正常和过早衰老的一个标志是染色质的整体变化，包括异染色质结构的丢失、组蛋白修饰模式的改变1–4，关键异染色质蛋白丢失2,三以及持续DNA损伤水平的增加5,6为了阐明导致这些与衰老相关的染色质缺陷的分子机制，我们利用了早衰障碍Hutchinson-Gilford Progeria综合征（HGPS）。这种儿童早期疾病是由层粘连蛋白a/C基因外显子11的复发性低密度点突变引起的(LMNA公司)，编码中间丝蛋白层粘连A和层粘连C，这是细胞核的两种关键结构蛋白7.中的致病突变LMNA公司导致产生一种突变体形式的层粘连蛋白a，称为前体蛋白，其在C末端附近缺乏50 aa，并以显性负向方式作用，导致生理和加速衰老的多个细胞缺陷1,2,8,9特别是，HGPS细胞表现出几种染色质缺陷，这些缺陷也是生理衰老的特征，包括异染色质结构丢失、H3K9和H3K27甲基化丢失、异染色素蛋白HP1下调以及着丝粒周围卫星III重复序列（SatIII）转录增加2,4此外，作为正常老化的细胞，HGPS患者细胞表现出DNA损伤的稳态水平增加三,5.
为了确定老化相关染色质缺陷的分子基础，我们使用层粘连蛋白a（aa 562–664）的C末端区域进行了酵母双杂交筛选，该区域与前体蛋白中缺失的区域重叠(). 我们在四个独立的实验中鉴定了WD40域染色质蛋白RBBP4作为层粘连蛋白a的相互作用物。通过双杂交分析，测试的其他层粘连蛋白A片段（aa 1–118、aa 416–568、aa 604–657）均未与RBBP4相互作用（数据未显示）。通过GST-下拉证实了RBBP4与层粘连蛋白A的aa 562–664片段之间的相互作用(补充图1A). RBBP4和RBBP7是进化保守的组蛋白结合蛋白10它们是参与异染色质建立的几个多蛋白复合物的共享亚单位，包括核小体重塑和脱乙酰酶（NURD）复合物11和Polycomb PRC2复合体12RBBP4也是CAF-1复合物的p48亚基，在DNA复制和DNA损伤修复时组装染色质13为了支持层粘连蛋白a和RBBP4/7之间的物理相互作用，这两种蛋白的重组形式在体外与GST-层粘连蛋白质a（1-664）结合，并延伸至C末端片段（残基390-646）(;补充图1B). 重要的是，这两种蛋白都没有结合到缺乏成熟层粘连蛋白A 607–657残基的GST前体蛋白(). RBBP4和RBBP7与层粘连蛋白A的体内相互作用更弱，通过过表达的单链蛋白（OST）标记的层粘连肽A免疫沉淀内源性RBBP4/7来证实(). 这些结果确定了两种组蛋白伴侣蛋白RBBP4和7作为层粘连蛋白A的相互作用物。
孕激素表达细胞中RBBP4和RBBP7的缺失（A） 层粘连蛋白A的示意图。在Y2H分析中用作诱饵的片段（aa 562–664）下划线。（B） 用重组GST-RBBP4/7和在体外转录和翻译的层粘连蛋白A（aa 1–664）或前体蛋白。（C）从表达One-Strep（OST）标记的层粘着蛋白A的U2OS细胞制备交联蛋白裂解物，然后用链球菌凝集素珠培养。输入和下拉材料用针对所示内源性蛋白的抗体通过Western blot进行检测。（D） 用所示抗体对对照组和HGPS原代皮肤成纤维细胞进行免疫荧光染色。DAPI，4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚。对照细胞和HGPS患者细胞荧光强度信号的定量分析。显示了蛋白质水平降低的细胞百分比。N> 200；值表示至少三个实验的平均值±S.D。在RBBP4实验中，细胞在群体倍增（PD）25左右进行分析，在RBBP7实验中，在群体倍增器（PD）20左右进行分析。在每个实验中，对照细胞与HGPS细胞进行传代匹配。对照组和HGPS皮肤成纤维细胞制备的细胞裂解物的Western blot。（E） 在wt成纤维细胞中诱导（开）或未诱导（关）表达GFP标记的前体蛋白的指示抗体的免疫荧光。箭头表示异染色质蛋白水平降低的细胞。比例尺：10µm。
为了询问RBBP4和RBBP7是否参与老化相关染色质缺陷，我们研究了它们在HGPS细胞中的状态。引人注目的是，与来自健康供体的传代和年龄匹配的对照相比，相当一部分（48+/-2%）的HGPS患者细胞的RBBP4蛋白水平降低，如前所述()2,三在HGPS患者细胞中RBBP7的蛋白水平同样降低(). 正如之前在HGPS细胞中观察到的其他核缺陷一样，细胞群中细胞的减少程度是可变的，但其程度与HGPS中其他几种核蛋白（包括异染色质蛋白HP1的所有亚型）的减少程度相似。此外，RBBP4/7的丢失发生在那些HP1水平较低的细胞中，表明这些细胞中存在全局染色质缺陷()2通过对总细胞裂解物的Western blot分析，证实HGPS皮肤成纤维细胞相对于对照细胞中RBBP4和RBBP7的减少(). 在几个独立的原代HGPS患者细胞系中也进行了类似的观察（数据未显示），正如HP1所观察到的，在细胞传代过程中RBBP4/7减少的程度增加（数据未示出；参考文献。三,4). RBBP4和RBBP7在蛋白水平上下调，因为RT-PCR测定HGPS和对照成纤维细胞中存在类似水平的mRNA(补充图2A). 与RBBP4/7的减少一致，HGPS细胞中着丝粒蛋白CENP-A的水平降低(补充图2B、2C)与早期的观察结果一致，这些观察结果表明，RBBP4和RBBP7伴随siRNA沉默后CENP-A丢失14.
RBBP4和RBBP7的缺失依赖于孕激素。在使用四环素依赖性表达系统在永生化野生型皮肤成纤维细胞中控制诱导GFP标记的孕激素后6与未诱导对照组相比，RBBP4和RBBP7在4天内几乎完全丢失(). 对照蛋白RAD52不受GFP前体蛋白表达的影响(). 相反，通过先前特征化的RNA吗啉方法从HGPS皮肤成纤维细胞中清除前体蛋白前mRNA2与用干扰对照寡核苷酸处理的相同细胞相比，挽救了RBBP4的水平(补充图2D). 此外，用特异性抗孕激素抗体对HGPS原代成纤维细胞进行染色显示，这些细胞中孕激素的表达与RBBP4水平呈负相关(补充图2E). 总的来说，这些结果表明组蛋白伴侣RBBP4和RBBP7在HGPS细胞中以进展依赖的方式丢失。
鉴于RBBP4和RBBP7在各种染色质重塑和组装复合物中的作用，我们假设它们的丢失会导致染色质结构的改变以及过早和正常衰老期间DNA损伤水平的升高。为了直接测试RBBP4/7的缺失是否足以导致这些缺陷，我们分析了siRNA-介导的RBBP4和RBBP7单独或联合敲除后着丝粒周围异染色质的状态(). Western blotting证实了有效的敲除(补充图3A). 正如预期的那样，用非靶向对照siRNA寡核苷酸处理的细胞显示出几个明亮的H3K9me3病灶，对应着丝粒周围异染色质15如这些病灶与识别着丝粒蛋白的CREST抗体部分共定位所证实的(). 在同时敲除RBBP4和RBBP7后，H3K9me3的局部积累消失(). 单独沉默RBBP4或RBBP7不足以引起异染色质改变()，很可能反映了这两种高度相似的蛋白质之间的功能重叠。与之前的观察结果一致14同时沉默RBBP4和RBBP7导致着丝粒蛋白CENP-A的丢失(补充图3B). 为了进一步检测RBBP4和RBBP7是否参与调节HGPS细胞中观察到的染色质缺陷，我们通过半定量RT-PCR探讨了RBBP4、RBBP7缺失对DNA SatIII重复转录的影响(). SatIII重复序列通常保持在转录沉默状态，但在HGPS细胞中被激活，很可能是异染色质破坏的结果4,16在HGPS细胞中观察到，与对照siRNA处理的细胞相比，RBBP4和RBBP7的同时沉默导致SatIII转录的显著增加().
RBBP4和RBBP7沉默后异染色质缺陷和DNA损伤增加（A） 用指定的siRNA组合转染HeLa细胞144小时，并用指定的抗体进行免疫荧光染色。（B） 对所示基因敲除的细胞中富含SatIII G的转录物进行半定量、链特异性RT-PCR分析。（C） 使用α-磷酸-H2AX抗体检测击倒细胞中的DNA损伤。（D） p-H2AX阳性细胞百分比的定量分析（定义为每个细胞含有8个以上的病灶）。数值表示三个实验的平均值±S.D。N> 200。比例尺：10µm。
为了测试RBBP4和RBBP7的缺失是否足以诱导HGPS细胞中DNA损伤水平的增加，我们检测了RBBP4与RBBP7缺失细胞中磷酸化组蛋白H2AX的存在，磷酸化组分H2AX是DNA损伤的标志物17与HGPS患者和老年人的细胞相似，含有多个显著磷酸化H2AX病灶的细胞百分比从对照细胞的5%增加到缺乏RBBP4和RBBP7的细胞的60%以上()三FACS分析检测到S期细胞比例的增加反映了RBBP4/7沉默后内源性DNA损伤的增加(补充图3C、D; Hela细胞P<0.01，U2OS细胞P<0.01），与晚期HGPS细胞S期积累相一致(补充图3E，P<0.01）。而RNAi敲除72小时后，RNAi处理细胞中染色质结构异常的细胞百分比与对照组相比显著增加(补充图4A)，DNA损伤仅在120小时时才明显(补充图4B)这表明DNA损伤之前存在结构染色质缺陷。通过诱导前体蛋白的表达降低RBBP4/7水平后，也获得了类似的结果(补充图5).
RBBP4和RBBP7是参与染色质代谢的多种蛋白复合物的共享亚单位，包括NURD复合物和PRC2复合物11,12此外，RBBP4是CAF-1复合物的一个完整亚单位13为了测试这些复合物中的哪一种能够介导由RBBP4和RBBP7丢失引起的老化相关染色质缺陷，我们测试了HGPS细胞中NURD、CAF-1和PRC2复合物的其他亚单位的状态(). 与RBBP4和RBBP7类似，根据定量单细胞显微镜和Western blotting判断，NURD复合物的另外两个亚单位MTA3和HDAC1在HGPS细胞中大量丢失(). 与层粘连蛋白a对NURD复合体的可能调节作用一致，HDAC1在体内与层粘着蛋白a发生物理相互作用，正如其与OST-lamin a的免疫沉淀所证明的那样(补充图6A). 相反，p150和EZH2（CAF-1和PRC2复合物的催化亚单位）的蛋白质水平在HGPS细胞中不受影响(). HGPS原代成纤维细胞中CAF-1复合物的p60亚单位上调()可能是持续DNA损伤的结果18我们得出结论，HGPS患者细胞中的NURD复合物丢失。
HGPS细胞中NURD亚单位的丢失（A） 用所示抗体对对照组和HGPS原代皮肤成纤维细胞进行免疫荧光染色。（B） 对照和HGPS细胞中荧光强度信号的定量分析。N> 200；数值表示三个实验的平均值±S.D。（C） 用两名健康人和两名HGPS患者皮肤成纤维细胞制备的总细胞裂解物上的指示抗体进行免疫印迹。（D） 在总裂解物或从原代成纤维细胞制备的HDAC1免疫沉淀物中测定HDAC活性。数值表示三个实验的平均值±S.D。比例尺：10µm。
HGPS细胞中HDAC1蛋白的丢失表明，观察到的染色质缺陷可能是由细胞HDAC1脱乙酰酶活性的丧失引起的。为了验证这一假设，我们测量了HGPS患者细胞中HDAC1的活性。与匹配的对照细胞相比，HGPS患者细胞制备的总细胞提取物和HDAC1免疫沉淀物中的HDAC1活性降低了约40%(). 为了直接探讨NURD复合物是否与老化相关染色质缺陷有关，我们分别敲除了Hela细胞中的NURD亚基HDAC1、MTA3、CHD3或CHD4(补充图6B). 以类似于RBBP4/7敲除的方式，任何亚单位的沉默都会增加缺乏H3K9me3和HP1γ异染色质病灶的细胞百分比(). 此外，shRNA介导原代人成纤维细胞中HDAC1、MTA3、CHD3或CHD4的沉默(补充图6C、D)将含有磷酸化H2AX阳性病灶的细胞百分比增加到与HGPS细胞中观察到的水平相似(). 这些结果表明，HGPS细胞中HDAC1活性降低，NURD复合物成分的丢失足以重演一些与老化相关的染色质缺陷。
NURD亚单位沉默后异染色质缺陷和DNA损伤增加（A） 用指示的siRNA转染HeLa细胞96小时，并用指示的抗体进行免疫荧光染色。比例尺：10µm。（B） 定量无H3K9me3或HP1γ焦点的siRNA处理Hela细胞的百分比。数值表示两个实验的平均值±S.D。N> 200。（C） 磷酸化H2AX阳性细胞百分比的定量（定义为每个细胞含有8个以上的病灶）。数值表示三个实验的平均值±S.D。N> 200。比例尺：10µm。
由于与HGPS相关的染色质缺陷也会在生理老化期间发生三最后，我们探讨了正常年龄个体细胞中NURD亚单位的状态。对两名年轻供体（分别为7岁和9岁）的细胞和两名老年供体（各自为92岁和88岁）的传代匹配的原代成纤维细胞进行定量免疫荧光显微镜分析，发现RBBP4、RBBP7和HDAC1蛋白水平存在显著差异(). 来自老年人的细胞群体始终显示，RBBP4、RBBP7和HDAC1蛋白水平降低的细胞百分比增加了4-5倍(). 在单细胞水平上，NURD组分的减少程度彼此严格相关，并且与HP1γ水平密切相关，尽管不如之前所述的HGPS细胞的减少程度明显三与HGPS细胞相比，在正常老化的细胞中未检测到CENP-A的丢失。我们得出结论，NURD的RBBP4、RBBP7和HDAC1亚单位的丢失不仅限于过早老化，而且也是生理老化细胞的一个特征。
生理老化过程中NURD亚基的丢失（A） 对来自健康青年（7岁和9岁）或老年（92岁和88岁）供体的年龄匹配的初级皮肤成纤维细胞进行免疫荧光显微镜检查，并用指示的抗体进行染色。（D） 年轻和老年人皮肤成纤维细胞荧光强度信号的定量分析。N> 200；数值表示三个实验的平均值±S.D。箭头表示异染色质蛋白水平降低的细胞。比例尺：10µm。
在这里，我们已经确定了NURD染色质重塑复合物作为老化相关染色质缺陷的介体。我们证明了进展综合征和正常年龄个体细胞中几个NURD亚单位的减少。这些组分中任何一种的缺失和HDAC1活性的降低都足以重演多个与老化相关的染色质缺陷。这个体内这里观察到的层粘连蛋白A与RBBP4、RBBP7和HDAC1的物理相互作用，先前通过生化分馏提出19，指出核膜在正常细胞NURD复合体功能中的调节作用。
我们发现RBBP4/7的丢失依赖于前体蛋白的存在，并且是出现老化相关染色质缺陷的早期事件。在progerin的诱导或RBBP4和RBBP7的敲除后，异染色质结构发生变化，随后是DNA损伤的积累。我们认为，关键染色质成分RBBP4/7的丢失是与老化相关的染色质缺陷形成的上游事件。RBBP4/7的缺失破坏了组蛋白修饰和高阶染色质结构的建立和维持，可能使染色质更容易受到DNA损伤。DNA损伤的增加可能是受影响的染色质更容易受到损伤或DNA复制受损的结果20有趣的是，与我们观察到的对RBBP4和RBBP7沉默的影响类似，H4K20组蛋白甲基转移酶PR-Set7的损伤，它是与异染色质相关的H4K30适当三甲基化所必需的，干扰DNA复制，使细胞停滞在S期并导致DNA损伤水平增加21,22.
我们发现HGPS和正常老化细胞中有多个NURD成分丢失，这表明NURD复合物的完整性受到损害，其成分在过早老化和生理老化期间表达下调。这些蛋白质的丢失是通过激活特定的蛋白质降解程序还是通过干扰NURD蛋白质复合体的正常内稳态而发生的，尚待确定。progerin影响NURD复合物的几个亚基的蛋白质水平，但不影响其他含RBBP4-或RBBP7-的复合物，如CAF-1或PRC2的蛋白质水平，这表明参与了特定途径。虽然我们不能排除HGPS细胞和正常衰老细胞中NURD成分的降解机制不同，但正常衰老个体的细胞中也低水平表达前体蛋白，这与保守的降解机制一致三总的来说，这些结果表明衰老相关染色质缺陷和DNA损伤积累中NURD重塑复合体功能下降。
材料和方法
细胞培养
初级皮肤成纤维细胞系取自Coriell cell Repository（CCR）的NIA和NIGMS收藏库、美国类型培养物收藏库（ATCC）或Progeria Research Foundation（PRF）。HGPS患者的细胞为AG01972（患者年龄14岁，CCR，购买时人口加倍（PD）20）、AG06297（8岁，CCRPD17）、HGDAFN003（2岁，PRF，PD7）。对照细胞系为CRL-1474（7岁，ATCC，PD19）、GM00038（9岁，CCR，PD17）、AG05247（88岁，CCR-PD15）和AG09602（92岁，CCR.PD12）。在PD 19–27岁时使用细胞。WI-38原代人胎儿成纤维细胞（3个月妊娠胎儿，ATCC，PD8）在PD的10–18岁时使用。所有原代成纤维细胞均在最低基本培养基（MEM，Gibco）、15%FCS、2mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素中培养，培养温度为37°C，培养液浓度为5%CO2表达GFP-孕激素的永生化Tet-off人成纤维细胞的生长和诱导如前所述6将稳定表达One-Strep-Lamin A的U2OS细胞保存在McCoy的5A培养基（Gibco）、10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、10µg/ml速溶菌素（37°C，5%CO）中2.
质粒
表达GST-RBBP4/7的质粒是B.Stillman（纽约州冷泉港）的一份礼物10。层粘连蛋白A和前体蛋白的体外转录和翻译载体构建如下：从pEGFP-lamin A或pEGFP-laminΔ50中切下包含层粘连蛋白质A（1-664）或前体蛋白整个CDS的EcoRI/BamHI片段2分别克隆到使用相同酶切割的pCDNA3.1（−）载体（Invitrogen）中。pGBKT7-lamin A（390-646）是T.Dittmer（NCI/NIH，马里兰州）的一份礼物。N末端单链标签（IBA BioTagnology，德国哥廷根）寡核苷酸（Sigma，荷兰兹维恩德雷赫特）被克隆到pBabe puro的BamHI和EcoRI位点（Plasmid 1764，Addgene）。逆转录病毒pBabe-puro-One-Strep-Lamin A质粒是通过从pBabe-puro-HA-Lamin A载体插入Lamin A而产生的23进入SalI和EcoRI站点。为了生成慢病毒表达系统，在pCDH1-MCS1-EF1-Puro载体（system BioSciences，Mountainview，California，USA）中引入含有多个克隆位点的BamHI和EcoRI，用来自pLenti6/V5-GW/LacZ载体（Invitrogen，Carlsbad，Califor，USA并且将来自pBabe puro One STrEP层粘连蛋白A载体的One STrEP标记的层粘连蛋白A连接到BamHI和EcoRI限制性位点，从而产生慢病毒pCDHblast MCSNard OST层粘连蛋白A载体。酵母双杂交筛选按所述进行24,25
siRNA和shRNA结构
从Dharmacon-Thermo Scientific购买抗人RBBP4和RBBP7的siGenome SMART池siRNA寡核苷酸，并按照制造商说明，使用寡效胺（Invitrogen）或Dharmafect1（Dharmacon-Thermo）在0和72小时将其转染到50 nM的Hela细胞中。RBBP4：
| 目标1： | 5′-GAUACUCGUUCAAACAAUAA（5′-GUACUCGUUCAAAAAAAUA） |
| 目标2： | 5′-GAACUGCCUUUCUUCAAU |
| 目标3： | 5′-GGAUACUCUCAAAAAAU |
| 目标4： | 5′-aacaauacuccuccaaccaa |
| RBBP7： | |
| 目标1： | 5′-GGAUAAGACCUUA |
| 目标2： | 5′-CCACUGGUCUCCACAUAAU公司 |
| 目标3： | 5′-GGACACACUGCUAAGAUUU |
| 目标4： | 5′-AAGUAAACCGUGCUCGUUA |
| HDAC1： | |
| 目标1： | 5′-CUAAUGAGCUUCCAUACAA |
| 目标2： | 5′-GAAGUCUGUUACUACUAC（5′-GaaGUCUUACUAC） |
| 目标3： | 5′-GGACAUCGCUGUGAAUGG |
| 目标4： | 5′-CCGGUCAUGUCAAAGUAA |
| MTA3： | |
| 目标1： | 5′-GCAGAAAACAUCAGUUGAAA |
| 目标2： | 5′-UGACUAGCAUCAUGAUA |
| 目标3： | 5′-CUUCAAUGACAUACGGCAA |
| 目标4： | 5′-GUGCAACAGAACGUCUAA |
| 瑞士法郎3： | |
| 目标1： | 5′-CGUAUGAGCUGAUCAUCACAU |
| 目标2： | 5′-GAGGAAGUACUAUCGUU |
| 目标3： | 5′-GAGGAAGUACUAUCGUU |
| 目标4： | 5′-CAAGAUAGAUCAUAGUG |
| 瑞士法郎4： | |
| 目标1： | 5′-CCAAGGACCUGAUGAUGA公司 |
| 目标2： | 5′-CAAAGUGCUGCUGAUGUA |
| 目标3： | 5′-GAAGAGGCAUCUGUGAAA（5′-GAA） |
| 目标4： | 5′-gaugaouccucaauug |
GIPZ慢病毒载体表达靶向人类HDAC1、MTA3、CHD3和CHD4的shRNAmir序列，按照制造商的说明从Open Biosystems-Thermo Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）购买，并使用FUGENEHD（罗氏）在293FT包装细胞（Invitrogen）中产生病毒。将目标WI38成纤维细胞（约50%融合液）与滤过的病毒上清液和MEM+15%FBS的1:1混合液以及6µg/ml Polybrene（Sigma-Aldrich）孵育8小时。24小时后，用新鲜慢病毒载体上清液进行第二轮感染。第一轮感染后48–72小时，向培养基中添加嘌呤霉素（2µg/ml），以选择表达shRNAmir的细胞。实验在第一轮感染后6天进行。
GIPZ非靶序列：GIPZ无靶序列：5′-TCTCGCTGGGCGAGAGTAAG
HDAC1-A:5′-CCCGAAATCCGCATGACTCATAA
HDAC1-B:5′-AACCCATTCTTCCCGTTCTTAA
MTA3-A:5′-CCCTAATATGGAGTAGATA
MTA3-B:5′-CCGGCCGTTGTTGCTATTAAT
CHD3:5′-AGGAATTACCACTACTATAA
CHD4-A:5′-CGCTGACATCCTATGAATT
CHD4-B:5′-CGCCCTCCAAGACACACATAAT
抗体
以下抗体用于免疫荧光、Western blotting和免疫沉淀：α-HP1γ小鼠单克隆抗体（MAB3450，Chemicon）、α-H3K9me3兔多克隆抗体（4861，由T.Jenuwein善意提供）、α-RBBP4鼠单克隆抗体，α-RAD52兔多克隆（3425，细胞信号）、α-p-H2AX小鼠单克隆（JBW301，Millipore）、α-p-H2AX鼠单克隆（2F3，Abcam）、α-HDAC1兔多克隆，α-EZH2兔多克隆（39103，Active Motif）、α-CHD3兔多克隆物（A301-219A，Bethyl Laboratories）、α-CHD4兔多克隆体（H-242，St.Cruz）、α-CHD4小鼠单克隆物（91984，Genetex）、α-Lamin A山羊多克隆物，α-着丝粒蛋白CREST人类自身免疫血清（抗体公司），α-CENP-A小鼠单克隆抗体（3-19，Abcam）。
免疫荧光显微镜和图像定量
如前所述进行间接免疫荧光显微镜检查2.
如前所述进行定量显微镜测量2,三对于单细胞分析，每个样品至少有200个细胞被计数为三份，直方图中的误差条代表标准偏差。
蛋白质印迹
在PBS中冲洗细胞，并在1X Laemmli SDS-PAGE加载缓冲液中或在含有150 mM NaCl、20 mM Hepes pH 7.4、0.5%NP40、1mM EDTA、10 mMβ-磷酸甘油酯、1 mM NaF、1 mM-Na的缓冲液中溶解细胞三沃4，蛋白酶抑制剂鸡尾酒集III（钙生物化学）。如前所述进行蛋白质印迹和免疫检测2.
重组蛋白的表达和体外结合试验
GST融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS（Promega）中表达，并在谷胱甘肽Sepharose珠上进行亲和纯化（GE Healthcare）。对于在体外结合分析，将固定在谷胱甘肽Sepharose珠上的GST融合蛋白（1–5µg）在NETN150中预洗两次（20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.5%NP40，1 mM DTT），在4°C下用苯甲酸酶孵育30分钟，在NETN1000中洗涤一次，在NETN 150中封闭30分钟，1 mg/ml BSA，然后在NETN180中洗涤两次。[35S] -标记蛋白由在体外使用T7TNTQuick-rabbit网织红细胞裂解物系统（Promega）进行转录/翻译。等量的在体外翻译[35S] -标记的蛋白质在总体积为50µL的NETN150中与GST或适当的GST融合蛋白在4°C的结合缓冲液中孵育1小时。用NETN150洗涤6×珠子，在1×SDS-PAGE Laemmli负载缓冲液中煮沸5 min，并在SDS-PAGE-凝胶上进行解析。凝胶干燥后[35S] 使用Storm 860（分子动力学）可视化标记蛋白。
RNA提取和RT-PCR
按照制造商说明，使用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）从细胞中提取RNA。用Turbo DNA-free DNAse（Ambion）处理RNA，消除残留的基因组DNA污染。在65°C下变性5分钟后，通过使用随机引物和高容量档案cDNA试剂盒（Applied Biosystems）中包含的Mo MulV RT酶逆转录1µg RNA，在42°C下2小时，测量对照和HGPS细胞中的RBBP4和RBBP7 mRNA水平。使用等体积cDNA作为模板，在Biorad iCycler中使用iQ SYBR Green Supermix（Biorad）进行实时Q-PCR反应。反应条件为：95℃下3min，1个循环；95°C下20秒，56°C下30秒，41个循环。生成扩增产物的熔化曲线，以验证是否生成了单个扩增子。底漆：
RBBP4–6-Fw（5′-TCTGTTGGGTCAGTGCTG-3′）
RBBP4–6-Rw（5′-AACTGAGTGGCTGTTTGG-3′）
RBBP7–6-Fw（5′-CTGGCACTCAGTGTGTA-3′）
RBBP7–6-Rw（5′-AGGTGGTTATTGGACCTGGTG-3′）。
所有数值均归一化为内对照亲环素A基因：Cycl-Fw（5′-GTCACCCCCGTGTTCTT-3′）和Cycl-Rw（5’-CTGCTTTTGGGACCTTGT-3′）。
如前所述，对富含G的SatIII转录物链进行逆转录和PCR扩增26.
HDAC1免疫沉淀和HDAC分析
CRL-1474和AG01972原代成纤维细胞在10厘米培养皿中培养，达到70-90%的融合率。在PBS中冲洗细胞并将其重新悬浮在裂解缓冲液中（300 mM NaCl、50 mM Hepes pH 7.4、0.5%NP40、1 mM EDTA、20%甘油、10 mMβ-甘油磷酸、1 mM-NaF、1 mM-Na三沃4，蛋白酶抑制剂鸡尾酒集III（钙生物化学））。将细胞裂解液在4°C下在旋转轮上培养30分钟，然后在12000 g下离心12分钟。使用Bradford分析试剂（Biorad）测量裂解液的总蛋白浓度。用赖氨酸缓冲液将不同样品中等量的蛋白质裂解物（1.5–2.0 mg）稀释至1 ml。用兔免疫血清和蛋白A/G+琼脂糖（St.Cruz）在4°C下孵育1hr，预先清除裂解液，然后用α-HDAC1兔多克隆抗体在4°C下孵养o/n。通过添加蛋白质A/G+琼脂糖捕获免疫复合物。在Lysis缓冲液中清洗珠子5次，并在HDAC分析缓冲液中冲洗两次（见下文）。按照制造商说明，使用Fleur de Lys荧光HDAC分析试剂盒（Biomol）测量总裂解物和HDAC1免疫沉淀物中的HDAC活性。
One-Strep-lamin A下拉
稳定表达One-Strep-laminA的U2OS细胞生长在150mm培养皿中，固定在甲醛中，并在SDS裂解缓冲液（1%SDS，10mM EDTA，50mM Tris pH 8.1）中溶解。经过广泛的超声处理后，通过添加SDS稀释缓冲液（0.01%SDS、1.1%Triton X-100、1.2 mM EDTA、17 mM Tris pH 8.1、170 mM NaCl），裂解液中的SDS浓度降低了10倍。SDS裂解缓冲液和SDS稀释缓冲液均添加了2 mM或钒酸盐和蛋白酶抑制剂（美国印第安纳波利斯Boehringer Mannheim）。未溶解的部分在4度、10000×g下离心10分钟后丢弃。添加在SDS稀释缓冲液中预先洗涤的链球菌凝集素基质（IBA BioTagnology，Göttingen，Germany），并在4°C的转轮o/n上培养样品。广泛清洗沉淀的蛋白质复合物，并通过在95°C下在1X Laemmli SDS-PAGE加载缓冲液中培养从珠中洗脱。
