细胞外透明质细胞组织的年龄相关变化导致皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化受损

细胞培养

所有实验都是用接受常规小手术的成年人通过活检获得的真皮成纤维细胞进行的。活检获得了东南威尔士研究伦理委员会的伦理批准。如前所述，对细胞进行分离和表征23,24,29并在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，补充我-谷氨酰胺（2 mmol/L）、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及10%胎牛血清（FBS）（英国坎伯纳生物工业有限公司）。培养物保持在37°C的湿度培养箱中，在5%CO的环境中₂，并且每3至4天向细胞中加入新鲜的生长培养基。在90%的汇合处，对成纤维细胞进行胰蛋白酶消化，并以1:3的比例重新接种。每次传代时，用血细胞仪直接计数，测定活细胞总数。使用之前描述和验证的在体外老化，25已在成纤维细胞模型中证明其适用于体内老化。27种群倍增水平（PDL）计算如下：PDL=[log₁₀（传代对数时采集的细胞总数₁₀（重新播种的细胞总数）]/log₁₀(2).30通过将导出的增加值与之前的PDL相加来计算累积的群体倍增水平，培养成纤维细胞直到衰老，每个患者的衰老程度不同，发生在PDL 46至70。在实验中，使用了10到15个PDL和25到35个PDL，分别称为年轻和老年皮肤成纤维细胞。在用于实验之前，将细胞在无血清培养基中培养48小时，除非另有说明，否则所有实验均在无血清条件下进行。

免疫细胞化学

细胞在八周Permanox室载玻片中生长到70%的汇合处。取出培养基，用无菌PBS清洗细胞。为了进行免疫染色，细胞在室温下用丙酮-甲醇（1:1，v/v）固定5分钟。固定后，用5%牛血清白蛋白封闭玻片20分钟，然后用PBS进一步清洗。随后，用小鼠单克隆抗α-SMA克隆1A4孵育玻片，在室温下用0.1%牛血清白蛋白-PBS（最终稀释度1:30）稀释2小时。在进一步清洗步骤后，在室温下用异硫氰酸荧光素-兔抗鼠IgG（DAKO，Cambridgeshire，UK）在0.1%牛血清白蛋白-PBS中稀释1:50培养玻片1小时。然后安装细胞并通过荧光显微镜进行分析。

定量聚合酶链反应

年轻和老年皮肤成纤维细胞在35mm培养皿中生长汇合，并用PBS洗涤，然后根据制造商的方案用TRI试剂和RNA纯化进行溶解。根据制造商的协议，使用高容量cDNA逆转录试剂盒逆转录1微克总RNA。它们使用随机引物方法启动cDNA合成。作为阴性对照，用无菌H进行RT₂O替换RNA样本。按照制造商的说明，使用Applied Biosystems的7900HT快速实时PCR系统，使用TaqMan通用PCR主混合（Applied biosystem）进行定量PCR。采用以下TaqMan基因表达检测：CD44（HS00153304_m1，HAS2（HS0019343_m1），肿瘤坏死因子-α刺激基因6（TSG-6）（HS00200180_m1和α-SMA（HS00426835_g1）。PCR的最终体积为20μl/样品（1μl RT产物、1μl靶基因引物和探针、10μl TaqMan Universal PCR Master Mix和8μl无菌H₂O） ●●●●。使用95°C循环1秒和60°C循环20s进行扩增，共40个循环。作为阴性对照，用无菌H进行PCR₂O替换cDNA样本。同时对核糖体RNA（引物和探针，商业设计并从应用生物科学公司购买）进行PCR，作为标准参考基因。比较C_T型方法（扩增在扩增曲线线性范围内的阈值周期）用于基因表达的相对定量。C类_T型从目标基因C中减去标准参考基因（核糖体RNA）_T型以获得ΔC_T型（dC_T型). 平均dC_T型然后计算类似样品的。然后使用公式2计算实验样品中目标基因的表达相对于对照样品中的表达^{−（dCT（1）−dCT（2））}，其中：dC_T型（1） 是平均dC_T型计算实验样品和dC_T型（2） 是平均dC_T型为对照样本计算。

HAS2过表达克隆的产生

HAS2开放阅读框是安德鲁·斯派塞博士（德克萨斯州农工大学，德克萨斯州大学城）赠送的礼物。使用标准PCR生成ORFPfx50页DNA聚合酶（Invitrogen）提高PCR产物的保真度。反应中使用的引物包括限制性内切酶KpnI和NotI的位点。使用Promega T4 DNA连接酶的标准连接反应将开放阅读框插入载体（pCR3.1）。通过细菌转化（JM109大肠杆菌威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。通过限制性内切酶消化（KpnI和NotI）确认HAS2开放阅读框的完整性和方向性。

根据制造商关于主要哺乳动物成纤维细胞转染的协议，借助Nucleofector技术（Amaxa Biosystems，Gaithersburg，MD）进行瞬时转染。成纤维细胞在T75烧瓶中生长到70%的汇合处。然后取出培养基，通过胰蛋白酶化（含有0.05%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA的溶液）收集细胞。一旦细胞分离，用等量的FBS处理产生的细胞悬浮液，以中和蛋白酶活性。使用血细胞仪进行细胞计数，并将细胞数调整至最终浓度0.5×10⁶细胞/ml。然后离心细胞（100×克10分钟），并将所得颗粒重新悬浮在碱性核因子溶液中（Amaxa Biosciences）。用HAS2-pCR3.1或pCR3.1单独转染细胞（模拟转染）。我们使用的浓度为100μl碱性核因子溶液与1μg DNA。然后将溶液转移到Amaxa认证的试管中，并放置在Nucleofector中。根据为哺乳动物成纤维细胞设计的预先指定程序，进行5秒钟的细胞核切除，然后将细胞转移到35mm培养皿或八周Permanox培养箱载玻片中，其中含有添加10%FBS.pmaxGFP（绿色荧光蛋白）的预加热培养基载体作为阳性对照。两个阴性对照：0.5×10⁶100μl碱性核因子溶液中的细胞，含有1μg DNA，但未应用程序和0.5×10⁶100μl碱性Nuclefector溶液中的细胞，不含DNA，但应用程序。实验前，将细胞在添加有10%FBS的培养基中培养24小时，然后在无血清培养基中培育24小时。用pmaxGFP-HAS2共转染或pmaxGFP模拟共转染细胞中的GFP阳性来可视化单个细胞以进行HA涂层分析。

siRNA转染

用靶向HAS2（56458）、TSG-6（139706）或CD44（114068）的特异性siRNA核苷酸（Applied Biosystems）对皮肤成纤维细胞进行瞬时转染。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）进行转染。简言之，细胞在12孔培养板或8孔Permanox室载玻片中的无抗生素培养基中生长至50%汇合。将两微升转染剂稀释在98微升Opti-MEM还原生长培养基（GIBCO，Carlsbad，CA）中，并在室温下培养5分钟。将特定的siRNA寡核苷酸在Opti-MEM还原生长培养基中稀释，使最终浓度为20μmol/L，总体积为100μL。然后将转染剂混合物和siRNA混合物混合，并在室温下再培养10分钟。然后将新形成的转染复合物（200μl）添加到细胞中，并在37°C下与5%CO孵育₂在添加10%FBS的培养基中培养24小时，然后在实验前在无血清培养基中孵育24小时。作为对照，细胞被转染阴性对照siRNA（一个与人类基因组没有同源性的乱序序列）。

通过粒子排斥试验实现细胞外HA的可视化

排除马红细胞用于可视化HA细胞周膜。在PBS中清洗正式化的马红细胞，并在4°C下以1000×g离心7分钟。将颗粒重新悬浮在无血清培养基中，密度约为1×10⁸红细胞/ml。将一毫升这种悬浮液添加到每个含有次级融合细胞的35-mm培养皿中，并轻轻旋转以均匀分布。将培养皿在37°C下培养15分钟，使红细胞在细胞周围沉淀。在添加正式马红细胞之前，将对照细胞与200μg/ml牛睾丸透明质酸酶在无血清培养基中培养30分钟。沉淀后，红细胞被HA细胞周膜从细胞周围的区域排除。这些区域在显微镜下被视为红细胞排斥区。在蔡司Axiovert 135倒置显微镜上观察排斥区。由于细胞的细长形状，细胞某些区域的隔离区不可见。因此，在细胞的最宽点（通常是细胞核）计算排斥区的宽度。

分析^三H-放射性标记HA

细胞在T75烧瓶中生长至完全融合，并在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基或含有10 ng/ml TGF-β1的无血清培养液替换培养基，并持续培养72小时。然后通过20μCi/ml培养进行代谢标记d日-[^三H] 氨基葡萄糖盐酸盐24小时。然后取出培养基，用PBS洗涤细胞。洗涤液和培养基结合形成条件培养基提取物。然后用等体积的200μg/ml Pronase在100 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0和0.05%叠氮化钠中处理24小时。为了去除CD44相关HA，在室温下用10μg/ml胰蛋白酶在PBS中处理细胞10分钟，并指定为胰蛋白酶提取物。然后用等体积的200μg/ml Pronase处理24小时。保留在培养瓶中的细胞直接用100μg/ml Pronase培养24小时。倒出上清液并指定为细胞提取物。每个提取物通过DEAE-Sephacel离子交换柱，用8 mol/L尿素在20 mmol/L Bis-Tris缓冲液中平衡，pH 6，含有0.2%Triton X-100。该过程去除了任何低分子量肽和未结合的放射性标记。HA在含有0.3 mol/l NaCl的8 mol/l尿素缓冲液中洗脱。将每个样品分为两份，在50μg/ml HA、肝素和硫酸软骨素作为共沉淀剂的情况下，用3体积的1%醋酸钾在95%乙醇中沉淀HA。将每个样品的前半部分重新悬浮在500μl 4 mol/l胍缓冲液中，并在与4 mol/l胍缓冲溶液平衡的Sephacryl S-500柱上进行分析。为了确认生成的色谱图是放射性标记HA的结果，每个样品的后半部分在37°C下用1单位透明溶链霉菌透明质酸酶（ICN Pharmaceuticals Ltd.，Hampshire，UK）在200μl 20 mmol/l乙酸钠中的溶液，pH 6，含有0.05%叠氮化钠和0.15 mol/l氯化钠。然后将样品与等体积的4 mol/L胍缓冲液混合，并在同一个Sephacryl S-500柱上分析，该柱与4 mol/L胍缓冲器平衡。为了生成色谱曲线^三对每一半样品的H活性进行标准化和稀释校正，然后减去透明质酸酶抗性计数。色谱图仅显示了每个组分相对于分数的透明质酸酶敏感活性。使用校准柱[^三H] 氨基葡萄糖盐酸盐，M（M）_第页215；[³⁵S] 硫酸软骨素糖胺聚糖，M（M）_第页25 × 10^三; 装饰，M（M）_第页10 × 10⁴; 和[³⁵S] versican大学，M（M）_第页1.3 × 10⁶.

HA浓度的测定

细胞在35-mm培养皿中生长汇合，细胞培养上清液中的HA浓度使用商用酶联HA结合蛋白测定法（HA“Chugai”定量检测试剂盒，英国彼得堡康格尼）测定。该分析使用涂有来自牛软骨的高度特异性HA结合蛋白（HABP）的微孔捕捉HA，并使用酶结合HABP检测和测量样品中的HA。简言之，稀释样品和HA参考溶液在HABP涂层微孔中培养，使样品中的HA与固定化HABP结合。然后清洗微孔，并将与辣根过氧化物酶偶联的HABP添加到微孔中，形成与结合HA的复合物。经过第二次洗涤步骤后，显色底物（3,3′，5,5′-四甲基联苯胺/H₂O（运行）₂)添加以产生有色反应。将停止溶液添加到孔中，并在450 nm处使用分光光度计以光密度单位测量所得颜色的强度。通过将样品吸光度与试剂空白和试剂盒中五种HA参考溶液（50、100、200、500和800 ng/ml）制备的参考曲线进行比较，计算HA浓度。该检测对10 ng/ml敏感，与其他糖胺聚糖化合物无交叉反应。

年轻成纤维细胞比老年成纤维细胞产生更多HA

成纤维细胞标记[^三H] 氨基葡萄糖在无血清条件下24小时的实验表明，与供者匹配的老年成纤维细胞相比，年轻成纤维细胞增加了HA的基线合成（图2A）用排阻色谱法对HA进行分析表明，年轻成纤维细胞条件培养液中的HA含量至少是老年成纤维细胞的2.5倍。年轻的成纤维细胞可获得的胰蛋白酶细胞表面提取物HA是老年成纤维细胞的3.5倍，但细胞相关提取物中的HA含量与老年成纤维纤维细胞相似（数据未显示）。在这三个隔间中的每一个隔间中产生的大多数HA由大于1.5×10的高分子量HA多糖组成⁶大小为Da。这些发现在年轻细胞和老年细胞中都是相似的。

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图2

通过尺寸排除色谱法评估HA的年龄依赖性影响。患者匹配的年轻和老年皮肤成纤维细胞的融合单层在无血清培养基中生长48小时。取出培养基，用单独的无血清培养基或含有10ng/ml TGF-β1的无血清培养基替换72小时。随后用20μCi/ml标记细胞24小时[^三H] 氨基葡萄糖。从条件培养基中分离出放射性标记HA，并在Sephacryl S500柱上进行体积排阻色谱。答：从静止（非刺激）年轻（闭合圆）和老年（开放圆）成纤维细胞纯化HA的尺寸排除色谱图。B类和抄送：幼体HA的尺寸排除色谱分析(B类)和老年人(C类)TGF-β1存在（开环）或不存在（闭环）的真皮成纤维细胞。所有结果都是从至少两个单独的供体中分离出的皮肤成纤维细胞的代表性。

然后使用这两种方法评估TGF-β1对HA合成的影响[^三H] 氨基葡萄糖标记和酶联免疫吸附试验。这些细胞条件培养液的色谱图谱表明，年轻成纤维细胞在TGF-β1刺激下上调HA生成（图2B）而在相同剂量和持续时间的TGF-β1刺激下，老年成纤维细胞对HA的上调有抵抗力（图2C）细胞相关提取物和可获得胰蛋白酶的细胞表面提取物的色谱图显示出类似的模式（数据未显示）。通过使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量不同PDL（PDL 13至46）细胞条件培养液中的细胞外HA浓度，进一步证实了这些结果。在本试验中，在基础条件下，PDL 13和PDL 46之间的细胞外HA浓度显著降低(P（P）=1.1E–09，单向方差分析；P（P）<0.001，Tukey的真实显著性差异（事后测试）和TGF-β1刺激后(P（P）=1.9E–19，单向方差分析；P（P）<0.001 Tukey的真实显著差异（事后测试）（图3）.

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图3

的影响在体外细胞外HA生成的衰老.在指定的PDL，皮肤成纤维细胞的融合单层在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基（白色条）或含有10 ng/ml TGF-β1（黑色条）的无血清培养液替换培养基72小时。用ELISA法测定培养基中HA的浓度。数据表示使用来自一个供体细胞的六个单独实验的平均±SE。使用方差分析进行统计分析，以显示基础PDL之间的全局差异(P（P）=1.1E–09）和TGF-β1(P（P）=1.9E–19）条件，然后是Tukey的真实显著差异事后测试分析：*P（P）与PDL 13相比，<0.001。

HA生成减少与HAS2响应减弱相关

生长停滞后，用TGF-β1刺激年轻和老年皮肤成纤维细胞。HA用ELISA定量，HAS2 mRNA用QPCR定量。如前所述，培养上清液中HA浓度随年龄增长而降低，HA的TGF-β1依赖性刺激也降低（图4A）在相同的细胞中，TGF-β1依赖性刺激老年成纤维细胞中HAS2 mRNA的作用显著减弱（图4B）HAS2亚型HA合成酶的重要性通过年轻细胞中HAS2的基因沉默进一步得到验证。HAS2 siRNA转染显著抑制HAS2 mRNA表达（图4C）以及废除TGF-β1依赖性诱导α-SMA（图4D）.

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图4

年龄对HAS2 mRNA表达的影响及其在TGF-β1依赖性成纤维细胞活化中的作用。A类和B：将患者配对的年轻和老年皮肤成纤维细胞的融合单层在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基（白色条）或含有10 ng/ml TGF-β1（黑色条）的无血清培养液替换培养基，并持续培养72小时。酶联免疫吸附测定法测定培养基中HA的分泌量。去除培养基后，提取总mRNA并制备cDNA，如材料和方法HAS2表达通过RT-QPCR评估。核糖体RNA表达被用作内源性对照，基因表达被评估为相对于对照老化成纤维细胞。比较级C_T型方法用于基因表达的相对定量。数据表示为使用来自两名患者供体细胞的六个单独实验的平均值±SE。统计分析由Student’st吨-测试：^#不显著*P（P）与老化细胞相比，<0.01。N/S，不显著。C类和医生：为了进一步检查HAS2的作用，将年轻的皮肤成纤维细胞转染HAS2 siRNA或干扰寡核苷酸对照（scramb），并在添加10%FBS的培养基中培养24小时。然后用无血清培养基替换培养基24小时，然后单独添加无血清培养液（白色条）或含有10 ng/ml TGF-β1（黑色条）的无血清培养物72小时。提取总mRNA并进行HAS2(C类)和α-SMA(D类)通过RT-QPCR评估表达。核糖体RNA表达被用作内源性对照，基因表达被评估为相对于对照打乱样品。比较级C_T型方法用于基因表达的相对定量，结果表示使用三个不同供体细胞的九个单独实验的平均值±SE。统计分析由学生的t吨-测试：N/S，不显著*P（P）与scramble相比，<0.01。

衰老与TGF-β1依赖性细胞外涂层组件的丢失有关

HA积累可以通过排除正规红细胞来评估。在本试验中，红细胞被细胞周围HA的大尺寸和负电荷从成纤维细胞的细胞膜中排除，如显微镜下观察到的细胞周围的红细胞排除区。以前我们证明，成纤维细胞到肌成纤维细胞的表型转换与HA细胞周被的形成有关。与这一发现一致，未经刺激的年轻或老年成纤维细胞没有形成明显的HA细胞周膜（图5，A和B）而用TGF-β1刺激年轻的成纤维细胞可形成一层显著的外衣（图5C）相反，经TGF-β1刺激后，老化的成纤维细胞未能形成HA细胞周膜（图5D）在每种条件下，从三个单独的实验（三个不同的患者）中随机选择的10个细胞的最宽点处测量涂层厚度。这使得年轻成纤维细胞的平均厚度在基线时为2.99±0.18μm，在TGF-β1刺激后为7.95±0.39μm(P（P）<0.001，未配对t吨-测试）。对于老年成纤维细胞，基线时的平均涂层厚度为2.27±0.16μm，TGF-β1刺激后的平均涂层厚度为2.35±0.21μm(P（P）=0.78，未配对t吨-测试）。

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图5

老化对HA细胞周膜组装的影响。幼崽次级流入层(A类和C类)和老年人(B类和D类)皮肤成纤维细胞在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基替换培养基(A类和B类)或使用10 ng/ml TGF-β1(C类和D类)持续72小时。然后按照材料和方法以可视化HA细胞周膜。箭头表示细胞体；箭头显示细胞周围基质的范围。结果是来自三名患者捐赠者的皮肤成纤维细胞的代表性。原始放大倍数，×200。

单纯HAS2的过度表达不会产生细胞外涂层或改变成纤维细胞表型

由于年龄依赖性TGF-β1诱导的细胞周被组装和肌成纤维细胞表型的丢失与HAS2表达降低有关，我们试图检测HAS2过度表达对老年成纤维细胞的表型的影响。尽管HAS2在老年成纤维细胞中的过度表达导致培养上清液中HA浓度的预期增加（通过ELISA评估）（图6A），α-SMA表达无明显变化（图6，B–D）也不在细胞周HA涂层组件中（图6，E和F）对于每种情况，在从两名独立患者中随机选择的15个细胞的最宽点处测量涂层厚度。这使得老化的模拟转染的成纤维细胞涂层的平均厚度为4.82±0.31μm，而转染过表达HAS2的老化成纤维细胞的涂层平均厚度为4.41±0.42μm(P（P）=0.42，未配对t吨-测试）。

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图6

HAS2在老年皮肤成纤维细胞中的过度表达。用HAS2-pCR3.1（HAS2转染）或pCR3.1（Mock转染）转染老化皮肤成纤维细胞。转染48小时后分泌到培养基中的HA通过ELISA定量(A类). 去除培养基后，提取总mRNA。随后通过RT-QPCR评估α-SMA的表达(B类). 核糖体RNA表达被用作内源性对照，并相对于模拟转染的成纤维细胞评估基因表达。比较级C_T型该方法用于基因表达的相对定量，结果代表了用三名患者供体细胞分离的九个单独实验中皮肤成纤维细胞的平均±SE。免疫组织化学分析检测模拟转染的α-SMA蛋白的表达(C类)和HAS2过度表达(D类)转染48小时后老化真皮成纤维细胞。然后固定细胞并对其进行α-SMA染色，将其安装在Vectashield荧光安装剂中，并在紫外线下观察。原始放大倍数，×100。在平行实验中，HA细胞周膜被可视化。转染48小时后，将正式的马红细胞添加到模拟转染的(E类)或HAS2-过度表达(F类)老年皮肤成纤维细胞材料和方法以可视化HA细胞周膜。箭头表示细胞体；箭头显示细胞周围基质的范围。结果是两名患者捐赠者皮肤成纤维细胞的代表性。原始放大倍数，×200。

TSG-6是细胞外HA组装和成纤维细胞表型的关键调节因子

透明质酸凝集素TSG-6已被证明是HA细胞周被组装的重要介质。31,32,33生长停滞后，用TGF-β1刺激年轻和老年皮肤成纤维细胞，用QPCR定量TSG-6 mRNA。在这些实验中，TSG-6的表达在基线和TGF-β1刺激后均呈年龄依赖性下降（图7A）随后使用siRNA沉默TSG-6基因来检测TSG-6表达随年龄降低的功能重要性。转染TSG-6 siRNA后，TGF-β1对TSG-6 mRNA表达的影响显著抑制（图7B）TGF-β1依赖性诱导TSG-6 mRNA表达的消失也与TGF-α1未能增加年轻成纤维细胞中的α-SMA有关（图7C）这一结果使我们假设，细胞周膜的组装依赖于HAS2对HA的刺激和TSG-6的诱导。为了探讨这个假设，用HAS2转染老化的成纤维细胞，然后用TGF-β1刺激。在这些实验中，HAS2过度表达和TGF-β1刺激的结合恢复了老化成纤维细胞形成细胞周HA涂层的能力，这是通过排除正规红细胞来评估的（图8，A–C）在每种条件下，从三个单独的实验（三个不同的患者）中随机选择的10个细胞的最宽点处测量涂层厚度。这使得在TGF-β1刺激后转染HAS2过度表达的老化成纤维细胞中，老化模拟转染成纤维细胞的平均涂层厚度为3.19±0.27μm，而老化成纤维纤维细胞的涂层厚度为6.59±0.41μm(P（P）<0.001，未配对t吨-测试）。然而，通过免疫细胞化学分析评估，HAS2转染并未恢复TGF-β1对α-SMA诱导的反应性（图8，D–F）和QPCR（图9A）表明细胞周被形成和表型调控分离。与细胞周被的形成形成相反，HAS2的过度表达和HA生成的增加与TGF-β1刺激后老年成纤维细胞TSG-6诱导的部分恢复有关（图9B）.

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图7

TSG-6参与TGF-β1依赖性成纤维细胞活化。答：将患者配对的年轻和老年皮肤成纤维细胞的融合单层在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基（白色条）或含有10 ng/ml TGF-β1（黑色条）的无血清培养液替换培养基，并持续培养72小时。提取总mRNA，并按照材料和方法中的描述制备cDNA。通过RT-QPCR评估TSG-6的表达。核糖体RNA表达被用作内源性对照，基因表达被评估为相对于对照老化成纤维细胞。比较C_T型方法用于基因表达的相对定量。数据以从两名患者供体细胞中分离出的六个单独实验的平均值±SE表示。统计分析由Student’st吨-测试：*P（P）与老化细胞相比，<0.05。N/S，不显著。B类和抄送：为了进一步研究TSG-6的作用，用TSG-6 siRNA或干扰寡核苷酸对照（scramb）转染年轻皮肤成纤维细胞，并在补充有10%FBS的培养基中培养24小时。然后用无血清培养基替换培养基24小时，然后单独添加无血清培养液（白色条）或含有10 ng/ml TGF-β1（黑色条）的无血清培养物72小时。提取总mRNA和TSG-6(B类)和α-SMA(C类)通过RT-QPCR评估表达。核糖体RNA表达被用作内源性对照，基因表达被评估为相对于对照打乱样品。比较级C_T型方法用于基因表达的相对定量，结果表示使用三个不同供体细胞的九个单独实验的平均值±SE。统计分析由Student’st吨-检验，统计显著性为P（P）< 0.05. N/S，不显著。

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图8

HAS2过度表达对老年皮肤成纤维细胞TGF-β1后细胞周HA外壳组装和表型的影响。耐心的年轻人(A类和D类)和老年人(B、， C、， E、，和F类)皮肤成纤维细胞单独转染pCR3.1(A中， B、， D、，和E类)或HAS2-pCR3.1(C类和F类). 转染48小时后，细胞在含有10 ng/ml TGF-β1的无血清培养基中培养72小时。细胞周HA涂层(A–C)通过添加形式化的马红细胞进行可视化。箭头表示细胞体；箭头显示细胞周围基质的范围。图像是三位患者捐赠者皮肤成纤维细胞的代表性图像。原始放大倍数，×200。刺激后细胞固定，免疫组化显示α-SMA(D–F型). 将载玻片安装在Vectashide荧光贴片剂中，并在紫外光下观察。原始放大倍数，×100。

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图9

HAS2过表达对老年真皮成纤维细胞TGF-β1依赖性反应的影响。用HAS2-pCR3.1或pCR3.1单独转染老化皮肤成纤维细胞（模拟转染）。对患者匹配的年轻皮肤成纤维细胞进行平行模拟转染。转染48小时后，细胞在无血清培养基（白色条）或含有10 ng/ml TGF-β1（黑色条）的无血清培养液中培养72小时。α-SMA(A类)和TSG-6(B类)通过RT-QPCR评估mRNA表达。使用核糖体RNA表达作为内源性对照，并相对于对照模拟转染的老化细胞评估基因表达。比较级C_T型方法用于基因表达的相对定量，结果表示使用三个不同供体细胞的九个单独实验的平均值±SE。统计分析由Student’st吨-检验，统计显著性为P（P）< 0.05. N/S，不显著。

衰老细胞对白细胞介素-1β的应答维持HAS2应答

通过IL-1β刺激进一步检测HAS2的年龄依赖性调节。与TGF-β1反应性随年龄增长而减弱相反，IL-1β刺激老化细胞（而非年轻细胞）可显著诱导HAS2基因表达（图10A）根据ELISA评估，这也与HA增加有关（图10B）此外，与TGF-β1在衰老细胞中的钝化作用相比，添加IL-1β后TSG-6的诱导作用显著（图10C）相反，尽管HA相关基因调控发生改变，但IL-1β刺激并未导致α-SMA表达的任何变化（图10D）HAS2的增加与透明质黏附素TSG-6的诱导有关，这表明IL-1β刺激可能会诱导细胞周HA涂层的形成，这一点通过观察年轻和老年细胞中的细胞周HA外壳证实（图11，A–D）。对于每种情况，在从两个单独的实验（两个不同的患者）中随机选择的15个细胞的最宽点处测量涂层厚度。这些结果表明，幼年成纤维细胞涂层的平均厚度在基线时为3.04±0.19μm，在IL-1β刺激后为8.25±0.18μm(P（P）<0.001，未配对t吨-测试）。对于老年成纤维细胞，基线时的平均涂层厚度为3.15±0.35μm，IL-1β刺激后的平均涂层厚为7.95±0.42μm(P（P）=0.001，未配对t吨-测试）。因此，这一发现表明，在IL-1β刺激后，存在细胞周HA外壳组装分离和表型调控。

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图10

添加IL-1β后，老化细胞保持HAS2反应性。患者匹配的年轻和老年真皮成纤维细胞的汇合单层在无血清培养基中生长停滞48小时。然后将培养基替换为无血清培养基（白色条）、含有10 ng/ml TGF-β1的无血清培养液（灰色条）或含有1 ng/ml IL-1β的无血清介质（黑色条），持续72小时。提取mRNA，并按照材料和方法.HAS2型(A类)，TSG-6(C类)和α-SMA(D类)通过RT-QPCR评估表达。使用核糖体RNA表达作为内源性对照，并相对于对照老化细胞评估基因表达。比较级C_T型方法用于基因表达的相对定量，结果表示使用来自两个不同供体细胞的六个单独实验的平均值±SE。统计分析由Student’st吨-测试和统计显著性为P（P）< 0.05. N/S，不重要。B：用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定老年细胞培养液中HA的分泌量。数据是使用从两个不同供体分离的细胞进行的六个单独实验的平均值±SE。统计分析由Student’st吨-测试：*P（P）< 0.05; **P（P）与对照细胞相比<0.01。

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图11

IL-1β对HA细胞周被组装的影响。与患者匹配的年轻人的次级流入层(A类和C类)和老年人(B类和D类)皮肤成纤维细胞在无血清培养基中生长48小时。然后用无血清培养基替换培养基(A类和B类)或1 ng/ml IL-1β(C类和D类)持续72小时。然后按照所述添加正式化的马红细胞，以可视化HA细胞周膜。使用蔡司Axiovert 135倒置显微镜观察排斥区。箭头表示细胞体；箭头显示细胞周围基质的范围。图像是两名患者捐赠者皮肤成纤维细胞的代表性图像。原始放大倍数，×200。