具体而言，我们确定蜗牛过度表达导致血管生成的诱导，而血管生成被认为是肿瘤和基质在癌症进展中最关键的相互作用之一(42). 当血管生成因子和血管抑制因子的平衡被破坏时，就会发生血管生成。基因表达分析表明，在蜗牛过表达细胞系中，许多这种拮抗信号存在差异表达。体内这种失衡的最终结果是与CXCR2配体表达相关的血管增加和肿瘤进展。

CXC趋化因子是一类既有血管生成肽又有血管抑制肽的家族。血管生成肽具有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（ELR）基序，并与单个受体CXCR2结合。ELR的相互作用+带有内皮细胞CXCR2的CXC配体（如CXCL5和CXCL8）可诱导血管生成，大量文献表明CXCR2轴在人类肺癌中很重要(43). 两个CXCL8(44)和CXCL5(26)在人类非小细胞肺癌中升高，这些配体在体内炎症、血管生成和肿瘤的发展已被描述(45,46). 此外，在非小细胞肺癌小鼠肿瘤模型中，使用中和抗体去除CXCR2可减少血管生成(45)以及抑制癌前肺泡病变的进展和诱导KRAS肺泡病变内血管内皮细胞凋亡拉丁美洲国际老鼠(46). 使用在体外包括正常和永生化支气管上皮细胞以及NSCLC细胞系的肺癌发生模型，Sun等人(25)还发现CXCR2配体的表达与从正常到癌前到高度侵袭表型的进展直接相关。值得注意的是，在我们对血管生成因子的评估中，我们还发现蜗牛过度表达肿瘤中的VEGF水平升高。尽管VEGF水平升高，但CXCR2阻断导致了与异种移植模型中蜗牛过度表达相关的肿瘤生长优势的逆转，突显了CXCR2轴的重要性。文献中报道了CXCR2配体和VEGF同时评估的类似结果。例如，Mizukami等人(47)证明敲除肿瘤细胞衍生的HIF-1α可显著抑制肿瘤中VEGF的表达，而不会消除肿瘤相关的血管生成。研究进一步表明，这是活性氧物种和随后NFkappaB活化以及血管生成ELR诱导的结果+CXC趋化因子CXCL8。IL-1β可诱导血管生成性ELR+CXC趋化因子（以及VEGF）与NSCLC血管生成(25). IL-1β产生的血管生成作用在CXCR2被阻断时是可逆的，但在抗VEGF治疗时是不可逆的(25). 这些和其他最近的研究表明，通过可能依赖或独立于VEGF的途径操纵CXCR2轴可能是未来抗血管生成策略的重要组成部分。同样，CXCL8已被证明可以控制内皮细胞中VEGF的表达，这表明CXCR2阻断可能具有下游抗VEGF作用(48). 为了支持这些临床前研究，Schultheis等人(49)也表明CXCL8和CXCR2单核苷酸多态性有助于抗VEGF治疗的耐药性。事实上，最近的一份初步报告表明，CXCR2单核苷酸多态性是与贝伐单抗治疗的非小细胞肺癌患者临床结局相关的遗传变异之一(50). 这些研究表明，CXCR2轴也可能作为VEGF诱导的依赖性途径，补偿VEGF的丢失并介导持续的肿瘤血管生成。

总之，我们首次证明蜗牛在人类非小细胞肺癌中上调，并与生存率降低相关。此外，在小鼠肺癌模型中，蜗牛过表达促进CXCR2轴介导的血管生成和肿瘤进展增加。进一步的研究应能深入了解非小细胞肺癌中蜗牛和蜗牛依赖性恶性表型的调控。

补充材料

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三

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致谢

我们感谢Nam K.Yoon、Lily Zhang、Samson Schatz和Leslie Chen提供的技术援助。

资助：肺癌卓越研究专项计划（SPORE）资助项目P50-CA90388，NCI；LUNGevity/胸外科研究与教育基金会（TSFRE）研究奖学金；加州大学洛杉矶分校肺与危重病护理培训拨款，NIH/NHLBI T32 HL72752；退伍军人事务部医学研究基金；加利福尼亚大学烟草相关疾病项目奖励计划；赖斯家族与皮安斯基家族信托；和早期检测研究网络，NCI CA-86366。

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