腺病毒介导HIF-1α增强糖尿病小鼠肢体缺血血管反应

组分活性HIF-1α促进缺血血管恢复数据库/数据库老鼠。

我们之前已经证明，在非糖尿病小鼠中，AdCA5（一种编码HIF-1α组成型活性形式的腺病毒）的给药可以改善单侧股动脉结扎后肢体灌注的恢复(9). 为了确定增加AdCA5治疗是否可以克服糖尿病相关的血管缺血反应损伤，数据库/数据库小鼠沿着切除的股动脉的前一段接受肌肉注射AdCA5或AdLacZ（一种编码β-半乳糖苷酶的对照腺病毒）。股动脉结扎和基因治疗后第3天，使用扩增内源性小鼠HIF-1α和人HIF-1βCA5的引物，定量实时逆转录PCR分析小腿肌肉中HIF-1γmRNA水平，结果显示，与AdLacZ治疗的小鼠非缺血肢体相比，缺血肢体中HIF-αmRNA增加了3倍，而HIF-1αmRNA水平在接受AdCA5治疗的小鼠缺血肢体中相对于非缺血肢体增加了20倍(图S2A类). 第7天获得了类似结果(图S2B类). 因此，在股动脉结扎后至少1周内，AdCA5治疗显著增加缺血肢体HIF-1αmRNA水平。

到第3天，LDPI测定的肢体灌注恢复(图2A类)与AdLacZ治疗组相比，AdCA5治疗组也显著增加数据库/数据库小鼠和这种差异在整个观察期内持续存在(图2B类). 到第21天，AdCA5治疗的小鼠恢复了85%的血流量，而AdLacZ治疗的小鼠仅恢复了24%。AdCA5处理数据库/数据库与AdLacZ治疗的同窝小鼠相比，小鼠的组织损伤和神经功能缺损也显著减少(图2 C类和D类).

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图2。

AdCA5治疗对糖尿病小鼠缺血后恢复的影响。股动脉结扎后立即给予AdLacZ或AdCA5。(A类)显示了具有代表性的串行LDPI。(B–D类)测定非缺血肢体和缺血肢体的灌注比率(B类)和组织坏死(C类)和行走障碍(D类)在每个时间点得分。显示了平均值±SEM值(n个= 7). 采用双向方差分析和Bonferroni校正（右括号）评估各组之间的差异；***，P（P）在个别时间点<0.001。

接下来，我们在第7天检查了AdLacZ和AdCA5处理小鼠缺血肢体的收肌组织病理学。苏木精/伊红染色切片的显微镜检查证实了AdCA5治疗糖尿病小鼠的组织保护作用(图3 A–D). 与AdLacZ处理小鼠相比，AdCA5处理小鼠的组织保存面积显著增加，炎症细胞浸润面积显著减少(图3K（K）). 两个治疗组均观察到促进动脉生成的巨噬细胞浸润(图3 E类和F类). 相反，淋巴细胞浸润(图3 G公司和H（H）)和中性粒细胞(图3 我和J型)与AdCA5处理的小鼠相比，AdLacZ处理的小鼠进入缺血肢体的次数显著增加。

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图3。

糖尿病小鼠治疗后缺血性内收肌的组织学分析。(A–D)股动脉结扎术后第7天组织切片苏木精-伊红染色及AdLacZ治疗(A类)或AdCA5(B类)（原始放大倍数，40倍）。黑色箭头表示炎症细胞浸润的区域，红色箭头表示正常肌肉组织组织学保留的区域。方框区域以较高的功率显示(C类和D类; 原始放大倍数，200倍）。(E–J）巨噬细胞浸润区的免疫组织化学染色(E类和F类)，淋巴细胞(G公司和H（H）)和中性粒细胞(我和J型)分别使用F4/80、CD3和髓过氧化物酶抗体（原始放大200倍）。(K（K）)用平均值±SEM定量渗透和保存区域占总组织面积的百分比(n个=每只4只小鼠）。**，P（P）<0.01（Mann–Whitney试验）。

为了评估血管化，在第21天对缺血肢体的收肌切片进行染色，以确定是否存在平滑肌α-肌动蛋白（SMA），SMA在成熟血管的周细胞和平滑肌细胞中都表达(图4A类). AdCA5治疗的缺血肢体切片中SMA数量显著增加⁺容器（4.75±0.73/200×场）(图4B类)与非缺血对侧肢体（0.60±0.18/场）或AdLacZ治疗的缺血肢体（1.70±0.21/场）相比。与对侧肢体相比，两个治疗组缺血肢体的血管管腔面积均增加（AdLacZ占总面积的0.16±0.02%对0.07±0.01%；AdCA5占总面积1.05±0.22%对0.06±0.01）(图4C类). 然而，SMA⁺与AdLacZ治疗的缺血肢体相比，AdCA5治疗的肢体血管面积显著增加。增加的SMA数量和管腔面积⁺血管为AdCA5治疗后缺血肢体血流量增加和组织存活提供了组织学基础数据库/数据库老鼠。

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图4。

使用抗SMA抗体对组织血管化进行免疫组织化学分析。(A类)结扎并用AdLacZ或AdCA5治疗后第21天采集的非缺血性（NIS）和缺血性（ISC）肢体收肌的代表性切片（原始放大倍率，200×）。(B类)SMA平均数⁺收肌断面每200×场血管数。数据为平均值±SEM(n个=每只4只小鼠）。**，P（P）<0.01 vs.对侧NIS肢体；#，P（P）与AdLacZ治疗的ISC肢体（学生的t吨-测试）。(C类)血管腔面积被确定为该区域组织总面积的百分比。*，P（P）<0.05 vs.对侧NIS肢体；#，P（P）与AdLacZ治疗的ISC肢体相比，<0.01（Mann-Whitney试验）。

AdCA5基因治疗增加缺血患者的CAC数量数据库/数据库老鼠。

股动脉结扎后第3天和第7天的外周血分析显示CD34数量显著增加⁺/血管内皮生长因子2⁺第3天和第7天的细胞(图5A） 和Sca-1⁺/血管内皮生长因子2⁺第3天的细胞(图5B类)与AdLacZ处理的小鼠相比，AdCA5处理的小鼠。总体而言，CD34⁺/CXCR4系列⁺与AdLacZ处理的小鼠相比，AdCA5处理的小鼠的细胞数量显著增加，尽管个别时间点的差异不显著(图5C类).

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图5。

AdCA5治疗对糖尿病小鼠股动脉结扎后外周血CACs数量的影响。术后立即将AdCA5或AdLacZ注入缺血肢体。3或7天后，收集外周血并通过流式细胞术分析，以检测以下CACs人群：CD34⁺/血管内皮生长因子2⁺(A类)，Sca-1⁺/血管内皮生长因子2⁺(B类)和CD34⁺/CXCR4系列⁺(C类). 平均值±SEM(n个=4–5个）。通过双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni校正（顶部括号）评估统计显著性；*，#，P（P）与AdLacZ相比，单个时间点<0.05。

手术和基因治疗。

按照描述进行股动脉结扎(9). AdCA5是人类HIF-1α的组成活性形式，含有一个缺失（残基392-520）和两个错义突变（Pro567Thr和Pro658Gln）。大规模腺病毒生产在NHLBI载体核心设施（匹兹堡大学）进行。股动脉结扎后，立即在左后肢收肌的三个部位和腓肠肌的一个部位注射AdLacZ或AdCA5数据库/数据库老鼠。总计2×10⁸在每只小鼠体内注射成斑单位。

血流分析和体检。

使用激光多普勒灌注成像系统（Moor Instruments，Inc.）测量血流，并将其表示为缺血：非缺血肢体的信号(9). 动态损伤评分如下：0=足底/脚趾屈曲以抵抗轻微的尾部牵引，1=足底但不屈曲脚趾，2=无足底或脚趾屈曲，3=不使用脚。组织坏死评分如下：0=无坏死，1=发绀/变色，2=坏死/1–2趾缺失，3=坏死/3–5趾缺失，4=坏死延伸至足背或更高。

流式细胞术。

对血液进行红细胞裂解和Fc阻断（CD16/CD32；BD PharMinen）。使用藻红蛋白结合的抗VEGFR2抗体（Avas 12α1；BD-PharMinen）和FITC-结合的抗CD34抗体（RAM34；eBioscience）、抗CD117抗体（2B8，eBioschience）和抗Sca-1抗体（E13-161.7，BD-Pharminen）通过流式细胞术（LSRII；Becton Dickinson）分析单核细胞。采集了20万个事件，对前向散射和侧向散射窗口中的活细胞数进行了门控，双阳性细胞以总细胞的百分比表示。

定量实时逆转录PCR。

使用TRIzol（Invitrogen）从肌肉中提取总RNA，在异丙醇中沉淀，并用DNase I（Ambion）处理。使用iScript试剂盒（BioRad）将1μg等分总RNA作为cDNA合成的模板。使用iQ SYBR Green Supermix和iCycler实时PCR检测系统（BioRad）进行实时PCR。使用比较ΔC计算HIF-1αmRNA相对于RPL13A mRNA_t吨方法(9).

组织学和免疫组织化学。

取内收肌，用10%福尔马林固定，石蜡包埋，5μ米-厚切片用苏木精和伊红染色。使用Image J软件（美国国立卫生研究院）对炎性细胞浸润和组织保存区域（正常组织学）进行量化，并以占总面积的百分比进行报告。对于免疫组织化学，在切片脱蜡后进行热诱导抗原回收。内源性过氧化物酶活性被H培养所阻断₂O（运行）₂/甲醇。用无血清蛋白块（DAKO公司）或5%兔血清阻断非特异性结合。将切片在室温下与以下一级抗体（按指示稀释）孵育1小时或在4°C下孵育过夜：大鼠抗鼠F4/80（1:100，Invitrogen）、兔抗髓过氧化物酶（1:50，Abcam）和兔抗CD3（1:500，Abcam）。切片用次生生物素化抗体孵育，在PBS中洗涤，并用Vectastain ABC Elite（Vector Labs）孵育。使用3，3′二氨基联苯胺过氧化物酶底物（Vector Labs）观察亲和素-生物素复合物。使用抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体（1:50，Sigma-Aldrich）、ABC-AP试剂盒（Vector Labs）和AP底物试剂盒（Vactor Lab）进行SMA染色。切片用苏木精复染（Richard-Allen）。座椅模块组件⁺使用Image J软件在每张幻灯片的5个随机字段中以200倍的功率量化血管密度和血管面积。

免疫印迹分析。

在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（完整蛋白酶抑制剂混合物和PhosSTOP，Roche Diagnostics）的RIPA缓冲液中制备缺血小腿肌肉的蛋白裂解物，并通过SDS/PAGE进行分离。抗eNOS和磷酸化eNOS[Ser-1177]的抗体分别来自Novus Biologicals和Cell Signaling Technology。

我们感谢Karen Padgett（Novus Biologicals）提供抗eNOS抗体，感谢Andrea Gambotto和Susan Schoonover（匹兹堡大学）提供大规模腺病毒制剂，感谢Ryan Chang提供技术援助。这项研究得到了美国糖尿病协会和约翰·霍普金斯细胞工程研究所的支持。G.L.S.是约翰·霍普金森大学医学院的C.Michael Armstrong教授。