PHARMACOLOGICAL INHIBITION OF INTEGRIN ALPHAV BETA3 AGGRAVATES EXPERIMENTAL LIVER FIBROSIS AND SUPPRESSES HEPATIC ANGIOGENESIS

E. Patsenker; Y. Popov; F. Stickel; V. Schneider; M. Ledermann; H. Sägesser; G. Niedobitek; S. L. Goodman; D. Schuppan

doi:10.1002/hep.23144

肝病学。作者手稿；PMC 2010年11月1日提供。

以最终编辑形式发布为：

肝病学。2009年11月；50(5): 1501–1511.

数字对象标识：10.1002/hep.23144

PMCID公司：项目经理2779730

美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院156005

PMID：19725105

整合素α-β3对实验性肝纤维化的药物抑制及抑制肝血管生成

E.帕特森克,^1,² Y.波波夫,^1,⁴ F.贴纸,² V.施耐德,² M.莱德曼,² H.Sägesser公司,² G.尼多比泰克,¹ S.L.古德曼,^三和D.舒潘^1,⁴

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关联数据

补充资料: 补充图1。
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补充图2。
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补充表s1。
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摘要

玻璃体凝集素受体整合素αvβ3（αvβ2）通过介导内皮细胞的迁移和增殖促进血管生成，同时也在体外驱动肝星状细胞（HSC）的纤维化激活。除抗纤维化协同作用外，我们在两种肝纤维化体内模型中研究了αvβ3抑制作用。通过胆道结扎（BDL）6周或注射硫代乙酰胺（TAA）12周诱导大鼠肝纤维化。在BDL期间或TAA给药后，每天两次以15 mg/kg的剂量腹腔注射一种特定的αvβ3（αvβ5）抑制剂（西林奈特）。肝胶原被测定为羟脯氨酸，基因表达通过定量PCR定量。通过CD31、CD68和HIF-1α免疫染色评估肝血管生成、巨噬细胞浸润和缺氧。

西林奈特降低了总体血管形成。这在BDL的门区和TAA纤维化大鼠的间隔区中显著，并与肝胶原显著增加31%（BDL）和27%（TAA）以及促纤维化基因和基质金属蛋白酶-13的上调有关。治疗增加了两种模型的GGT，而其他血清标志物保持不变。αvβ3抑制导致轻度肝脏缺氧，缺氧诱导基因的上调证明了这一点。虽然TNF-α、IL-18和COX-2 mRNA的增加表明巨噬细胞适度活化，但巨噬细胞/Kupffer细胞对肝脏的浸润没有影响。

结论

整合素αvβ3（αvβ5）的特异性抑制体内血管生成减少，但胆道（BDL）和间隔（TAA）纤维化加重，尽管其在体外对HSC具有抗纤维化作用。肝纤维化患者应谨慎使用血管生成抑制剂。（248字）。

关键词：血管生成，胶原，肝纤维化，大鼠模型，玻璃体凝集素受体

导言

肝纤维化是许多慢性肝病的典型并发症，其特征是细胞外基质（ECM）过度合成和沉积，ECM主要由胶原蛋白、蛋白聚糖和非胶原蛋白组成。(1)当肝脏受到慢性损伤时，如病毒、自身免疫或酒精等毒素，肝脏会引发一种愈合反应，导致肝纤维化和肝硬化。(2–4)纤维生成效应细胞是活化的肝星状细胞和（肌）成纤维细胞，它们增殖并产生过多的ECM成分，这些成分因纤维溶解而不平衡。虽然肝纤维化进展的机制已经相当清楚，但改变肝纤维化发生和纤维化溶解的平衡以促进纤维化溶解，以及为慢性肝病患者开发安全有效的抗纤维化治疗仍是一个挑战。

整合素αvβ3是一种粘附受体，主要在内皮细胞（EC）上表达，也在一些肿瘤细胞、HSC和炎症细胞，尤其是单核细胞和巨噬细胞上表达。(5–7)它在EC迁移、增殖和血管形成中起着重要作用，其失调参与许多疾病的发病机制，尤其是癌症的发病机制、促进转移和肿瘤诱导的新生血管形成。(8–10)αvβ3及其近亲αvβ5参与上调ECM降解蛋白酶的活性，如基质金属蛋白酶（MMP）-2、-3和-9的活性。(11–13)已开发出小分子抑制剂，通过抑制整合素αvβ3/αvβ5，在几种动物实验肿瘤模型中抑制肿瘤血管生成。(14–16)

异常血管生成明显与肝纤维化的进展有关，被认为是肝硬化肝功能障碍和不可逆转性的主要决定因素。(三,17–19)然而，关于抗血管生成治疗对纤维化的益处的结果存在争议。(20)因此，在喂食胆碱和氨基酸定义饮食的瘦素缺乏的Zucker大鼠中，肝新生血管被确定为纤维化进展的先决条件(21)CCl中血管抑制素或血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂抑制新血管生长₄该模型可减轻肝纤维化。(22,23)相反，在进行性肾功能衰竭的残肾模型中，抑制血管生成加重了肾瘢痕，而应用促血管生成VEGF可减少纤维化并稳定肾功能。(24,25)

为了评估抗血管生成治疗在肝纤维化中的作用，我们选择了西林尼特（EMD121974），这是一种用于人类癌症研究的整合素αvβ3和αvβ5的特异性抑制剂。(26)西棱尼特因其在体内外的特异性抗血管生成作用而被认为是有益的(27,28)以及其体外对HSC的抗增殖和抗纤维化活性。(6)为了得出更一般的结论，我们选择了两种不同的动物模型，即胆管结扎引起的继发性胆道纤维化和硫代乙酰胺引起的全小叶纤维化。

实验程序

材料

西林奈特（EMD121974）来自默克公司（德国达姆施塔特）。西棱尼特（cyclo-Arg-Gly-Asp-D-Phe-（N-甲基）-Val）是整合素αvβ3和αvβ5的选择性拮抗剂，与IC₅₀αvβ3的3nM值、αvβ5的37nM值和αvβ6的470nM值(29). 在25mM的无热原磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中溶解西林奈特。

动物实验

动物实验得到了下佛朗哥政府（许可编号：621.2531.31–20/00）和瑞士国家动物伦理委员会（许可编号为105/04）的批准。20只雄性成年Wistar大鼠，体重230–250克（德国苏尔兹费尔德Charles River），在乙醚麻醉下接受腹部中线切口，并用5-0丝绸双重结扎胆总管（德国埃塞孔Perma-hand）。六只老鼠被误操作并作为对照。BDL后1w开始每天两次腹腔注射西林奈特15mg/kg（n=9）。(30)

硫代乙酰胺（TAA）以200mg/kg的剂量每周施用两次，持续12w。(31)西棱尼特15mg/kg，每日两次，持续8w（n=8）。未经治疗的TAA诱导纤维化动物作为对照组（n=7）。大鼠在氯胺酮麻醉下通过门静脉放血处死。组织固定在4%福尔马林中或在液氮中快速冷冻以进行进一步分析。

羟脯氨酸测定

如前所述，从左肝和右肝叶（220–260mg）中生化测定羟脯氨酸（HYP）。(32)

定量实时PCR

将150–200mg组织在1ml RNApure（德国埃尔兰根PeqLab）中匀浆。根据制造商的建议，提取总RNA并从1μg RNA中转录cDNA。定量PCR在ABI 7700序列检测器上进行（瑞士罗特克鲁斯应用生物系统公司）。探针和底漆组如所示补充表1β3 mRNA用SYBR green技术通过实时PCR定量。对PCR产物进行熔融曲线分析和可视化，以确保RT-PCR的特异性。为了正常化，在平行反应中扩增了看家基因β2微球蛋白（β2MG）或3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。

肝组织学

组织样本用福尔马林固定，并用标准组织学程序包埋在石蜡中。用苏木精-伊红（H&E）和天狼星红（Sirius Red）对3μm石蜡切片进行染色(32,33)纤维间隔的厚度是指在放大×200倍的情况下，在纤维带中间采集的分离肝硬化结节的结缔组织的宽度，并以微米表示（Metamorph软件计算机辅助分析（德国伊斯马宁MDS Analytical Technologies GmbH）；每个标本随机选择10个间隔进行测量。(34)评分是在不了解治疗的情况下进行的。

免疫组织化学

丙酮固定冰冻切片与0.6%过氧化氢（德国达姆施塔特默克）孵育30分钟。用5%BSA封闭后，用单克隆抗CD31（Fitzgerald，Concord MA，USA）、单克隆抗-CD68（Serotec，Düsseldorf，Germany）（1:100）或单克隆抗HIF-1α（Abcam，Cambridge，UK）在4°C孵育过夜，然后用次级山羊抗鼠过氧化物酶标记的IgG（1:200）孵育切片室温下培养45分钟，与显色底物（丹麦格罗斯特拉普达科）培养15分钟。切片用Mayer's Hemalaun进行复染，并安装在水性安装介质中（丹麦Glostrup Dako）。如前所述，通过使用光学显微镜计数CD31阳性血管的数量来评估微血管密度（MVD）。(35)对每个样本的四个区域进行量化。每一个CD31阳性的内皮细胞或内皮细胞簇与相邻微血管明显分离，都被视为一个可计数的血管。通过使用Metamorph软件对每张幻灯片的5个区域进行形态计量分析，进行巨噬细胞定量，并表示为阳性细胞的总面积计数（放大40倍）。

蛋白质提取和Western Blot分析按照说明执行。(6)将20μg组织裂解物涂敷在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，转移到硝化纤维素中，并用5%BSA封闭。在+4°C下以1:100的稀释度涂敷抗CD68单克隆抗体（英国Kidlington Serotec）过夜，然后与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠抗体（1:2000）孵育。使用增强化学发光法对免疫检测蛋白进行可视化（德国弗赖堡Amersham Biosciences）。

血清参数

丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）和胆红素由爱尔兰根和伯尔尼大学医院的临床化学部门使用德国曼海姆（Boehringer）的试剂盒和自动分析仪（BM/Hitachi 717）进行测量。

检测凋亡小体

根据专家病理学家（GN）评估的特征形态学特征，通过常规组织学H&E染色鉴定凋亡细胞。凋亡指数计算为每个肝脏切片每10个高倍视野（hpf）中的凋亡细胞数。

统计分析

使用Microsoft EXCEL软件进行统计分析。数据表示为平均值±SEM。使用未配对学生的t吨-测试。

结果

整合素αvβ3的β3亚单位在大鼠肝脏中高表达

在正常大鼠中，与脾脏、肌肉、心脏、肺和肾脏相比，肝脏中β3整合素mRNA的基础表达最高(图1A). 在胆管结扎1周、3周和6周后，β3转录物的上调分别是时间依赖性的1.2倍、2.2倍和3.1倍(图1B). TAA诱导的纤维化的上调并不显著（未显示），但这可能是由于与BDL模型中持续的肝损伤相比，TAA最后一次给药1周后肝脏收获所致。

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图1

实验性肝纤维化大鼠未治疗和西仑吉肽治疗后β3整合素mRNA水平和肝胶原沉积

(A类)正常大鼠不同器官整合素β3 mRNA的表达；(B类)BDL 1、3和6周后肝脏β3 mRNA表达。通过实时PCR测量转录物，将其归一化为β2MG，并表示为与相应对照组相比的x倍变化（平均值±SD）。大鼠肝脏天狼星红染色：(C类)BDL 6w（n=8）；(D类)BDL 6w+西林奈特30mg/kg/天，5w（n=9）；(电子)TAA纤维化和自发逆转（TAA-R:TAA 12w+8w恢复，n=7）；(F类)TAA-R+Cilingitide 30mg/kg/天，持续8w（n=8）。所示为代表性图像（放大40倍）。

使用和不使用西林奈特治疗的纤维化动物的肝脏组织学

患有BDL 6周的大鼠表现出明显的胆管增生，导管周围胶原积聚，肝小叶结构开始破坏(图1C). 伴有由淋巴细胞和巨噬细胞组成的轻度至中度炎症浸润。这些组织学参数未被西棱尼特改变(图1D). 正常对照肝脏的凋亡小体数量达到0.25/10个高倍视野，未经治疗的BDL动物达到8.5个高倍视野，接受西林奈特治疗的BDI动物达到9.6个高倍镜视野（未显示）。

TAA治疗12周后，再加上8周不治疗或不使用西林奈特治疗，导致了由肌成纤维细胞高度聚集的微小结节性肝硬化。(图1E、F).

西林尼特加重胆道和全小叶肝纤维化

与未经治疗的TAA组相比，用西林奈特治疗8周后，胶原间隔宽度增加了2倍（p<0.05）(图2A-C). 在BDL和TAA诱导的肝纤维化大鼠中，西棱尼特治疗显著增加了相对胶原积累，分别为31%和27%(图2D)而肝总胶原蛋白的增加没有达到显著性(表2). 在接受西林奈特治疗的BDL大鼠中，促纤维化基因（前胶原α1（I）、TGFβ1、TIMP-1、TIMP-2、PDGFR-β、纤溶酶原激活物抑制物-1）和潜在纤溶酶MMP-13的表达显著高于仅接受BDL的大鼠(表1A). 治疗组的αSMA、TGFβ2、PDGF-BB和CTGF转录物仅显示上调趋势。在TAA诱导的纤维化中，服用西林奈特组仅显著诱导前胶原α1（I）和TIMP-1 mRNA的表达(表1B).

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图2

未经西林奈特治疗或治疗的纤维化动物的肝胶原含量、间隔厚度和炎症标记物

在TAA诱导的纤维化大鼠中测量纤维化间隔的厚度(A类)无（TAA-R）和(B类)（TAA-R+Cil）西林奈特治疗（放大100倍）；(C类)用Metamorph软件定量测量中隔厚度（μm）；(D类)相对肝脏羟脯氨酸（mg/g湿肝）；(E、 F类)所有实验组的巨噬细胞活化标记物COX-2、TNF-α和IL-18（平均值±SD）*与未经治疗的纤维化对照组相比，p<0.05。

表1

A.BDL大鼠纤维化相关基因的转录水平
靶向基因	假（n=4）	BDL 6 w（n=8）	西林奈特5w（n=9）
PC-α1（I）	1 ± 0.41	11.8 ± 1.9	19.5 ± 6.8^*
TIMP-1公司	1 ± 0.63	7.12 ± 2.14	13 ± 5.4^*
基质金属蛋白酶-13	1 ± 0.67	1.07 ± 0.41	1.6 ± 0.4^*
α形状记忆合金	1 ± 0.25	3.99 ± 1.72	5.9 ± 3.6
转化生长因子β1	1 ± 0.11	5.31 ± 1.01	9.8 ± 3.9^*
转化生长因子β2	1 ± 0.19	22.6 ± 8.9	45.7 ± 30.5
TIMP-2型	1 ± 0.34	4.49 ± 0.09	6.5 ± 2.2^*
CTGF公司	1 ± 0.03	1.48 ± 0.93	3.33 ± 2.6
PDGF-BB公司	1 ± 0.14	12.2 ± 5.91	32.3 ± 21.6
PDGFR-β	1 ± 0.01	2.88 ± 0.34	5.93 ± 3.08^*
PAI-1型	1 ± 0.28	9.35 ± 2.6	19.1 ± 8.2^*

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B.TAA诱导大鼠纤维化相关基因的转录水平
靶向基因	TAA-R 8周（n=7）	西冷肽8w（n=8）
PC-α1（I）	12.2 ± 4.4	19 ± 7.6^*
TIMP-1公司	2.9 ± 1.54	4.72 ± 1.5^*
基质金属蛋白酶-13	0.31 ± 0.16	0.6 ± 0.37
α形状记忆合金	7.24 ± 0.18	6.94 ± 0.16
转化生长因子β1	6.7 ± 0.26	6.23 ± 0.2
转化生长因子β2	7.6 ± 3.6	11.5 ± 4.2
PDGFR-β	6.93 ± 0.21	6.6 ± 0.21
PDGF-BB公司	9.9 ± 0.21	9.57 ± 0.19
CTGF公司	13.9 ± 0.24	12.7 ± 0.24

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^*p≤0.05 vs纤维化控制

表2

A.BDL大鼠肝损伤和纤维化的器官重量和参数
参数	假（n=4）	BDL 6w（n=8）	西伦吉肽5w（n=9）
肝脏重量，g	14.55 ± 0.63	36.8 ± 3.62	36.25 ± 9.9
脾脏重量，g	0.88 ± 0.05	3 ± 0.41	2.9 ± 0.92
总HYP（mg）	3.59 ± 0.2	24.5 ± 8.7	31.7 ± 11.5
谷丙转氨酶（IU/L）	73.3 ± 14.8	127.5 ± 18	109.8 ± 35.1
碱性磷酸酶（IU/L）	180.7 ± 17.6	484.6 ± 62.4	404.2 ± 88.1
天冬氨酸转氨酶（单位/升）	119.3 ± 38.6	534.6 ± 60.1	403.1 ± 154.3
GGT（单位/升）	< 5	11.42 ± 4.05	53.3 ± 25^*
胆红素（μM/L）	0.1 ± 0.01	7.3 ± 1.4	9.8 ± 3.1

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B.TAA大鼠肝损伤和纤维化的器官重量和参数
参数	对照组（n=4）	TAA-R 8w（n=7）	西冷肽8w（n=8）
肝脏重量，g	13.84 ± 0.22	22.4 ± 4.7	22.5 ± 1.67
脾脏重量，g	0.89 ± 0.08	2.19 ± 0.62	2.29 ± 0.25
总HYP（mg）	3 ± 0.4	14.5 ± 4.8	19 ± 2.3
谷丙转氨酶（IU/L）	34 ± 4.85	61.1± 15.6	74.8 ± 14.9
碱性磷酸酶（IU/L）	206 ± 58.4	400.8 ± 115.08	448.6 ± 63.7
天冬氨酸转氨酶（单位/升）	78 ± 11.52	104.9 ± 48.4	124.3 ± 27.4
GGT（单位/升）	< 5	6 ± 3.13	14 ± 4.1^*
胆红素（μM/L）	0.13 ± 0.06	0.22 ± 0.07	0.18 ± 0.11

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^*p≤0.05 vs纤维化控制。

在两种纤维化模型中，促炎性环氧化酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-18 mRNA的肝脏表达均显著上调。西林奈特治疗后，BDL大鼠的COX-2、TNF-α和IL-18分别增加了1.6倍、2.3倍和1.4倍，而在TAA诱导的肝硬化中，只有IL-18上调了1.8倍（p0.05）图2E、F).

器官重量和血清参数

BDL和TAA诱导的肝硬化大鼠的肝脾重量显著增加。这些未被西林奈特治疗改变(表2A、B). 胆道结扎和TAA给药导致ALT、AST、ALP和胆红素水平显著升高，但只有GGT被西棱尼特进一步升高：BDL是4.7倍，TAA模型是2.3倍。(表2A、B).

西棱尼特对肝纤维化大鼠肝血管生成的影响

CD31染色显示正常肝脏中的窦状内皮细胞和门静脉及中央静脉内皮细胞，而BDL动物在扩张的门静脉束的门脉/紧邻门脉周围区域显示出不规则的血管模式(图3A–C). 西林尼特治疗后，门脉和门脉周围区域的血管形成被抑制了25%（p<0.05）(图3D)但CD31阳性窦内皮细胞总数保持不变(图3E). 与羟脯氨酸（mg/g肝脏）相关的门管区血管数量（反映纤维化区域的血管密度），在西棱尼特治疗的BDL大鼠中甚至显著减少(图3F).

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图3

胆管结扎大鼠服用/不服用西林奈特的CD31免疫组化研究

(A类)假操作（n=4）；(B类)BDL 6w（n=8）；(C类)BDL 6w+西林奈特30mg/kg/天5w（n=9）。门静脉区域血管生成的量化(D类)和正弦区域(电子)所有实验组。使用光学显微镜（放大10倍）在每个肝脏切片的四个区域计算CD31-阳性血管，并表示为每个区域的血管数（平均值±SD）；(F类)每个纤维化区域的血管数计算为门脉血管与相对HYP的比率（平均值±SD）*与单用BDL相比，p<0.05。

TAA诱导的肝硬化大鼠肝纤维化间隔内CD31染色明显，窦状细胞染色不太明显(图4A–D)与BDL中窦状体的强染色相比。西林奈特治疗使总血管形成减少13%，但未达到统计学意义（p<0.1，图4E). 然而，对于BDL，西林奈特显著减少了纤维化门静脉束和间隔中的血管数量，如与羟脯氨酸的比值所示(图4F).

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图4

TAA诱导肝纤维化大鼠肝脏CD31免疫组化研究

(A类)TAA-R（n=7，放大10x）；(B类)TAA-R+西林奈特30mg/kg/天8w（n=8）（10x）；(C类)和(D类)，分别放大（A）和（B）（40倍）。(电子)血管生成的量化。使用光学显微镜（放大10倍）在每个肝脏切片的四个区域计算CD31-阳性血管，并表示为每个区域的血管数（平均值±SD）。(F类)每个纤维化区域的血管数表示为血管与相对肝脏HYP的比率（平均值±SD），*TAA-R组与之相比p<0.05。

西棱尼特不影响肝巨噬细胞浸润

肝巨噬细胞/枯否细胞是纤维化进展或逆转的重要因素(36,37)还表达调节其迁移和活化的功能性整合素αvβ3。(7)与正常大鼠肝脏相比，BDL大鼠的巨噬细胞增加了约3倍，并且主要位于纤维化组织中(图5A-D). Cilengitide治疗对两种纤维化模型中的巨噬细胞数量没有影响(图5E、F). CD68蛋白印迹和密度测定证实了这一点(补充图1A、B).

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图5

BDL和TAA诱导的肝纤维化大鼠肝脏巨噬细胞/枯否细胞CD68免疫组织化学研究

(A类)BDL 6w（n=8）；(B类)BDL 6w+西林奈特30mg/kg/天5w（n=9）；(C类)TAA-R 8w（n=7）；(D类)TAA-R+西林奈特30mg/kg/天8w（n=8）。CD68阳性细胞的形态计量学(电子)BDL和(F类)TAA诱导的纤维化。使用Metamorph软件对每个肝脏切片的染色进行量化，并表示为总面积计数（平均值±SD）。

西林奈特治疗导致轻度肝缺氧

西棱尼特治疗导致BDL模型中低氧诱导的HIF-1α转录物和蛋白以及HIF-1β依赖基因VEGF、iNOS和EPO上调。在TAA模型中，只有VEGF mRNA显著上调（24%），EPO mRNA未检测到(图6,补充图2).

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图6

西棱尼特对纤维化大鼠肝脏低氧诱导基因的上调作用

HIF-1α在肝脏的表达(A、 B类)、EPO(C类)、血管内皮生长因子(D类)和iNOS(E、 F类)BDL和TAA诱导纤维化大鼠的转录物。转录物通过TaqMan PCR进行量化，归一化为GAPDH，并表示为x倍变化（平均值±SD）。PF——纤维化峰值*与相应的纤维化控制相比，p<0.05。

讨论

肝纤维化进展过程中新生血管在肝脏中的作用存在争议。在许多研究中，血管生成增强与更快的纤维化进展相关(19–21,23,38)而在残余肾模型中，新生血管生成与纤维化减轻相关。(24,25)我们选择了经验证的胆道（BDL）和全小叶（TAA）纤维化模型，以评估特定小分子抑制剂对内皮细胞上表达的相关整合素αvβ3和αvβ5（EMD121974或西棱尼特）的抗纤维化作用(14,39)巨噬细胞和活化的HSC上发现αvβ3(6,7,40). 由于激活的HSC和肌成纤维细胞是肝脏中主要的促纤维化效应细胞，当西林奈特阻断时，会导致几个促纤维化基因的下调和HSC迁移的完全抑制，从而导致纤溶表型，因此预计具有双重益处，以某些基质金属蛋白酶的表达和活性增强为特征。(6)值得注意的是，Cilengitide已在体内显示出生物活性，即在结直肠癌、黑色素瘤和其他癌症中具有抗肿瘤活性。(41)此外，我们对健康大鼠不同器官中αvβ3整合素表达的初步筛选揭示了肝脏、肺和脾以及大鼠胆管结扎后的高表达水平，肝β3亚单位的表达显著上调，并与纤维化分期相关。

与体外预期对HSC的抗纤维化作用相反，无论是在胆道纤维化（BDL）进展期间还是在TAA诱导的纤维化/肝硬化期间，体内西棱尼特都会加重肝纤维化。与未经治疗的纤维化动物相比，这伴随着前胶原α1（I）、TGFβ1、αSMA、TIMP-1、PDGFR-β和PAI-1转录物的增加。此外，正如之前在体外HSC中观察到的那样，MMP-13 mRNA上调。(6)如果MMP-13的上调反映了纤维溶解或仅在纤维形成过程中ECM周转增加，则尚未解决。在这两种模型中，肝损伤的血清标志物，如ALT、AST和ALP，除GGT增加外，均不受西冷肽的影响，这可能是由于胆道上皮缺氧损伤所致。同样，脾脏重量可被视为门脉高压的间接和粗略指标(42)两种纤维化模型均不受抗血管生成治疗的影响。

COX-2、TNF-α、IL-18和iNOS的肝脏转录物，这些炎症效应物主要由巨噬细胞/Kupffer细胞产生(43)在西棱肽治疗的BDL大鼠中诱导，而在TAA诱导的纤维化中诱导较少，而巨噬细胞数量未受影响。αvβ3整合素在抑制（巨噬细胞诱导的）炎症中的重要作用(44)抑制高脂血症引起的血管炎症(45)最近放映了。这表明，西棱尼特通过阻断αvβ3整合素轻度增加巨噬细胞活化和炎症介质的释放。综合起来，与有益的抗纤维化药物相比在体外对孤立HSC的影响(6,40)体内整合素αvβ3和αvβ5的抑制促进了肝脏炎症和纤维化。除了αvβ3抑制巨噬细胞/Kupffer的轻度促炎作用外，门脉和间隔（而非窦状内皮细胞和血管）的相对损失可能导致肝纤维化的进展。因此，在扩张的门静脉区域抑制激活的内皮细胞可能会加重肝缺氧导致的纤维化。缺乏血管供应可能会损害向肝实质输送氧气和营养物质，随后会增强氧化应激和促炎反应(46,47)BDL治疗2周后，>95%的肝细胞出现明显的肝小叶缺氧。(48)这一假设得到了西棱尼特诱导低氧诱导基因的支持，如HIF-1α、VEGF、iNOS和EPO，主要是在BDL模型中，与TAA模型相比，拮抗剂也诱导了更严格的成纤维反应。

我们的发现与血管生成抑制促进肾间质纤维化的观察结果一致。(20,48)此外，多项研究表明，肝损伤后肝细胞缺氧和血管生成与纤维化密切相关，缺氧直接导致肝纤维化的进展。因此，体外缺氧诱导活化HSC中的前胶原α1（I）、VEGF及其受体和肝细胞中VEGF的表达。(49)同样，在CCl中₄-肝硬化缺氧诱导肝细胞TGFβ1表达上调。(50)最后，促血管生成干预，即内皮祖细胞治疗可以改善CCl后的纤维化和生存率₄-通过促进肝实质再生诱导小鼠肝损伤。(51,52)

我们的结果与最近的一项研究对比，该研究表明，多激酶抑制剂舒尼替尼（抗血管生成）治疗可改善CCl大鼠的炎症浸润、纤维化和门静脉压力₄-诱导纤维化。(53)不同的结果可以通过使用不同的模型、使用舒尼替尼的更短治疗时间（在我们的研究中，只有1周vs 5周和8周）以及不同的分子靶点来解释。值得注意的是，舒尼替尼主要抑制VEGF和PDGF受体，但也抑制其他受体酪氨酸激酶谱（c-kit、RET、G-CSF、Flt3）。PDGF-AB或-BB激活PDGFR-β，由于其对HSC的促迁移和增殖作用，被认为是促纤维化生长因子(54)以及用伊马替尼抑制HSC上PDGFR-β阻断早期但不是晚期肝纤维化。(55)

总之，通过药物抑制αvβ3（和αvβ5）整合素的抗血管生成治疗促进了实验性胆道（门静脉）和全肝小叶性肝纤维化的纤维化进展，尽管这种抑制对活化后上调该受体的孤立HSC有明显的抗纤维化作用。这表明，通过整合素αvβ3（和αvβ5）介导的肝脏新生血管生成在慢性肝损伤期间或之后发挥有益的抗纤维化活性，超过了它们在体外HSC中的促纤维化作用。我们的数据还表明，对于患有肝纤维化的肿瘤患者，或对于肝纤维化本身的治疗，应谨慎使用强效和特异性抗血管生成物质。

补充材料

补充图1

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补充图s2

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补充表s1

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致谢

财务支持：这项工作的部分支持来自德国研究协会（DFG）的Schu 646/14-1拨款，以及NIH U19 AI066313项目4（授予DS）、DFG研究生院（GRK-750）和瑞士国家基金会（SNF 3100AO-122114）以及Werner和Hedy Berger-Janser基金会（2007年1月）的奖学金（授予EP）。此外，我们还要感谢J.Reichen教授（瑞士伯尔尼大学临床药理学和内脏研究所）的宝贵建议和财政支持。

缩略语清单

Cil公司: 西林奈特
CTGF公司: 结缔组织生长因子
环氧合酶-2: 环氧合酶-2
发动机控制模块: 细胞外基质
iNOS系统: 诱导型一氧化氮合酶
HIF-1α: 低氧诱导因子-1α
HSC公司: 肝星状细胞
超链接: 羟脯氨酸
基质金属蛋白酶: 基质金属蛋白酶
PDGF公司: 血小板衍生生长因子
转化生长因子β: 转化生长因子β
TIMP公司: 基质金属蛋白酶组织抑制剂

工具书类

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