Nox家族NADPH氧化酶对活性氧生成的靶向性和调控

摘要

介绍

R（右）反应性氧物种长期以来，在病理学背景下，ROS被认为是在慢性或急性炎症疾病条件下造成组织损伤的罪魁祸首。它们的产生可能与涉及氧中间体的酶反应有关，或者在吞噬细胞的情况下，它们是通过NADPH氧化酶的激活故意产生的，以在吞噬过程中杀死微生物病原体。在过去十年中，人们对各种基本生物过程中蓄意产生活性氧的现象有了新的认识。这些包括发育和分化过程、细胞外基质交联、激素生物合成、细胞衰老、细胞凋亡、氧合反应（氧感应）以及细胞对生长因子、激素和细胞因子的信号反应。在认识到ROS的这些新作用的同时，还发现了与吞噬系统相关的一整套生成ROS的NADPH氧化酶，即现在所称的Nox酶。在已知的七种哺乳动物Nox家族NADPH氧化酶（Nox1万分之一Nox5、Duox1和Duox2）中，已知有几种根据自发或疾病相关突变和靶向基因破坏的影响发挥重要作用。吞噬细胞（Nox2基）氧化酶的缺陷已被发现数十年，导致慢性肉芽肿性疾病（CGD），其特征是对微生物感染的敏感性增强和炎症失调。最近的Nox1基因敲除和过度表达研究揭示了Nox1在血管紧张素II调控血管张力中的作用(20,25,38,68). 内耳耳锥结构的发育需要一种基于Nox3的氧化酶；该系统的突变会导致内耳的平衡和重力感知缺陷(60,78,80). Duox2系统突变的作用揭示了其在人类和小鼠甲状腺激素生物合成中的重要作用(51,74,111). 最近对Nox家族进化起源的调查表明，在植物界和动物界的所有多细胞生物中都存在由这些氧化酶蓄意产生ROS的现象(9,57).

在所有这些与氮氧化物相关的功能中，ROS的产生似乎受到严格的空间和时间调控，以避免对氧化敏感的宿主细胞成分造成间接损害。吞噬细胞安装的呼吸爆发氧化酶通常会在吞噬体内产生强有力的氧化剂，以杀死摄入的微生物(103). 最近对新型Nox家族氧化酶的组成、生物合成、亚细胞靶向性和功能的研究表明，通过控制ROS生成的数量、持续时间和特定位置，氧化组织损伤最小化的多种机制。基于氧化还原的细胞内和细胞外信号可以局限于特定的膜域或隔室，设计用于迁移细胞前沿、内体或受体信号复合体中的局部信号传递(105). Nox4被认为在某些细胞中作为细胞内信号氧化酶发挥作用，这与在核或核周区域检测到的一致(三,39,61,67). 在极化上皮中涉及双氧同工酶的病例中，高过氧化氢（H₂O（运行）₂)生产仅限于用于生物合成目的的顶端质膜或由细胞外过氧化物酶（例如，甲状腺过氧化物酶（TPO）、乳过氧化物酶（LPO）、卵过氧化物酶）支持的其他反应(26). 因此，要全面了解其作为蓄意活性氧发生器的功能，就需要了解调节其活性并将活性酶靶向特定亚细胞隔室的因素，以及它们在这些位点产生的活性氧类型。这篇综述提供了一些Nox家族NADPH氧化酶的调控和功能的最新进展，强调了我们在重组氧化酶系统中的最新发现，在该系统中，我们探讨了影响氧化酶组分亚细胞定位和产生的ROS类型的因素。

Nox家族氧化酶的活性氧生成催化机制

所有Nox家族NADPH氧化酶都是跨膜电子载体，以NADPH为电子源，分子氧为受体(图1). 它们起着生电酶的作用，将电子从细胞质通过膜传递到某些胞质外空间，即细胞外部或细胞内的隔室，如吞噬体、内体、内质网或核周隔室。核心催化Nox组分均含有C末端还原酶结构域，具有保守的NADPH和FAD结合序列。这些结构域锚定在由六个膜嵌入的α-螺旋片段组成的常见含血红素结构域上。在Nox酶的情况下，螺旋3和5都包含两个不变的组氨酸残基，它们位于膜界面附近，协调两个血红素分子。双氧化酶（Duox1和Duox2）具有这些特征，但与另一个跨膜片段具有额外的N端延伸，该跨膜片段之前有一个大的细胞外结构域，显示出与几种血红素过氧化物酶的序列相似性。

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图1。

Nox家族NADPH氧化酶产生活性氧物种（ROS）。所有这些都是生电酶，接受来自胞浆NADPH的电子，通过FAD和膜包埋血红素运输电子，并将单个电子提供给分子氧，从而产生超氧阴离子。在双氧化酶（Duox1和Duox2）的情况下，超氧化物中间体不容易检测到，N末端过氧化物酶样结构域似乎影响其转化为H₂O（运行）₂通过未定义的机制。这些酶最具结构保守性的特征包括结合NADPH和FAD的C末端还原酶结构域区域以及被认为结合血红素的跨膜螺旋段。

根据根据基于Nox2或凤凰（phox）吞噬细胞系统中，一个NADPH分子通过两个单电子到两个氧分子的逐步跨膜转移产生两个超氧离子(21). 尽管最近的研究表明ClC-3阴离子通道通过细胞膜运输超氧化物，但由于超氧物作为带电自由基的不稳定性和该隔间内超氧化物歧化酶的高水平，释放到吞噬体的有效范围是有限的(73,76). 超氧化物自发或催化分解为更稳定和膜渗透性更强的产物H₂O（运行）₂，即使在细胞外也可以检测到它。大多数表达非吞噬细胞Nox酶的重组细胞(即、Nox1、Nox3和Nox5）释放细胞外超氧物，这表明这些氧化酶到达质膜，同样的基于Nox2的ROS生成机制也适用于这些氧化酶(7,56,100). 在几项研究中，H₂O（运行）₂是在Nox4重组细胞中检测到的主要活性氧，与其在细胞内的积聚一致(三,67). 通过灵敏的Diogenes发光分析系统可以检测到Nox4重组细胞中的胞外超氧物(39)或硝基蓝四氮唑，一种到达细胞内隔间的膜渗透性试剂(89). 其他研究声称Nox4在产生H的能力上是独一无二的₂O（运行）₂更直接地说，尽管所涉及的机制尚不清楚(48,108).

双氧化酶表现出与其他Nox同工酶不同的一个重要特征，即它们只产生H₂O（运行）₂，而不是超氧化物。Duox的祖先，神秘的“甲状腺H”₂O（运行）₂发生器”，是一种NADPH氧化酶，只产生H₂O（运行）₂以钙依赖的方式(24,27,77,91,107). 从甲状腺组织中克隆的Duox1和Duox2证实了这些酶的Nox样特征，并揭示了一个额外的跨膜螺旋，在此之前有一个长的细胞外N末端区域，与血液过氧化物酶的同源性为～20%(23,28). 这个域很可能赋予H的独特属性₂O（运行）₂生产。最近通过共同表达各自成熟因子在质膜中重组Duox1和Duox2的研究证实，这些氧化酶产生H₂O（运行）₂从细胞表面，没有检测到的超氧化物(44,72).

氮氧化物酶可分为三个不同的功能群(图2)与活性酶的整体组成有关：（a）Nox1、Nox2和Nox3作为涉及细胞溶质调节蛋白的多组分复合物发挥作用，（b）Nox4具有高组成活性，不依赖于任何支持Nox1，Nox2或Nox3的调节物，以及（c）Nox5，Duox1，和Duox2受钙结合EF-hands的存在导致细胞内钙水平升高的调节(8,41,63,93). 钙结合的EF-hands和C末端还原酶结构域之间的直接相互作用被证明可以激活Nox5(7)许多人推测Duox同工酶是通过类似的机制激活的。

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图2。

活性Nox家族NADPH氧化酶复合物的分子成分。Nox1、Nox2和Nox3作为调节酶发挥作用，涉及细胞溶质衔接蛋白或“Nox组织者”（p47^荧光粉或Noxo1和p40^{凤凰（phox）})和“氮氧化物活化剂”（第67页^{凤凰（phox）}或Noxa1）结合GTP-Rac并影响电子流。第22页^{凤凰（phox）}该组分与Nox核心组分（Nox1-4）形成稳定的异二聚体复合物，这是翻译后处理或成熟为活性氧化酶所必需的。在Nox1–Nox3系统中，p22^{凤凰（phox）}还促进氧化酶的质膜靶向性，并为氮氧化物组织者提供一个对接位置。Nox5和Duox是钙响应性氧化酶，含有钙结合EF-手性。Duox激活物（Duoxa）是功能类似于p22的成熟因子^{凤凰（phox）}最近显示在质膜上与Duox形成稳定的络合物(72).

在大多数情况下（不包括Nox5），这些氧化酶的功能单位被认为是在核心氧化酶黄细胞色素组分和另一个膜嵌入链p22之间形成的异二聚体复合物^{凤凰（phox）}或Duox激活剂（Duoxa）成分，作为参与其完整生物合成的“成熟因子”。Nox2的重要性（gp91^{凤凰（phox）})和p22^{凤凰（phox）}CGD患者中有明显的共表达现象，其中影响任一组分产生的遗传缺陷导致另一组分的水平显著降低，这表明黄烷酶的稳定涉及异二聚体复合物的形成(82,87). 对Nox2生物合成的研究表明，该复合物的形成是多种翻译后修饰（血红素掺入和糖基化）以及内质网外蛋白质移位的必要条件(113). 随后的研究表明Nox1、Nox3和Nox4都与p22形成复合物^{凤凰（phox）}(三,67,98,100). 我们发现Nox1或Nox3的异源过度表达导致p22的细胞重新分布^{凤凰（phox）}从类ER模式到沿质膜堆积，伴随着p22增强^{凤凰（phox）}免疫荧光和免疫印迹检测(图3). 这些发现与用这些氧化酶重建的细胞释放超氧物的情况一致(100)p22的质膜共定位^{凤凰（phox）}在天然氧化酶最丰富的几种组织中具有Nox1、Nox3或Nox4(58,78). 除了影响氧化酶的靶向性和稳定性外，p22^{凤凰（phox）}在基于Nox1-、Nox2-和Nox3的系统中发挥另一种功能，为其胞质调节因子提供对接位点（见下文）。突变实验表明p22^{凤凰（phox）}这一特征在基于Nox4的酶中并不保守，这与其独立于已知的氧化酶细胞溶质调节剂的功能一致(58,108). 需要进一步研究来阐明p22是否^{凤凰（phox）}对基于Nox4的酶或其他一些因子使Nox4逃离内质网至关重要。

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图3。

Nox 1和Nox 3的表达使质膜靶向和稳定p22^{凤凰（phox）}.内源性免疫荧光成像(A类)并转染(B类)第22页^{凤凰（phox）}在HEK293细胞中，显示网状（ER）和核膜(箭头)染色模式。(C)Nox1的转染导致内源性p22的重新分布^{凤凰（phox）}到质膜。(D类)p22的类似再分配^{凤凰（phox）}在Nox3转染的HEK293细胞中发生。未转染细胞（*）主要显示细胞溶质染色模式，整体染色较弱。Western blot分析显示内源性p22增加^{凤凰（phox）}Nox1或Nox3转染细胞中的水平(E类)，但在模拟或Noxo1β转染的HEK293细胞中没有(F类). （经允许修改图6第页，共页(100)和图6参考号(102)).

Duox同工酶还依赖成熟因子（也就是Duox活化因子；Duoxa1或Duoxa2），以便在质膜上重建活性Duox(44). Duoxa2最初被提议作为一种ER-受体蛋白，需要将Duox输出到这个隔间之外，但我们最近的研究表明，Duox成熟因子的作用方式与p22类似^{凤凰（phox）}与质膜上的活性氧化酶形成稳定络合物(72).

多组分氧化酶的调节：Nox1–Nox3

Nox1、Nox2和Nox3的活性都受到细胞溶质调节因子的影响。这些调节机制涉及三种类型的因素：a）与GTP结合的小GTP酶Rac，b）其GTP依赖性靶蛋白，称为Nox激活剂（p67^{凤凰（phox）}或Noxa1），以及c）组织者或衔接蛋白（p47^荧光粉或Noxo1和p40^{凤凰（phox）})负责桥接氮氧化物活化剂和黄细胞色素成分的相互作用。这些氧化酶的调节程度不同，其等级顺序如下：Nox2>Nox1>Nox3，其中Nox2在没有细胞刺激的情况下完全不活动，而Nox3即使在没有这些调节物的情况下也表现出组成活性。Rac2的重要性，第47页^{凤凰（phox）}和第67页^{凤凰（phox）}常染色体隐性遗传性CGD患者的基因损伤影响这些蛋白质，因此Nox2系统的基本成分很明显(65,79,83). Nox2细胞溶质调节因子在非活性构象中的维持在很大程度上解释了这种酶在非刺激细胞中的潜伏期。

p47鉴定后^{凤凰（phox）}和第67页^{凤凰（phox）}同系物(41)，三个小组探索了这些蛋白质（Noxo1和Noxa1）在支持Nox1活性中的作用(7,40,96). Nox组织者（第47页^{凤凰（phox）}和Noxo1）具有通过其PX（phox）结构域与磷脂结合到p22富含脯氨酸（PR）序列的共同结构和功能特性^{凤凰（phox）}通过两个SH3结构域，并通过其羧基末端附近的PR基序连接到Nox激活剂的SH3结构域(图4). p47的PX结构域^{凤凰（phox）}和Noxo1表现出不同的磷脂结合特异性：p47^{凤凰（phox）}与磷脂酸（PA）和PI（3,4）P结合₂(54)而Noxo1与PA和PI（4）P、PI（5）P和PI（3,5）P结合₂(18,95,102). Noxo1缺乏与p47的C末端“自动抑制（AIR）”结构域同源的序列^{凤凰（phox）}包含一个多碱基区域，其中有几个丝氨酸在Nox2复合物的组装和激活过程中被磷酸化(35). Noxo1中AIR的缺失及其磷脂结合特异性可以解释其在缺乏细胞刺激的情况下与质膜的结合(19). 氮氧化物活化剂（p67^{凤凰（phox）}和Noxa1）共享同源四三肽（TRP）支架结构，呈现Rac-binding序列、保守激活域（AD）和PB1（Phox和Bem1）域(图4). Noxa1缺乏中心SH3结构域，其PB1结构域不能结合p40^{凤凰（phox）}(96)，尽管p67的SH3结构域的功能^荧光粉仍然未知。p40^{凤凰（phox）}该组分是第二个衔接蛋白，通过其PX结构域和p67桥接膜脂（PI（3）P）之间的接触^{凤凰（phox）}通过PB1结构域异二聚(图4). Noxa1显示出比Noxo1更广泛的组织分布模式(40,96)而Noxo1的表达受到炎症因子、LPS和TNF-α的上调(55,62).

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图4。

吞噬细胞（A）和非吞噬细胞系统（B）中Nox组织者和激活蛋白中多个模块结构域的示意图。Nox组织者（第47页^{凤凰（phox）}和Noxo1）具有通过PX结构域与磷脂酸（PA）和磷脂酰肌醇脂质结合到p22的共同结构和功能特性^{凤凰（phox）}通过两个SH3结构域，并通过其羧基末端的富含脯氨酸（PR）基序到达Nox激活剂的SH3结构区。氮氧化物活化剂（p67^{凤凰（phox）}和Noxa1）也共享同源四三肽重复序列（TRP）支架，该支架呈现Rac结合序列和激活域（AD）以及PB1（Phox和Bem1）域。p40^{凤凰（phox）}组件是一个二级适配器，在膜（PI（3）P）和p67之间架起桥梁^荧光粉，分别使用PX（phox）结构域和PB1结构域异二聚体。p47中保持闭合构象的分子内自抑制相互作用^{凤凰（phox）}和p40^{凤凰（phox）}描述为虚线.条纹盒子第47页^{凤凰（phox）}AIR和PR基序之间代表341–360残基，增强PX结构域和串联SH3s+AIR构建的结构之间的自抑制相互作用(101).

在未经刺激的吞噬细胞中，吞噬细胞氧化酶（Nox2）是游离的且不活动的：膜穿透的黄细胞色素b条₅₅₈（gp91^荧光粉-第22页^{凤凰（phox）})储存在细胞内颗粒上(13)其他phox蛋白（p47^{凤凰（phox）}，第67页^{凤凰（phox）}和p40^{凤凰（phox）})在单独的三元细胞溶质复合物中结合(64)处于脱磷状态(12,85,88)Rac维持在与Rho-GDI二聚体结合的GDP细胞质复合体中(1). 吞噬细胞激活期间，含有黄细胞色素的细胞内颗粒b条₅₅₈与新形成的吞噬体融合，三元胞质复合体和Rac通过独立机制与这些膜结合(49). 第47页^{凤凰（phox）}被磷酸化(2,35,103)从而诱导构象变化（揭开），促进三元phox细胞质复合体与黄细胞色素的相互作用b条₅₅₈通过其SH3域和p22之间的相互作用^{凤凰（phox）}在其PX结构域和膜磷脂之间(45,54,66,94). “SuperSH3”模型指定了负责屏蔽串联SH3域的AIR相互作用(45)然而，有关精确分子内接触的细节负责掩盖p47的PX结构域^荧光粉仍不清楚。我们报道，341-360残基增强了PX结构域和包含串联SH3和AIR的结构之间的自抑制分子内相互作用(101) (图4和​和5）。5). 此外，最近报道了PX结构域和N末端SH3结构域之间的连接区参与掩蔽(90). 最后，Rac易位到吞噬体(49,99)并与其效应器p67结合^{凤凰（phox）}在Nox2激活的关键调控点以依赖GTP的方式(112)通过电子从细胞质NADPH转移到分子氧，产生超氧阴离子。

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图5：。

p47中构象变化的示意图^{凤凰（phox）} 和p40^{凤凰（phox）} 允许在FcγR-介导的吞噬过程中将三元胞质复合物组装到活性氧化酶中。p47^{凤凰（phox）}PKC依赖性磷酸化通过与p22结合诱导构象变化后，组分作用早期衔接蛋白^{凤凰（phox）}和膜PA和PI（3,4）P₂相反，p40^{凤凰（phox）}在PA和PI（3,4）P的后期，在密封的吞噬体上保留细胞溶质复合体₂因其PX域-PI（3）P和PB1域-p67而消失^{凤凰（phox）}交互（根据参考文献图11的许可进行修改。104). 在早期阶段，I类PI3-激酶(106)和PLD2(15)用于生产PI（3,4）P₂和PA，而在晚期III类PI3-激酶(106)和早期内体(43)服务于PI（3）P的积累。

最近使用p40的研究^{凤凰（phox）}敲除小鼠和FcγIIA受体重组COS^{凤凰（phox）}细胞显示p40^{凤凰（phox）}也是Nox2系统的重要正调节器(33,92). PI（3）P与p40的PX结构域结合^{凤凰（phox）}在激活Nox2系统中发挥关键作用(16,32,34,52)尤其是在FcγR介导的吞噬作用期间(106). 相反，Nox2系统的CD18依赖性激活中存在PX结构域依赖但PI（3）P依赖的调节机制，p40的PI（3^{凤凰（phox）}最近有报道(5,10,97). 我们证明了p40中PX–PB1结构域的分子内相互作用^{凤凰（phox）}渲染p40^{凤凰（phox）}无法在静息状态下与PI（3）P相互作用，并提出在Nox2激活期间，PX–PB1相互作用可以中断，从而使p40^{凤凰（phox）}与富含PI（3）P的吞噬体结合(104). p40内PX-PB1自抑制触点的结构分析^{凤凰（phox）}已报告(50). 随后，我们证明p40^{凤凰（phox）}延长p47的保留时间^{凤凰（phox）}-第67页^{凤凰（phox）}-第40页^{凤凰（phox）}复合物在封闭的吞噬体上，并提出了从p47转换吞噬体膜适配器功能^{凤凰（phox）}至p40^{凤凰（phox）}：第47页^{凤凰（phox）}作为最初的衔接蛋白，将三元复合物带到吞噬体，而p40^{凤凰（phox）}在FcγR介导的氧化爆发期间，作为晚期衔接蛋白保留吞噬体上的复合体(101) (图5). 然而，对于这种组装过程，仍然存在争议和未回答的问题，例如促进p40的机制^{凤凰（phox）}构象变化。

Nox1与p22二聚^{凤凰（phox）}由相关的细胞溶质调节剂Noxo1、Noxoa1和Rac1通过不太严格但非常类似于Nox2系统的机制激活。有趣的是，小鼠Nox1系统具有较高的构成活性(6)而人类Nox1系统有PMA刺激成分，活性增加1.5至3.0倍(40,100,102). 描述了蛋白激酶A介导的Noxa1 Ser172和Ser461磷酸化的负调控机制，这些在小鼠Noxa1中并不保守(59). Nox3与p22二聚^{凤凰（phox）}显示物种特异性差异：重建的小鼠Nox3系统需要Noxa1和Noxo1的最大激活(60)而人类Nox3系统仅与Noxo1一起表现出最大活性(98,100). 与公认的Rac在Nox2系统中的作用相反，使用相同的功能标准，Rac参与Nox1和Nox3系统的证明不太令人信服。Rac的组成活性形式（RacQ61L或RacG12V）或显性负Rac（RacT17N）不影响这些重组细胞系统，因为这些氧化酶对Rac的需求较低。我们基于在重组细胞模型中设计的三个实验证明Rac1参与Nox1和Nox3系统(100)：（a）使用膜靶向形式的Noxa1（Noxa1pp），其支持Nox1或Nox3，独立于Noxo1；该Noxa1突变体与Rac1的C末端10个氨基酸（KKRKRKCLLL）适配。这种活性依赖于与活性Rac1的相互作用；（b） 使用Rac1结合缺陷的Noxa1突变体（Noxa1R103E）或Noxa1结合缺陷（来自晶体学研究的效应器接触位点的突变）的特定Rac1突变（Rac1G30S）；和（c）使用siRNA介导的Rac1敲除，伴随野生型Rac1的拯救实验。随后的两份报告中的类似发现支持Rac1参与Nox1系统(17,69)以及之前的两项研究显示RacG12V和RacGEF对Nox1的影响(55,81). 由于Noxo1的主导作用，对Rac1参与人类Nox3系统的认识一直存在争议(98)然而，随后的两份报告证实Nox3与Noxa1具有相同程度的Rac依赖性(53,93). 在Nox2系统中，Rac与p67的结合^{凤凰（phox）}是Nox2激活的关键调控点(112)，Rac-Noxa1相互作用可能以GTP依赖的方式发生在膜上。

三组描述了人类Noxo1的四种结构变体（α、β、γ和δ），它们是由第三外显子两侧边界上的选择性mRNA剪接引起的，导致其PX结构域内的蛋白质序列变异(18,95,102) (图6). 根据其独特的组织表达模式、亚细胞定位和Nox1或Nox3支持能力，Noxo1β和Noxo1-γ似乎是四种变体中最具生理相关性的亚型(102). 分离的PX结构域或全长Noxo1β和Noxo1-γ蛋白靶向质膜，而Noxo1-α和Noxo 1-δ亚型则倾向于在细胞质中聚集或定位于胞内小泡(图7). 有趣的是，在几种转染细胞模型中，Noxo1γ也定位于细胞核。这些变体的质膜靶向性与其支持氧化酶活性的相对效率密切相关(102).

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图6。

基于与p47序列的比对，预测Noxo1交替剪接PX结构域变体的三维结构^{凤凰（phox）} 和其他PX结构域蛋白。(A类)PX结构域氨基酸序列的比对，显示剪接位点1（从Noxo1α和δ中删除）位于保守的α-helix 1的中间位置，剪接位点2（存在于Noxo 1γ和δ中）插入在其他PX结构区中经常包含富含脯氨酸基序的可变环区。p47中涉及的保守残留物^荧光粉与PA结合用星号（*）标记，而与磷脂酰肌醇脂质结合的标记为上覆的（经允许修改图2参考号的。102). (B类)基于p47结构的Noxo1亚型结构模型^{凤凰（phox）}（PDB编号：1KQ6）。尽管Noxo1γ中插入了五个氨基酸，但PA结合位点的关键残基在β和γ亚型之间没有变化。谷氨酸取代赖氨酸后，PA结合位点在α亚型中的静电特性显著改变(红色箭头). PI结合位点在p47之间基本不变^{凤凰（phox）}和Noxo1亚型(蓝色箭头). （有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本，网址为www.liebertonline.com/ars).

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图7。

HEK293（A）和COS7（B）细胞中PX结构域和全长Noxo1选择性剪接变体的亚细胞定位。Noxo1α（PX）-GFP和Noxo1-α-GFP有聚集或定位于细胞内小泡的趋势。Noxo1β（PX）-GFP和Noxo2β-GFP主要分布在质膜上。Noxo1γ（PX）-GFP和Noxo1-γ-GFP定位于细胞核和质膜。Noxo1δ（PX）-GFP和Noxo1Δ-GFP的定位模式与Noxolα相似。棒材：10μm。（经允许修改图2参考号的。102).

PX结构域被广泛认为是多种细胞内信号蛋白中的磷脂酰肌醇脂质结合模块，尽管它们也与一些蛋白质靶点结合。如上所述，两个p47中都存在分子内蛋白质接触^{凤凰（phox）}和p40^{凤凰（phox）}涉及其PX域。p47^{凤凰（phox）}PX结构域还有另一个显著特征，即具有对PA具有特异性的第二阴离子磷脂结合囊(54). 有趣的是，p47的对齐^{凤凰（phox）}和Noxo1PX结构域蛋白序列显示p47的残基^{凤凰（phox）}PA结合在Noxo1中也保持不变(图6A). 结晶研究表明，p47^{凤凰（phox）}排列在PA结合囊中的残基位于α-helix1中，PR基序之前的序列为：H51、K55、R70、P73和H74(图6B) (54); Noxo1β和Noxo1-γ中相应的对齐残基高度保守：K49、K53、R68、P71和K72(图6A). 与此特征相一致，我们发现除P1外，Noxo1β和Noxo1-γ还与PA结合(4)P、 第1页(5)P、 或PI（3,5）P₂其他人之前演示的绑定(18,95).

基于p47之间紧密的结构相似性^{凤凰（phox）}我们对Noxo1α、β和γ的结构进行了建模-基于p47已解决结构的PX结构域^{凤凰（phox）}（PDB ID:1KQ6）和中的对齐图6A使用DeepView和SwissModel(http://swissmodel.expasy.org) (46). 通过与p47的结构对齐，将硫酸盐和磷脂酰肌醇分子添加到模型中^{凤凰（phox）}和p40^{凤凰（phox）}PX域（PDB ID:1H6H；图6B). Noxo1α亚型中K50的缺失改变了helix-1后半部分中所有氨基酸的注册，这将彻底改变围绕这个高度保守螺旋的PX结构域的整体特征。这通过将赖氨酸侧链替换为谷氨酸侧链来改变PA结合位点的组成。这些变化从结构上解释了这种亚型支持Nox1活性的能力减弱及其聚集趋势(99). Noxo1γ亚型的5-残基插入靠近PA结合位点，但与β亚型相比，它不会改变关键结合残基的位置。这些特征为γ亚型的保存脂质和血浆膜结合活性提供了结构解释，尽管插入了γ亚型。需要进一步研究以了解Noxo1γ核靶向的基础及其在支持该位点氧化酶活性中的作用。

双氧同工酶的靶向和激活

十二指肠酶在粘膜组织的上皮表面表达最高，如主要气道、消化道和泌尿生殖道，以及一些内分泌和外分泌腺，如甲状腺、唾液腺、胰腺和前列腺(23,28,29,31,37,42,86). 在极化上皮中，Duox蛋白沿顶端质膜积聚，在那里释放H₂O（运行）₂支持几种专门的细胞外血液过氧化物酶(14,22,31,37,86). 在甲状腺细胞中，Duox2-dependent H₂O（运行）₂生成激活TPO，TPO催化T_三/T型₄激素发生(74). 在肺和唾液腺中，Duox提供H₂O（运行）₂转化为LPO，将硫氰酸根阴离子转化为杀菌氧化剂次硫氰酸盐(37,42,75,84). 在气液界面培养物中，原代人支气管上皮细胞长期存在于细胞膜上，再分化为成熟的气道表型，导致Duox1表达显著上调(84). 这些培养物的免疫染色表明Duox位于成熟纤毛细胞的顶端(图8). 我们和其他组显示，这些分化的气道模型产生足够的Duox1衍生H₂O（运行）₂有效支持LPO和硫氰酸盐介导的杀微生物活性，对抗多种呼吸道病原体(37,75,84).

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图8。

激光扫描共聚焦免疫荧光检测纤毛原代人支气管上皮细胞顶端质膜表面的Duox。如图所示，融合细胞生长在可渗透的跨孔上，并在气液界面培养系统中再分化25天，其顶端X-Y平面(84). 纤毛细胞，用抗β-微管蛋白抗体染色(红色)，与Duox染色阳性的相同(绿色). 描述X-Y平面旋转的三维重建图像可在补充在线视频显示Duox和β-微管蛋白在极化细胞层的顶端积聚。（参见在线补充视频在www.liebertonline.com). （有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的web版本，网址为网址：www.liebertonline.com/ars).

最初尝试异源表达重组多克斯酶未能重建这些H₂O（运行）₂发电系统。免疫染色和糖基化研究表明，新合成的Duox被阻断在内质网内，而甲状腺细胞Duox积聚在细胞表面并携带Golgi修饰的碳水化合物(22). p67的共表达^{凤凰（phox）}，第47页^{凤凰（phox）}，第22页^{凤凰（phox）}，或者TPO没有拯救细胞表面的活性Duox(22). 此外，通过艰难梭菌毒素B对Duox活性没有影响(36). 使用截短的Duox变体，包含第一个跨膜段和以下45个残基的区域显示为ER滞留信号(71). 最近发现了缺失的Duox成熟因子(44). 膜蛋白Duox激活剂2（Duoxa2）的共同表达使成熟的糖基化Duox2传递到细胞表面，重建氧化酶活性(44). 我们克隆了四个交替拼接的DUOXA1公司并比较了它们支持Duox成熟的能力(72). 缺少第三个编码外显子（第一个细胞外环缩短45 aa）的四个Duoxa1变体中的两个变体（Duoxa1-β和δ）未完全糖基化，不支持Duox活性。有趣的是，我们发现这两种Duox酶都可以被Duoxa1α、Duoxa1-γ或Duoxa2解救，并在细胞表面检测到Duox/Duoxa蛋白(图9). 人体气道切片中Duoxa1的免疫染色也证实了Duoxa1积聚在气道上皮的顶端表面(72). 这些定位结果与最初的研究形成对比，在最初的研究中，Duoxa2被提议为ER居民，即使与Duox2共表达(44). 有趣的是，取决于表达的Duoxa变体，Duox和Duoxa蛋白在我们的模型中的共同定位显示出不同的亚细胞模式：Duoxa1α和Duoxa2分别有效地将Duox1和Duox2靶向质膜并重建高水平的H₂O（运行）₂生成。相反，Duox1或Duox2与Duoxa1γ在一些不同于内质网的细胞内隔间以及质膜内积聚。除了Duox2/Duoxa1α或Duoxa1γ组合外，重组的Duox只产生H₂O（运行）₂，而非超氧物，可与多xa在质膜上形成异二聚体复合物进行免疫沉淀(72,111). 这些发现与之前对天然Duox的观察结果一致，其中没有O₂⁻可以从甲状腺中检测到(4)，肺(42)和海胆酶(47,110). 因此，这些成熟因子不仅在使Duox退出内质网中发挥作用，而且似乎与Duox共同易位，在高尔基体中进行碳水化合物修饰，并影响Duox产生的活性氧类型(72).

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图9：。

Duox成熟因子在Duox同工酶生物合成和ROS生成机制中的作用。DuoxA2和DuoxA1α具有相似的大小和预测的N-糖基化位点。Duoxa1γ具有与果蝇属NIP（麻木相互作用蛋白）。Duoxa1β和δ型(左下角)缺乏外显子3编码序列和两个预测的糖基化位点保留在ER中，不支持活性Duox的生物合成。活性Duox成熟因子（Duoxa1α，γ，Duoxa2）转移到质膜，经历基于高尔基体的碳水化合物修饰并形成稳定的H₂O（运行）₂-生成Duox/Duoxa复合物(左上角). Duox2与Duoxa1α或Dooxa1γ过度表达的活性较弱的组合不会形成质膜Duoxa复合物，表现出较少的碳水化合物加工，并产生超氧物(右上角).

Duox胞外过氧化物酶同源结构域的确切作用尚未确定。与其类似过氧化物的名称相反，它似乎在Duox重组细胞中不起过氧化物消耗核心的作用(72). 的确，H₂O（运行）₂-细胞表面暴露Duox所需外源过氧化物酶对底物的依赖性氧化(37,44,72,84). 在我们手中，有效的Duox重建与细胞表面暴露相关，并且总是需要外源性过氧化物酶来检测H₂O（运行）₂通过氧化三种不同底物（酪氨酸、高香草酸、Amplex Red）生产(72). H（H）₂O（运行）₂形成很可能源于Nox样部分形成超氧化物中间体，过氧化物样结构域随后促进分子内超氧化物歧化或其他导致H₂O（运行）₂释放。在没有Duox成熟因子的情况下，可以从ER-blocked Duox2中测量超氧化物的产生(4)或不形成稳定异二聚体复合物的表面暴露的Duox2/Duoxa1α或Duox2/Dooxa1γ组合(72,111). 在这两种情况下，在缺乏稳定的Duox激活物结合的情况下，Duox酶被不完全加工。因此，Duox激活剂可能在将Duox同工酶加工成专用H₂O（运行）₂或者它们甚至可以作为H的一部分₂O（运行）₂-形成Duox复合物(72).

Duox在细胞中的确切位置成为活性酶尚不清楚，也就是说，在高尔基体内部或到达质膜后。在重组HEK293细胞中，Duox重组与Duox及其成熟因子中基于Golgi的修饰密切相关(72). 作为有毒活性氧的强健生成物，双氧酶可能被设计成只在细胞表面激活，在细胞外释放大量这些产物。甲状腺H₂O（运行）₂仅在顶端检测到，但在细胞内检测不到(11,30,70). 在其他情况下，较低水平的Duox活性可能在细胞内位点发挥其他功能，如参与迁移或增殖的细胞信号传导（即愈合）(109)可能受不同的靶向性、成熟度或调节因素的控制。

总之，NADPH氧化酶的不同Nox家族发挥着各种重要作用，需要在许多组织中蓄意生成ROS。这些酶中的每一种都受到独特机制的影响，这些机制控制产生的活性氧的位置、持续时间、数量和类型，以避免对宿主组织造成间接氧化损伤。多年来，人们已经知道，多组分Nox2基氧化酶受到严格的调控，以便将有效的杀微生物氧化剂导向吞噬体室。最近的研究提供了关于p40的新见解^{凤凰（phox）}-本系统的基础规定。其他密切相关的多组分氧化酶Nox1和Nox3受类似机制控制生物合成、组装和激活位置，涉及p22的参与^{凤凰（phox）}、Rac和类似的组织者和激活蛋白。相反，双氧化酶是特殊的H₂O（运行）₂具有独特成熟、亚细胞靶向和激活机制的生成物，使钙触发的活性氧从细胞表面释放出来，支持多种组织特异性细胞外过氧化物酶。

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