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人类分子遗传学。作者手稿；PMC 2009年11月17日发布。
以最终编辑形式发布为：
人类分子遗传学。2005年9月15日；14(18): 2737–2748.
2005年8月15日在线发布。 数字对象标识：10.1093/hmg/ddi307个
预防性维修识别码：项目经理2778476
美国国立卫生研究院：NIHMS64564
PMID：16103131

缺少老鼠COX10型在骨骼肌中重述与细胞色素相关的进行性线粒体肌病的表型c（c）氧化酶缺乏

弗朗西斯卡·迪亚兹,1 克里斯汀·托马斯,2,三 索菲亚·加西亚,1 达亚米·埃尔南德斯,1和卡洛斯·莫莱斯1中，4,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们用分离的细胞色素建立了一个小鼠模型c（c）氧化酶（COX）缺乏COX10型骨骼肌中的基因。错义突变COX10型以前曾与线粒体疾病相关。Cox10p是一种原血红素：血红素-O（运行）-合成血红素所需的法尼基转移酶一COX催化中心的修复组。COX10型条件敲除小鼠是通过杂交LoxP标记的COX10型在肌球蛋白轻链1f启动子下表达cre重组酶的转基因小鼠。这个舵手10敲除小鼠直到大约3个月大时才开始出现缓慢进行性肌病。令人惊讶的是，尽管COX活动COX10型在2.5个月时，KO肌肉小于对照肌肉的5%，这些肌肉在控制最大力量的80-100%时仍能收缩，疲劳性仅增加10%，未检测到氧化损伤或凋亡的迹象。然而，肌病随着时间的推移而恶化，尤其是雌性动物。这个COX10型KO小鼠使我们能够将肌肉功能与残余COX活性联系起来，这一估计有助于预测人类线粒体肌病的进展模式。

简介

细胞色素c（c）氧化酶（COX）或复合物IV是呼吸链的末端酶。COX催化还原细胞色素的电子转移c（c）到分子氧，这是一个与穿过线粒体内膜的质子移位相耦合的过程(1). COX缺陷与各种线粒体和神经退行性疾病有关(2,三)。

在哺乳动物中，COX是一种200 kDa的酶，作为二聚体具有活性(4). 每个单体由核基因组和线粒体基因组编码的13个亚基组成。复合物的核心由线粒体DNA（mtDNA）编码的三个催化亚单位组成。其余的亚单位由核DNA编码(5,6)。

疾病相关突变已在线粒体DNA编码的COX亚单位和核编码的辅助蛋白中描述，这些辅助蛋白在COX生物发生中起着重要作用（见第7、8节综述）。COX的生物发生是一个复杂且尚未完全理解的过程。已有30多种辅助蛋白被描述用于酵母中的COX组装，其中许多因子在人类中具有同源性(9). 这些辅助蛋白之一是COX10型，一种原血红素：血红素-O（运行）-法尼基转移酶，参与血红素的生物合成一.血红素的法尼基链一充当亲脂性锚，将假体组固定在复杂IV内的适当位置(10)。

Cox10p是一种进化上保守的蛋白质。酵母、小鼠和人类的Cox10p在大小上几乎相同，并且具有高度的序列相似性。这些蛋白质具有亲水性氨基酸末端结构域（约143个氨基酸），在大肠杆菌和Paracocuss脱氮剂分别为(11,12). 人类COX10型该基因包含7个外显子(13)基因产物位于线粒体内膜，包含九个假定的跨膜结构域(12). 中的几个错义突变COX10型在具有不同临床表现的患者中发现了基因：脑白质营养不良和肾小管病(14); 贫血与Leigh综合征；贫血、感音神经性耳聋和致命的婴儿肥厚性心肌病(15)和Leigh-like综合征(16). 为了更好地理解导致COX缺乏的分子机制，我们使用了loxP–Cre系统(17)用老鼠来击倒COX10型只有骨骼肌。老鼠携带鞭子COX10型在肌球蛋白轻链1f的调控下，将基因（外显子6）与携带cre重组酶的转基因小鼠杂交(百万立方英尺)发起人(18). 淘汰COX10型尤其是在骨骼肌中，导致COX缺乏小鼠出现与人类线粒体肌病相似的表型。

结果

创建肌肉专用舵手10KO鼠标

为了建立COX缺乏的动物模型，我们从COX10型使用Cre–loxP系统的基因(17). 选择外显子6是因为其序列与编码细菌酶部分活性位点的区域同源(19). 我们使用了靶向载体pflox(20). 该载体包含三个loxP位点和一个新霉素/胸苷激酶选择盒(图1A). 破坏COX10型使用这种结构的基因。首先，通过同源重组将loxP位点导入ES细胞中的基因。其次，通过瞬时cre重组酶表达去除选择盒以获得floxed基因COX10型Flx公司(图1B). 然后将含有floxed基因的ES细胞注射到囊胚中，以产生嵌合小鼠，并获得该基因的种系传递COX10型Flx公司基因(图1D小鼠2、3和4；野生型，小鼠1和5）。第三，第6外显子被切除体内(COX10型Δ)通过十字路口COX10型Flx公司转基因动物在骨骼肌中特异表达cre重组酶的小鼠百万立方英尺发起人(18). 为了获得肌肉特异性COX10型KO，我们杂交了纯合子COX10型Flx公司带有舵手10/舵手10Flx公司；mlc1f-cre公司老鼠。后者健康，寿命正常。

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创造肌肉特异性COX10型使用Cre–loxP系统敲除小鼠。(A类)A类千磅来自BAC克隆的I片段仅包含来自COX10型克隆到pFlox载体中。将构建物线性化并电穿孔成ES细胞。用表达Cre重组酶的质粒瞬时转染同源重组克隆，以删除选择盒新霉素-硫脒激酶并获得floxCOX10型Flx公司等位基因。(B类)将带有漂浮等位基因的细胞注射到胚泡中以产生嵌合体小鼠。(C类)缺失等位基因(COX10型Δ)将漂浮的等位基因暴露于cre重组酶后获得。(D类)COX10型来自嵌合体的F1小鼠的Southern blot[使用（a）中显示为黑色条的探针]与C57Bl/6小鼠杂交：1–5道代表不同小鼠的DNA。小鼠1和5是野生型等位基因的纯合子COX10型小鼠2-4为杂合子，携带野生型等位基因和COX10型floxed等位基因。(E类)Southern blot显示外显子6的组织特异性缺失：C区，对照杂合小鼠，COX10/COX10Flx公司车道M1和M2，纯合敲除小鼠，舵手10Flx公司/COX10型Flx公司在骨骼肌中表达cre重组酶。缺失等位基因仅存在于骨骼肌组织中，而不存在于同一小鼠的心脏组织中。(F类)用野生型小鼠不同组织的RNA进行Northern杂交舵手10和β-肌动蛋白。

图1E显示了COX10型一只对照小鼠（C）和两只漂浮小鼠的基因，使用肌肉和心脏DNA。控制鼠标是COX10/COX10Flx公司而基因敲除小鼠COX10型Flx公司/COX10型Flx公司cre重组酶的表达导致缺失等位基因的存在COX10型Δ仅在骨骼肌，但不在心肌。图1F说明了这一点COX10型mRNA水平在小鼠心脏、肝脏、肾脏和睾丸中最高。大脑和骨骼肌中COX10型mRNA，而COX10型mRNA在脾和肺中表达。

肌肉特异性COX10型KO小鼠表现出严重的COX缺乏

floxed基因的存在对小鼠表型没有任何明显影响。这个COX10型Flx公司/COX10型Flx公司老鼠健康，有生育能力，寿命正常。这些动物和野生型小鼠被用作对照。相比之下COX10型肌肉敲除小鼠在3到4个月大时开始逐渐减肥并变得不太活跃，这时它们看起来很健康。小鼠在4-7个月大时死亡。

为了确定COX10型从不同年龄对照和KO动物的后肢肌肉中分离出氧化磷酸化酶缺失、线粒体。酶活性用分光光度法测定。图2显示了KO小鼠不同呼吸复合物的酶活性，并将其归一化为来自同年龄对照动物的数据（主要是同一天分析的室友）。KO/对照组也进行了性别配对（每组10只雄性和4只雌性）。NADH细胞色素c（c）氧化还原酶（复合物I+III）、琥珀酸癸基泛醌DCPIP还原酶（复合物II）和琥珀酸细胞色素c（c）与对照小鼠（1-4个月，图2A–2C和2E). 删除COX10型导致细胞色素氧化酶活性在1个月龄时严重下降。幼年KO小鼠的细胞色素氧化酶活性平均（±SD）为对照水平的12.9±5.7%(图2D). 我们没有观察到男性和女性COX活性之间的任何差异，这些差异显著降低。令人惊讶的是，这些肌肉仍然有功能，在约3个月大之前，未观察到明显的肌病表型。随着KO小鼠年龄的增长（6-7个月大），这些已经很低水平的复合物IV活性逐渐下降至对照组的2.2±0.9%。与对照组（6-7个月）相比，老年KO小鼠的CII和CII+III活性略有但显著降低。

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呼吸复合物的控制和活动COX10型KO小鼠。分光光度法测定了不同年龄对照组和KO小鼠后肢肌肉中的线粒体酶活性（如9所述）。(A类)NADH-细胞色素c（c）氧化还原酶活性或复合物I+III活性。(B类)琥珀酸癸基辅醌DCPIP还原酶或复合物II活性。(C类)琥珀酸细胞色素c（c）还原酶或复合物II+III活性。(D类)COX或复合IV活性。(E类)柠檬酸合成酶活性。每个KO小鼠组织的酶活性表示为同一天从对照动物获得的平均值的百分比。每个符号对应一个KO鼠标。实验中使用了10只雄性和4只雌性KO小鼠（以及相应的年龄和性别匹配的对照）。

通过蓝色天然（BN）凝胶电泳对1月龄、5月龄和6月龄动物分离的肌肉线粒体进一步表征复合IV缺陷。图3A结果表明，配合物I、V、III和II在所有小鼠中均已完全组装并呈现类似水平。即使在幼龄（1个月）的KO小鼠中也几乎看不到对应于复合物IV的条带。凝胶中在BN凝胶中对复合物I、IV和V进行活性测定。复合物IV活性仅在1个月大的肌肉线粒体中检测到(图3C). 在对照组小鼠中观察到低水平的复合物IV活性，这种酶活性随着年龄的增长而增加。一个月龄的对照动物的COX比6个月龄小鼠少约20–30%（数据未显示）。凝胶中配合物I的活性测定(图3B)和V（未显示）显示对照和KO小鼠具有相当水平的这些复合物。然而，F1段的水平与F无关1/F类0同样通过该试验检测到的复合物在KO小鼠中增加。

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对照组和对照组呼吸复合物的稳态水平舵手10KO小鼠。用BN-PAGE分离对照和KO小鼠肌肉线粒体（40μg）中的呼吸复合物。(A类)考马斯染色BN凝胶。Lane M，天然电泳用高分子量标记；C、 控制；K、 1个月、5个月和6个月龄的KO小鼠。(B类)综合体I凝胶中（A）中使用的BN凝胶样品的活性测定。(C类)综合体IV凝胶中（A）中所用样品的活性测定。(D类)使用针对NDUFSA9（复合物I亚单位）、ATP酶β（复合物V亚单位），UQCRC2（复合物III亚单位）和Cox1p（复合物IV亚单位）以及SDH-Fp（复合体II亚单位）的抗体，从1、3和6个月龄小鼠的肌线粒体BN凝胶（40μg）的免疫印迹。用这些抗体连续孵育相同的印迹，而不剥离膜。(E类)采用BN-PAGE和2D-SDS-PAGE免疫印迹分析6个月龄对照和KO小鼠的线粒体（40μg）。用不同的抗体连续培养相同的印迹。对照组和KO印迹同时处理和暴露。图像被着色并叠加以便于比较。复合物I以红色表示，复合物II以洋红色表示，复物III以黄色表示，复合体IV以蓝色表示（用于对抗CoxIp和CoxIVp的两种抗体），复合物V以绿色表示。(F类)用SDS-PAGE分离1个月、5个月和6个月龄对照组和KO小鼠的线粒体蛋白质（25μg）。用几种针对复合物IV（细胞色素）亚单位的抗体对膜进行印迹c（c）、复合物I、III、V、II和泛素。

使用针对呼吸复合物亚单位的不同单克隆抗体，通过BN凝胶的western blot测定完全组装的呼吸复合物的稳态水平(图3D). 从1个月、3个月和6个月大的KO小鼠的组织中提取的BN凝胶western blot显示，使用Cox1p亚单位抗体，没有与完全组装的COX对应的可检测条带(图3D)或Cox4p亚单位（未显示）。对照组和KO组小鼠表现出其他完全组装的呼吸复合物的可比稳态水平(图3D)。

氧化磷酸化复合物也通过2D-BN蛋白质印迹进行分析。用不同抗体连续孵育斑点，同时暴露对照和KO样品并并行分析。为每个图像指定伪色（蓝色代表复合物IV，红色代表复合物I，黄色代表复合物III，绿色代表复合物V，洋红代表复合物II）。对每个抗体获得的图像进行叠加以合成图3E复合IV亚单位（Cox1p和Cox4p）的蛋白质印迹表明，在6个月大的KO小鼠中几乎检测不到完全组装的COX(图3E). 在这些条件下，即使在1D或2D-BN蛋白印迹（未显示）中过度曝光胶片，我们也未检测到复合物IV的子组中间产物。在6个月大的婴儿的2D BN蛋白质印迹中，复合物II和V的水平略有增加舵手10KO小鼠，而复合物I和III在KO和对照动物中看起来相似。

使用抗Cox1p、Cox5bp和Cox4p亚单位的抗体评估复合物IV的几个亚单位的稳态水平。用SDS-PAGE分离1月龄、5月龄和6月龄小鼠的线粒体样品。图3F显示没有检测到Cox1p亚单位的水平，在舵手10不同年龄的KO小鼠。过度暴露这些蛋白印迹表明Cox1p和Cox4p水平很低（数据未显示）。KO小鼠的Cox5bp亚单位也显著降低(图3F). 细胞色素的稳态水平c（c）NDUFSA9（复合物I亚单位）、UQCRC2（复合物III的核心2亚单位），ATP酶β（复合物IV亚单位）和SDH（复合物II 70 kDa亚单位）与COX10型KO和对照小鼠(图3F)。

肌组织中细胞色素氧化酶缺乏纤维、粗糙的红色纤维和异常线粒体大小COX10型KO小鼠

对对照组和KO小鼠（1月龄、3月龄和6月龄）后肢（小腿三头肌）骨骼肌的连续切片进行组织化学评价。图4显示了肌肉纤维的典型镶嵌图案，其中更多的氧化纤维对细胞色素氧化酶或SDH染色更强。在对照组小鼠中，年长动物的COX和SDH染色更强。我们在酶活性的分光光度测定中也看到了这种趋势（数据未显示）。相反，在KO小鼠中，COX活性随着年龄的增长而逐渐减弱。6个月时，KO动物的大多数肌肉纤维呈COX阴性。COX/SDH双染色显示在COX缺乏的纤维中SDH染色增强COX10型KO小鼠，一种活性染色，在正常小鼠中被COX染色掩盖。KO动物中SDH反应增加表明线粒体增殖。用Gomori三色染色法，我们无法观察幼年KO动物的线粒体增殖，但随着年龄的增长，线粒体增殖和散在的粗糙红纤维（RRF）变得更加明显。使用抗Cox1p的单克隆抗体通过免疫组织化学监测COX缺乏。Cox1p的免疫组织化学模式与COX活性染色相关。在年轻对照小鼠中，Cox1p信号较弱，但随着年龄的增长而增加。相比之下，舵手10KO小鼠随着年龄增长，Cox1p染色逐渐减少。

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肌肉组织病理学COX10型不同年龄的KO小鼠。将来自1个月、3个月和6个月大的小鼠的小腿三头肌在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻。对厚度为8μm的连续横截面进行COX活性、COX和琥珀酸脱氢酶的联合活性以及SDH活性的染色。用Gomori三色染色，用Alexa-conjugated Cox1p单克隆抗体进行免疫染色，以显示进行性COX缺乏和肌肉线粒体增殖COX10型击倒老鼠。

肌肉中的纤维舵手10KO小鼠比对照肌肉中的纤维大小更不均匀。KO小鼠的肌肉中也存在分散的萎缩纤维，但没有纤维化、炎症（通过苏木精和伊红染色评估）或凋亡（通过隧道试验确定；数据未显示）的迹象。我们也没有检测到神经原性改变的迹象，例如纤维类型分组或角萎缩纤维（由肌球蛋白ATP酶染色确定；数据未显示）。使用western blots，我们检测到5-6月龄KO小鼠体内游离泛素水平略有下降(图3F)，但对照组和KO组小鼠的泛素结合蛋白水平无显著差异（未显示）。对自由基清除剂酶（SOD1和SOD2）水平以及线粒体和肌肉匀浆中蛋白质的氧化损伤（氧印迹）的测试表明，不同年龄的对照组和KO组小鼠之间没有任何显著差异（数据未显示）。

骨骼肌的电子显微镜分析显示线粒体增生区域，线粒体明显增大和肿胀COX10型KO肌肉(图5). 这些线粒体直径大于1μm，含有异常嵴。我们没有发现结晶旁内含物的证据，也没有观察到肌肉超微结构的异常，线粒体除外。

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电子显微镜COX10型KO骨骼肌。将3月龄对照组和KO小鼠的骨骼肌（小腿三头肌）固定在2.5%的戊二醛和2%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液中，然后进行透射电镜分析。显微照片显示，与对照组（左侧面板）相比，KO小鼠（右侧面板）组织中的异常线粒体增大。比例尺：2μm。

肌肉特异性COX10型KO女性比KO男性更不耐锻炼，寿命更短

KO小鼠在3-4个月大时开始表现出明显的表型变化，它们看起来很健康(图6A). 在这个年龄段，他们开始减肥，肌肉质量严重减轻，出现脊柱后凸，自发活动减少。将这些动物的生长曲线归一化为1个月大时的体重，结果表明，雄性KO小鼠和对照同窝小鼠在大约3个月大之前体重相同。雄性KO小鼠的体重随后开始逐渐下降(图6B，对于对照和KO小鼠：开放和封闭的正方形）。一些动物表现出体重恢复的阶段，但最终它们的体重继续下降。相比之下，雌性KO小鼠在幼年时的体重低于其对照窝鼠，即使在3个月大时也几乎不到20克(图6B、闭合圆和开放圆）。

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的表型COX10型KO小鼠。(A类)5个月大的对照组和KO窝友的体型比较。在幼年时，对照组和KO组小鼠无法区分，但在3-4个月后，KO组鼠开始肌肉减重，出现后凸，自发活动减少。这些症状逐渐恶化。(B类)对照组和对照组的生长曲线舵手10KO小鼠[开方格，对照雄性小鼠(n个= 9); 闭合方块，KO雄性小鼠(n个= 7); 开圈，控制雌性小鼠(n个= 6); 闭合圈，KO雌性小鼠(n个= 6)]. (C类)跑步机性能测试：2个月大的雄性、雌性对照组和KO小鼠在跑步机上以7 m/min的速度运动。记录它们跌落到电网上的次数。条形图表示两次测试的平均值和标准偏差(n个=每组5只小鼠）。KO小鼠在执行任务时有困难。女性比男性更容易陷入困境。年长的KO动物无法执行此任务。他们无法奔跑。(D类)女性生存曲线(n个=9）和男性(n个=11）KO小鼠。50%的女性人口在~4个月龄时死亡，而50%的男性人口在~7个月龄死亡。三角形代表对照小鼠的数据。

老鼠也在装有激励电网的跑步机上进行跑步测试，以释放微弱的电击。记录对照组和KO组小鼠在跑步机上跑步时跌入网格的次数。图6C显示2个月大的KO小鼠，无论是雌性还是雄性，落入网格的频率都高于对照组小鼠。雌性KO小鼠在跑步机上的表现也明显低于雄性KO小鼠(P（P）= 0.01). 在这次运动测试后，许多KO小鼠大汗淋漓，看起来非常疲劳，需要相对较长的时间才能从运动中恢复。随着KO动物年龄的增长（3-4个月）以及疾病的发展，它们甚至无法在跑步机上以最慢的速度跑几秒钟。

这个COX10型与同窝对照组相比，基因敲除小鼠的寿命更短(图6D). 女性更容易受到COX10型缺乏，比男性更早死亡。50%的KO雌性在约4个月大时死亡，而50%的KO雄性在7个月后死亡。然而，也有例外。15只KO雌性中有3只寿命超过15个月。

COX10型KO肌肉随着年龄的增长明显变弱，并且稍微更疲倦

图7A显示了在三只不同年龄的对照小鼠和三只KO小鼠的腓肠肌内侧肌中诱发的最大力的例子。在70天大的对照组和KO小鼠中，最大力相似。此后，对照组小鼠的最大力随着年龄的增长而显著增加，而KO组小鼠则显著降低(图7B). 对3个月大的KO小鼠和对照小鼠的肌纤维面积进行无偏测量，结果表明，KO小鼠肌纤维的横截面积平均比对照小鼠小19%（KO平均值±标准偏差：1705±831μm2; 控制：2098±721μm2；P（P）< 0.0001). 由于平均纤维尺寸提供了收缩器质量的准确估计，这些结果表明肌肉尺寸的减小可能有助于，但不能完全解释力的减少（80天以上的动物约减少50%；图7B)。

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腓肠肌内侧肌的生理特性。(A类)三只不同年龄的对照组和KO雄性小鼠的内侧腓肠肌对坐骨神经100 Hz超最大刺激0.5秒的最大反应力(B类)最大肌力与对照组和KO组动物年龄之间的关系（对照组：开放方块，年= 0.025x个– 0.9911,第页2= 0.9811,P（P）= 0.002; KO：闭合正方形，年= −0.0064x个+ 1.0887,第页2= 0.534,P（P）= 0.039). (C类)对照组和KO组动物（均为73天龄）的腓肠肌内侧肌对每秒13次40 Hz脉冲的反应所产生的力，持续2分钟。在0、30、60、90和120秒（从上到下）记录显示的痕迹。(D类)对照组和KO组小鼠的平均相对力下降（±SD）(n个=5只动物/组），在40 Hz下刺激2分钟期间，每5秒。

40 Hz间歇刺激2 min，使对照组和KO组小鼠的腓肠肌内侧肌疲劳。图7C显示了在整个测试过程中，小鼠每30秒出现一次肌力（疲劳）下降。重复刺激后，每一块肌肉的力量逐渐下降，尤其是在第一分钟，但KO小鼠肌肉的相对力量下降更大。40 Hz的刺激最初分别引起对照组和KO组小鼠记录的最大力（100 Hz）的平均值（±SD）为75±4%和73±6%(P（P）=0.62）。然而，经过反复刺激，KO小鼠的肌肉比对照组的肌肉更容易疲劳(图7D). 对照组和KO组小鼠的平均相对力下降幅度较小（平均约10%），但差异显著，从40秒下降到120秒。KO组的疲劳方案同样降低了抽搐力和强直力（初始分别为22±10%和19±7%），但对照组的肌肉，强直力的减少明显大于抽搐力的减少（初始分别为29±4%和41±11%，P（P）= 0.025).

讨论

本研究描述了一种具有肌肉特异性的小鼠模型的开发COX10型导致严重COX缺乏和肌病的敲除。小鼠表现出的表型与人类COX缺乏相关线粒体肌病的表型极为相似。如下文所述，与之前描述的几种线粒体肌病模型相比，这些小鼠有一些独特的方面。线粒体转录因子A（Tfam）的肌肉条件敲除(21)也概括了线粒体疾病的特征，但在本例中，由于线粒体DNA缺失，所有OXPHOS复合物都发生了改变(22). 腺嘌呤核苷酸转运蛋白1（ANT-1）敲除小鼠(23)出现肌肉疾病和运动不耐受，但这些小鼠也出现肥厚性心肌病，因为ANT-1在心脏和骨骼肌中都表达。这同样适用于小鼠COX亚单位VIa-H的敲除，该亚单位发展为心脏病理学(24). 此处描述的小鼠患有与单个OXPHOS复合物缺陷相关的孤立性肌病。

细菌同源物cyoE（血红素）的研究-O（运行）-合成酶）表明，小鼠外显子6构成酶催化位点的一部分，是功能所必需的(19). 我们无法直接测试外显子6缺失对Cox10p水平的影响。我们通过不同方法（肽免疫、融合蛋白表达和基因免疫）开发Cox10p特异性抗体的努力未能产生能够检测免疫印迹中特定条带的抗血清，可能是因为该蛋白的表达水平很低。然而，因为血红素一是Cox1p成熟和稳定所必需的，我们可以使用Cox1p作为Cox10p功能的标记。正如在酵母中观察到的那样COX10型导致小鼠COX缺乏。这个mlc1f Cre公司转基因小鼠在发育过程中表达重组酶，该酶在胚胎第10天激活。据估计，骨骼肌组织中45%的细胞核位于肌肉细胞内，还有许多其他组织类型（例如脂肪细胞、成纤维细胞、雪旺细胞等）(18). 我们获得了类似水平的COX10型Flx公司和COX10型ΔSouthern杂交中的等位基因。如前所述，这一结果可以用肌肉匀浆中存在的额外细胞类型以及肌肉中的不完全缺失来解释。

尽管幼鼠在1个月大时的COX活性水平很低（与对照鼠相比，87%的幼鼠缺乏COX活性），但它们看起来还是正常的。随着动物年龄的增长，这些水平进一步下降（6-7个月大时达到98%的缺乏；图2D). 令人惊讶的是，尽管COX活性低于正常值的5%，但直到3个月才观察到明显的表型。这一观察结果反映了骨骼肌利用ATP生成的替代机制（很可能是糖原分解/糖酵解）发挥功能的显著能力。在我们的COX10型KO小鼠与人类儿科患者报告的低水平复合物IV活性相似COX10型错义突变。在肌肉活检中，这些患者的复合IV活性为对照组的5%至16%(15,16). 在我们的模型中，导致肌肉功能残留的一个重要因素是floxed的镶嵌和非同步缺失舵手10等位基因。缺陷的镶嵌图案，如图4，类似于与异质线粒体DNA突变相关的缺陷(25). 在老年人中，这种缺陷更为普遍，类似于更多的核编码基因缺陷(7,8)。

在患有以下疾病的患者的成纤维细胞中，复合物IV亚基的稳态水平降低COX10型缺陷(14,26). 对人类成纤维细胞进行的研究N个-导致血红素缺乏的甲基原卟啉（铁螯合酶抑制剂）也显示COX亚基的稳态水平下降(27). 同样，COX亚单位的稳态水平COX10型与对照组相比，KO小鼠受到影响。Cox1p几乎检测不到，Cox4p和Cox5bp显著降低。

海姆一插入发生在第一个Cox1p子组件形成之后，但在Cox1p、Cox4p和Cox5bp子组件形成之前(26). 中COX组件的分析COX10型BN凝胶KO小鼠未发现子组分中间体的存在。即使使用2D-BN电泳（一种比1D分析更敏感的检测亚复合物的方法）解析样品，我们也无法检测到任何中间产物。这些结果与研究人员检查的患者组织一致COX10型突变(15,16,26)。

肌肉组织化学检查COX10型敲除小鼠表明，许多SDH染色增强的纤维COX染色不足，但情况并非总是如此。这些结果与小鼠肌病模型中线粒体转录因子a在肌肉中特异性缺失的结果类似(22). 线粒体质量增加也见于COX10型小鼠，可能是酶缺乏的一种补偿机制，可以提高受影响组织的能量生成。

少数达到老年（8个月或更长）的动物出现严重的肌肉萎缩。肌肉萎缩的分子机制尚不完全清楚，但涉及蛋白质合成减少、蛋白质水解增加（钙蛋白酶、组织蛋白酶和泛素）和氧化应激(28,29). 我们检查了COX10型通过immnunoblot对肌肉的泛素水平进行KO，并观察到5至6个月大的动物的游离泛素水平降低。游离泛素水平降低可能意味着蛋白结合泛素水平增加，但我们无法检测到泛素结合物水平的显著差异。未获得凋亡或氧化应激的证据。因此，在COX10型KO小鼠可能是生物合成和代谢途径能量短缺的唯一后果。这一建议与KO动物表现出的随着年龄和运动不耐受性而减少的自发活动相一致。

在反复刺激的情况下，KO和对照动物的腓肠肌（主要是一种II型纤维肌肉）的力量下降可能与持续的代谢变化有关，这些代谢变化会损害钙动力学（释放、摄取和/或缓冲）和由于ATP不可用而导致的跨桥产生力量的能力(30). 在对照组中，破伤风力比抽搐力减少得更多，而这两种力在COX10型KO，提示钙释放问题(31). 此处使用的方案可能还显示了舵手10KO小鼠与Tfam KO小鼠比较(22). 我们的KO和对照动物的初始收缩相对强度相似。然而，相对于最大肌力而言，Tfam KO动物的肌肉在较低的初始强度下被激活(22)这一因素可能会掩盖因淘汰赛导致的疲劳程度的微小差异。此外，这些研究中使用的不同肌肉群和不同技术可以解释这些微小差异。无论如何COX10型与力的显著下降相比，KO较小，这一趋势与Tfam肌肉KO的结果相一致(22)。

与年轻人一起进行的运动测试COX10型KO动物（2个月大）表现出性别差异：雄性表现更好。通常在男性中观察到较大的肌肉质量(32)由睾丸激素触发，可能是这种差异的原因(33). 在寿命或存活率方面，我们还观察到性别偏见。平均而言，约50%的雌性在~4个月龄时死亡，而50%的雄性在~7个月龄死亡。Leber遗传性视神经病变（LHON）是最常见的线粒体遗传性疾病之一，具有不完全外显率，男性发病率高于女性，这意味着可能还有其他遗传或环境因素调节疾病的表型表达(34)。

总之，我们创建了一种骨骼肌特异性COX10型KO小鼠，其表型再现了与COX缺乏相关的进行性线粒体肌病。我们的研究表明，在观察到明显的肌病之前，肌肉中的COX活性可以降低90%以上，并且在临床表现上也显示出性别偏见。这种新型小鼠模型将有助于开发治疗线粒体肌病的新治疗方法。

材料和方法

的生成COX10型条件敲除小鼠

我们扩增了COX10型通过RT–PCR从小鼠骨骼肌RNA中提取基因。将该产品克隆到pCDNAII载体并测序以确认COX10型身份。纯化后的片段被送往Incyte Genomics（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托），用于分离含有COX10型基因。我们收到了三个阳性克隆，它们被用不同的限制性内切酶定位。12 kb的不同区域千磅将包含外显子6但不包含外显子5或外显子7的I消化片段克隆到pFlox载体中(20)以获取目标构造。目标结构的克隆策略如所示图1A在5′重组臂处，0.6 kb千磅I–Nco公司I片段被克隆到Bstx公司I–Xho公司我克隆了载体的位置。碎片Nco公司I–Hin公司将含有外显子6的dIII（1.3 kb）导入巴姆你好。最后，在3′重组臂处巴姆HI–高千磅I片段（8.9 kb）被克隆到萨尔向量的位置。将基因组序列克隆到载体所需的限制性位点通过PCR添加到含有必要限制性位点的特定引物中。对获得的片段进行测序或限制性消化分析，以确认其身份。最终构造线性化为不是I和电穿孔成129svj小鼠胚胎干细胞（Incyte Genomics）。细胞在300μg/ml G418选择下生长。在第6天和第7天采摘未分化克隆。通过PCR筛选克隆进行同源重组。从360个克隆中，我们只获得了三个同源重组克隆。从这三个克隆中，只有一个克隆具有所有三个loxP位点。用低浓度pCre–Hygro质粒扩增并电穿孔该克隆(35)删除选择磁带(图1B). 电穿孔后，细胞在0.2μM[2′-氟-2′-脱氧-5-碘-1-β中生长-D类-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶（FIAU），TK阴性选择]和PCR筛选。我们获得了14个克隆，其中保留了外显子6，但删除了选择盒。其中一些克隆被注射到迈阿密大学转基因核心设施的C57Bl/6囊胚中。获得三只嵌合小鼠。这些动物与C57Bl/6小鼠杂交，获得漂浮等位基因的种系传递。图1D显示了这些动物的基因型，这些动物的floxed等位基因是杂合的或纯合的。控制和COX10型敲除小鼠具有混合遗传背景（129svj和C57Bl/6）。

畜牧业

小鼠在室温下保持12小时光/暗循环。给予食物和水随意。

PCR和南方和北方斑点

通过苯酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀从组织中获得总DNA。通过PCR和Southern印迹检测外显子6的缺失。在第6外显子侧翼的内含子序列中对删除的等位基因进行PCR扩增。为了通过Southern blot检测缺失的等位基因和漂浮的等位蛋白，用巴姆HI，在0.7%琼脂糖凝胶上分离并转移到Z-Probe膜（BIO-RAD，Hercules，CA，USA）。该膜与COX10型基因组探针(图1A). 使用商用膜（BD Biosciences，MTN™小鼠印迹，Clontech，Palo Alto，CA，USA）进行Northern印迹，该膜与1探针杂交，剥离，然后与β-肌动蛋白探针杂交。探针上贴有[32P] dCTP使用随机引物标记试剂盒（美国印第安纳波利斯罗氏诊断公司）。

线粒体的分离及呼吸复合物酶活性的测定

通过对不同年龄动物后肢肌肉组织的匀浆和差速离心获得线粒体。肌肉匀浆在10 m内制备M（M）Hepes，0.5米M（M）乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米M（M）EGTA和250 mM（M）蔗糖（pH 7.4），含有一种完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏诊断公司），使用电机驱动的teflonpestle均质器。样品在2000g下离心3分钟。保存上清液。将含有未破碎细胞的颗粒均匀化并再次离心。将两种上清液混合并在12000g下离心10分钟。将富含线粒体的颗粒清洗一次，然后再悬浮在上述缓冲液中。线粒体部分在液氮中冷冻，并在−80°C下储存，直到需要时为止。NADH细胞色素的活性c（c）氧化还原酶或复合物I+III、琥珀酸脱氢酶（SDH）或复合物II活性、琥珀酸酯细胞色素c（c）如前所述，用分光光度法测定线粒体制剂中的还原酶或复合物II+III活性、COX或复合物IV活性和柠檬酸合成酶活性(36). 蛋白质浓度由Bradford法测定(37)使用BSA作为标准。

蓝色天然凝胶电泳和蛋白质印迹

从肌肉中分离的线粒体（200μg）在1.5M（M）氨基丙酸，50米M（M）Bis-Tris（pH 7.0），用20μl 10%十二烷基麦芽糖苷在冰上萃取45分钟，然后离心30分钟。向溶解的蛋白质部分中添加10μl 5%Serva蓝。如前所述，样品（25–40μg）用BN-PAGE在4–13%丙烯酰胺梯度中分离(38). 对于2D电泳（SDS-PAGE），用剃须刀片切割天然凝胶的通道，首先用1%SDS和1%β-巯基乙醇孵育30分钟，然后用1%SDS孵育另30分钟。使用10%丙烯酰胺分离凝胶和4%丙烯酰胺堆积凝胶围绕原始凝胶条浇铸第二维度凝胶。在BN-或SDS-PAGE之后，将蛋白质转移到PVDF膜上，并用一系列针对呼吸复合物亚基的单克隆抗体进行免疫印迹（Molecular Probes，Eugene，or，USA）。对于凝胶中活性测定中，蓝色阴极缓冲液在30V下运行3h后，替换为无色缓冲液。然后运行凝胶，直到前面的染料离开凝胶。为了评估复合物I的活性，将凝胶与0.14 m孵育M（M）100 m内的NADH和1 mg/ml硝基蓝四氮唑M（M）Tris–HCl（pH 7.4），温度为37°C，直到颜色显现(39). 综合体IV凝胶中按照说明执行活动(40)。

在4–20%丙烯酰胺梯度凝胶中用SDS-PAGE分离线粒体蛋白（25μg）并转移到PVDF膜后，进行蛋白质印迹。在PBS中用0.1%吐温20中的5%非脂肪乳封闭膜，然后用特定抗体孵育。使用辣根过氧化物酶标记的二级抗体，并使用Superwest™信号试剂（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯）通过化学发光法进行酶反应。从Molecular Probes获得了针对氧化磷酸化复合物不同亚单位的抗体，并从Chemicon International（Temecula，CA，USA）获得了针对泛素的抗体。

组织学、免疫组织化学和电子显微镜分析

在组织学研究中，肌肉组织在液氮中冷却的异戊烷中冷冻。对冷冻肌肉的横截面（8μm厚）进行SDH和细胞色素氧化酶活性染色。肌肉切片也用苏木精-伊红和Gomori三色染色，以评估肌肉纤维面积和一般形态(25). 对于免疫组织化学，肌肉切片在PBS中用0.5%triton x-100处理30分钟，并在PBS洗涤30分钟，然后添加抗COX1p-Alexa荧光488-结合单克隆抗体（分子探针），稀释至2μg/ml，加入PBS中2%BSA。

为了进行电子显微镜分析，肌肉组织在2.5%戊二醛和2%多聚甲醛中固定过夜M（M）磷酸钠（pH 7.4）。用磷酸盐缓冲液冲洗组织，用1%四氧化锇孵育，然后如前所述进行透射电子显微镜处理(41). 图像是使用迈阿密大学EM核心设施的JEOL CX 100系统拍摄的。

跑步机测试

老鼠(n个四组各=5）在设定为7 m/min的跑步机（美国俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司）上运行2 min。跑步机的后部装有一个释放温和电流的栅极，这是一种激励动物继续在跑步机上运行的刺激物。表现是通过老鼠未能停留在跑步带上并掉入刺激网格的次数来衡量的。跑步时间限制为2分钟，因为大多数KO老鼠不能再跑了。

肌肉力量和疲劳的测量

对不同年龄的对照组和KO组动物用1–2%氟烷和氧化亚氮麻醉，直至其屈曲。除腓肠肌内侧支外，坐骨神经暴露于一条腿，失神经支配。从周围肌肉上解剖腓肠肌内侧肌和肌腱。

在生理记录过程中，每只老鼠都趴在一条加热毯上，以保持体温接近37°C。通过辐射热将肌肉温度维持在35–37°C。将坐骨神经置于两个银电极上进行刺激。将腓肠肌内侧肌腱连接到换能器（Grass FT03，Grass Astro Med，Inc.，West Warwick，RI，USA）上，以测量最佳肌肉长度下的等长力。使用SC/Zoom系统以400 Hz的频率在线对力进行采样。使用Zoom软件离线分析数据（瑞典乌梅大学生理科）。

以1 Hz的频率向坐骨神经发送强度增加的刺激脉冲（50μs持续时间；S88刺激器，Grass Astro-Med，Inc.）（1或0.1 V步长），以确定肌肉激活阈值。所有后续刺激均为超最大值（>3倍阈值）。以1 Hz的频率发送脉冲以引起肌肉抽搐，然后以100 Hz的频率持续0.5 s以引起最大肌力。疲劳试验后立即重复这些刺激。最大肌肉力量被标准化为肌肉重量，作为对肌肉纤维内在力量产生能力的估计。每一块肌肉因每秒以40 Hz的频率发出13次脉冲持续2分钟而疲劳(42). 将第一列40 Hz脉冲诱发的绝对力归一化为最大肌力，以评估初始收缩强度。以40 Hz（最终力/初始力）刺激2分钟后的相对力下降被用作肌肉疲劳的测量。

采用最小二乘线性回归分析不同年龄对照组和KO组动物的最大肌力。t吨-测试用于评估KO和对照动物的标准化最大力的差异以及疲劳前后抽搐力的变化。以时间和动物基因型为因素，通过重复测量方差分析进行疲劳分析。重要性设置为P（P）< 0.05.

致谢

我们感谢Jamey D.Marth博士（圣地亚哥大学）提供了靶向载体pFlox和pCre–hygro质粒。我们还感谢Steve Burden博士（弗吉尼亚大学）提供mlc1f Cre公司转基因小鼠。我们还感谢瓦妮娅·阿尔梅达在肌肉纤维计数技术方面的帮助。这项工作得到了肌肉营养不良协会对F.D.的研究开发拨款以及美国国立卫生研究院的拨款（NS-41777和EY-10804对CTM）的支持。

脚注

利益冲突声明。未申报。

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