肝素杂志。作者手稿；PMC 2009年11月5日提供。
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肝脏表观遗传学表型预先决定了喂食脂肪性甲基缺乏饮食的小鼠对肝脏脂肪变性的个体易感性
,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,三 ,4 ,5和1
伊戈尔·波格里布尼
1美国国家毒理学研究中心生化毒理学部，杰斐逊，AR 72079
Volodymyr P.Tryndyak公司
1美国国家毒理学研究中心生化毒理学部，杰斐逊，AR 72079
Tetyana V.Bagnyukova公司
1美国国家毒理学研究中心生化毒理学部，杰斐逊，AR 72079
斯蒂芬·梅尼克
2阿肯色大学医学科学院儿科系，小石城，AR 72205
贝弗利·蒙哥马利
1美国国家毒理学研究中心生化毒理学部，杰斐逊，AR 72079
莎伦·罗斯
三马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症预防科，邮编：20892
约翰·拉特德斯
4美国国家毒理学研究中心毒理学病理协会，Jefferson，AR 72079
伊凡·鲁辛
5北卡罗来纳大学环境科学与工程系，北卡罗来那州教堂山，邮编：27599
弗雷德里克·贝兰德
1美国国家毒理学研究中心生化毒理学部，杰斐逊，AR 72079
1美国国家毒理学研究中心生化毒理学部，杰斐逊，AR 72079
2阿肯色州小石城阿肯色大学医学科学系儿科72205
三马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症预防科，邮编：20892
4美国国家毒理学研究中心毒理学病理协会，Jefferson，AR 72079
5北卡罗来纳大学环境科学与工程系，北卡罗来那州教堂山，邮编：27599
- 补充材料
SF1。
GUID:6182C24D-7736-4896-B2AB-D5ACB3C7DF78
摘要
背景/目标
表观遗传变化在疾病的病因和发病机制中的重要性日益得到认识。然而，表观遗传学改变在肝脂肪变性发生中的作用以及个体对这种病理状态易感性的原因基本上尚不清楚。
方法
雄性近交系C57BL/6J和DBA/2J小鼠被喂食产生脂肪的甲基缺乏性饮食（MDD），这种饮食会导致类似于人类非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的肝脏损伤，持续6、12或18周，以及整体和重复元素胞嘧啶甲基化、组蛋白修饰、，并测定了肝脏中负责这些表观遗传修饰的蛋白质的表达。
结果
近交系C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏脂肪变性的发展伴随着显著的表观遗传异常。这可以通过基因组和重复序列胞嘧啶甲基化的明显丢失来证明，尤其是在大卫星和小卫星上，伴随着重复相关转录物水平的增加、组蛋白异常修饰以及维持DNA甲基转移酶1（DNMT1）和从头开始两种小鼠品系肝脏中的DNMT3A蛋白。然而，与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠最初的特点是重复元素甲基化程度较低，正常肝脏中组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）和H3赖胺酸27（H3K27）三甲基化程度低，因此出现了更显著的NASH特异性病理形态学变化。
结论
这些结果在机制上将表观遗传学改变与肝脂肪变性的发病机制联系起来，并强烈提示细胞表观遗传学状态的差异可能是个体对肝脂肪变性易感性的预先决定因素。
关键词：肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、DNA甲基化、组蛋白修饰、疾病易感性
1.简介
当前生物医学研究的趋势正在朝着阐明疾病发展的分子机制、细胞途径、网络和过程的方向发展。具体地说，近年来，人们致力于揭示与个体对任何特定病理状态易感性相关的基本机制，包括非酒精性脂肪性肝炎（NASH），这是一种渐进形式的非酒精性肥胖性肝病，其特征是肝内脂质积聚、炎症、，肝细胞损伤和纤维化[1,2]. 这对于确定弱势群体和制定新的预防策略具有重要意义[三].
在后基因组时代，小鼠已成为生物医学研究许多方面的主要实验动物模型，因为它们与人类具有许多生理、解剖和代谢特性[4,5]. 此外，基因定义的近交系小鼠代表了与人类群体相似的广泛遗传多样性，这使得研究个体对疾病发展敏感性的重要方面成为可能[6]. 事实上，已经证明近交系小鼠对NASH的敏感性差异很大[6,7]. 同样，遗传因素极大地影响了个体对NASH的易感性[2]在人类中。人们普遍认为，疾病易感性的遗传变异通过破坏各种代谢途径对表型产生重大影响[4,8]对NASH的不同易感性可能主要与遗传决定表型的差异有关[7].
在过去的十年中，表观遗传机制在疾病的病因和发病机制中的作用越来越被人们所认识[9]. 这些表观遗传机制，尤其是DNA甲基化和组蛋白氨基末端尾部的修饰，对于正确维持细胞内环境稳定至关重要。正常细胞的表观遗传状态被精确地维持和平衡，这种平衡的破坏导致了人类多种病理学的发展[9]. 然而，表观遗传改变在肝脂肪变性发生中的作用以及对NASH敏感性个体间差异的原因在很大程度上尚不清楚。几项研究的结果表明，小鼠对苯巴比妥诱导的肝损伤和肝癌敏感性的株间差异与维持肝脏DNA甲基化正常模式的能力呈负相关[10]. 同样，与敏感雄性大鼠相比，雌性Sprague-Dawley大鼠对2-乙酰氨基芴诱导的肝癌的抵抗与肝脏中组蛋白H3K9和组蛋白H4K20三甲基化水平更高有关[11]. 这些发现表明，细胞表观遗传状态的差异可能是肝脂肪变性不同易感性的预先决定因素。
鉴于这些考虑，本研究旨在：1）确定表观遗传改变（如DNA甲基化和组蛋白修饰）在小鼠肝脏脂肪变性发生中的作用，这是一种类似于人类NASH的病理状态；以及2）确定小鼠对肝脂肪变性的株特异性敏感性是否与个体表观遗传表型的差异有关。
2.材料和方法
2.1. 动物、饮食和实验设计
在最初的实验中，我们测定了雄性BALB/CJ、C3H/HeJ、A/J、AKR/J、C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏的表观遗传图谱（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）。在主要研究中，雄性C57BL/6J和DBA/2J小鼠（杰克逊实验室）被关在温度控制（24°C）的无菌笼子里，有12小时的光/暗循环随意获得纯净水和NIH-31颗粒饮食（印第安纳州里士满普瑞纳磨坊）。八周龄时，将每种品系的小鼠随机分为两组，一组为对照组，另一组为实验组。实验组的小鼠维持低蛋氨酸（0.18%）饮食，缺乏胆碱和叶酸（Dyets，Inc，Bethlechem，PA）18周。对照组小鼠的饮食中添加0.4%蛋氨酸、0.3%酒石酸胆碱和2mg/kg叶酸。饮食储存在4°C下随意，每周更换两次。在开始饮食后6、12和18周处死5只实验小鼠和5只对照小鼠。所有动物实验程序均按照国家毒理学研究中心动物护理和使用委员会批准的动物研究方案进行。
2.2. 尸检、组织加工和组织病理学
在完成指定的实验间隔后，用一氧化碳对小鼠进行人道安乐死2切除肝脏，将一片内侧叶固定在10%中性缓冲福尔马林中48小时，进行组织病理学检查。剩余的肝脏立即在液氮中冷冻，并储存在−80°C下，以供后续分析。进一步处理福尔马林固定的肝脏切片，将其包埋在Tissue Prep II石蜡中，以4微米切片，贴在玻璃载玻片上，并用苏木精和伊红染色，然后盖玻片。对肝脏切片进行脂肪变性、肝细胞变性、炎症、肝细胞核细胞增生和卵圆细胞增殖评估，并使用严重程度评分系统对每个形态学参数进行评分，如下所示：0级，无；1级，最低；2级，轻度；3级，中度；4级，已标记；5级，严重变化。
2.3. 肝甘油三酯含量的测定
通过在500µl异丙醇中均匀化20 mg肝组织来提取肝甘油三酯。接下来，使用4µl提取物进行后续分析。根据制造商的说明，使用Wako L型TG-M检测试剂盒（Wako Diagnostic，弗吉尼亚州里士满）测定甘油三酯水平。
2.4. 用胞嘧啶延伸试验测定总DNA甲基化
如Pogribny所述，使用胞嘧啶延伸试验评估整体DNA甲基化的程度等。[12].
2.5. 肝蛋氨酸、S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）含量的测定
如前所述，通过HPLC方法和库仑电化学检测测定肝组织提取物中的蛋氨酸、SAM和SAH含量[13].
2.6. DNA重复序列的定量PCR甲基化分析
如前所述，通过甲基化敏感的McrBC-qPCR测定小鼠基因组重复元件的甲基化分析，包括主要和次要卫星、酯类内A颗粒（IAP）、长散布元件（LINE）和短散布元件（SINE）[14]. 用甲基化特异性限制酶McrBC（马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）消化基因组DNA（1µg）过夜，然后用Martens中描述的引物进行qPCR分析等。[13]. 使用SYBR进行两步qPCR®GreenER™SuperMix（Invitrogen，Carlsbad，CA）适用于iCycler（Bio-Rad，Hercules，CA），在95°C下40次循环45秒，在58°C下90秒。最后一次循环后，在55–95°C范围内对所有样品进行熔化曲线分析。所有反应均一式三份。阈值周期（Ct吨)定义为通过固定阈值的分数周期数。C类t吨使用绝对标准曲线法将每个重复元素的值转换为输入DNA的绝对量。用McrBC消化后输入DNA量的增加表明低甲基化，而输入DNA量的减少表明高甲基化。
2.7. 定量逆转录PCR（qRT-PCR）
根据制造商的说明，使用TRI试剂（Ambion，Austin，TX）从肝组织中分离出总RNA。重复相关和肉碱棕榈酰转移酶1a的水平(Cpt1a）如前所述，基因转录物通过qRT-PCR测定[7,14]. 使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶对基因表达进行相对定量(Gapdh公司)作为内部控制。第2个-ΔΔCt方法用于计算目标RNA的相对量[15]. qRT-PCR至少进行了三次，始终包括一个无模板样品作为阴性对照。
2.8. 组蛋白修饰的免疫印迹分析
如前所述，通过Western免疫印迹分析测定小鼠肝脏中组蛋白macroH2A的水平和H3K9me3、H3K27me3和组蛋白H4K20me3的状态[16].
2.9. 蛋白质表达的免疫印迹分析
如前所述，通过Western免疫印迹分析测定DNMT1、DNMT3A、甲基-CpG-结合蛋白MeCP2、组蛋白赖氨酸甲基转移酶（KMT）Suv39h1、Suv4-20h2和RIZ1以及β-肌动蛋白的肝脏蛋白水平[16].
2.10. 统计分析
结果以平均值±标准差表示，并通过双向方差分析（ANOVA）进行评估，将治疗和周数作为固定因素，或通过单向方差分析将治疗作为固定因素。P值<0.05被认为是显著的。
3.结果
3.1. 表观遗传学分析揭示了近交系小鼠肝脏的品系特异性差异
对BALB/CJ、C3H/HeJ、A/J、AKR/J、C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏的表观遗传状态的分析显示，胞嘧啶甲基化程度和组蛋白修饰模式存在显著的株间差异(). 与A/J、AKR/J、BALB/CJ、C3H/HeJ和C57BL/6J菌株相比，在DBA/2J小鼠中检测到最显著的菌株特异性表观遗传学差异。有趣的是，DBA/2J小鼠正常肝脏的表观遗传学特征与暴露于非基因毒性肝癌过氧化物酶体增殖物WY-14643或甲基缺乏饮食的动物肝脏中检测到的表观遗传特征相似[17,18]. 基于这些标准，在主要研究中，我们选择了DBA/2J小鼠作为可能对肝脂肪变性发展敏感的菌株。从具有类似肝脏表观遗传表型的三个潜在耐药菌株BALB/CJ、C3H/HeJ和C57BL/6J中，我们选择了C57BL/6J小鼠作为主要研究对象，因为有证据表明该菌株具有高度活性IAP元件甲基化程度更高的特点().
表1
六个近交系小鼠肝脏的表观遗传图谱（平均值±S.D.，n=3）。
后生的
修改 | 应变 |
|---|
|
|---|
| BALB/CJ公司 | C3H/HeJ（高度） | A/J公司 | AKR/日 | C57BL/6J型 | 数据库/2J |
|---|
|
| DNA甲基化一 | 3.84 ± 0.18 | 3.65 ± 0.22 | 4.33 ± 0.28 | 3.09 ± 0.18 | 3.62 ± 0.18 | 3.33 ± 0.13 |
| 主要卫星b条 | 0.386 ± 0.037 | 0.451 ± 0.026 | 0.488 ± 0.213 | 0.346 ± 0.068 | 0.433 ± 0.077 | 0.411 ± 0.150 |
| 小型卫星b条 | 5.48 ± 0.27 | 9.84 ± 1.88 | 7.90 ± 0.77 | 5.17 ± 0.53 | 8.26 ± 0.22 | 14.8 ± 2.4 |
| 管路1-ORF2b条 | 2.88 ± 0.36 | 3.55 ± 0.30 | 4.02 ± 0.65 | 2.56 ± 0.46 | 3.65 ± 0.64 | 3.99 ± 1.01 |
| 正弦B1b条 | 4.44 ± 0.27 | 6.58 ± 0.36 | 5.53 ± 1.34 | 3.90 ± 0.54 | 5.60 ± 1.41 | 5.91 ± 1.75 |
| 正弦B2b条 | 10.5 ± 3.0 | 13.5 ± 1.4 | 11.6 ± 2.9 | 8.53 ± 1.25 | 12.0 ± 2.5 | 11.2 ± 3.7 |
| IAP-GAG公司b条 | 0.048 ± 0.017 | 0.043 ± 0.007 | 0.073 ± 0.016 | 0.024 ± 0.005 | 0.024 ± 0.002 | 0.049 ± 0.016 |
| H3K9米3c（c） | 118 ± 2 | 142 ± 5 | 155 ± 3 | 26 ± 1 | 141 ± 4 | 46 ± 11 |
| H3K27me3型c（c） | 163 ± 11 | 191 ± 3 | 194 ± 6 | 155 ± 10 | 154 ± 12 | 123 ± 10 |
| H4K20me3型c（c） | 110 ± 4 | 85 ± 4 | 126 ± 5 | 118 ± 2 | 118 ± 3 | 116 ± 6 |
3.2. 喂食MDD的C57BL/6J和DBA/2J小鼠的肝脏组织病理学
对C57BL/6J和DBA/2J小鼠给予MDD 18周，导致肝实质脂肪改变(). 喂食MDD的小鼠肝脏中存在脂肪变性，也可以通过两种小鼠品系中肝脏甘油三酯浓度的显著增加来证明；然而，DBA/2J小鼠的甘油三酯水平显著高于C57BL/6J小鼠(). 此外，喂食MDD小鼠的肝脏表现为显著的肝细胞变性和坏死、肝脏炎症、核细胞增多、肝细胞增大、细胞核增大和卵圆细胞增殖(). 与C57BL/6J小鼠的这些参数相比，喂食MDD 18周的DBA/2J小鼠的肝脏影响随着饮食持续时间的延长而逐渐加重，总体上最严重().
连续18周喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏的组织形态学变化（A）和甘油三酯浓度（B）（A）对照C57BL/6J的正常肝脏（一）和DBA/2J（二）老鼠。甲基缺乏C57BL/6J患者肝脏的典型组织病理学变化（三、四）和DBA/2J（四、六）老鼠。弥漫性大囊性脂肪变性，4级，C57BL/6J(三)和DBA/2J中的5级（四）老鼠。甲基缺乏DBA/2J小鼠肝脏典型变化的肝小叶中心区（六）耗尽（坏死）的肝细胞被纤维化（短箭头）、炎症（箭头）和卵圆细胞增殖（长箭头）所取代。注意肝细胞的巨细胞增生症（核细胞）（*）。甲基缺乏C57BL/6J小鼠的肝脏中观察到类似但较轻的损伤（五）.
（三）和（四）.原稿放大50倍；（一）,（二）,（五）、和（六）–原稿放大200倍。c-小叶中心区，p-门脉周围区，L-脂质空泡。
肝脏甘油三酯浓度表示为同一时间点相对于对照组的平均±S.D.（n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著。
表2
C57BL/6J小鼠和喂食低甲基饮食18周的小鼠肝脏病理形态学变化总结（平均值±S.D.，n=5）。
| 形态学 | 组织病理学评分 |
|---|
|
|---|
| 数据库/2J | C57BL/6J型 |
|---|
|
| 脂肪变性 | 4.8 ± 0.4* | 3.8 ± 0.8 |
| 坏死 | 3.8 ± 0.4* | 2.0 ± 0.7 |
| 炎症 | 2.0 ± 0.1 | 2.4 ± 0.9 |
| 卵巢细胞增生 | 2.6 ± 0.5* | 1.4 ± 0.5 |
| 核小细胞学 | 2.4 ± 0.6* | 1.0 ± 0.1 |
3.3. MDD对C57 BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏DNA甲基化的影响
在对照C57BL/6J和DBA/2J小鼠的肝脏中，DNA甲基化程度在18周内没有改变(). 在喂食MDD的小鼠肝脏中，DNA逐渐去甲基化，这可以从以下方面得到证明：[三H] dCTP转化为HpaII消化的DNA。然而，与C57BL/6J菌株相比，甲基缺乏DBA/2J小鼠的肝脏中DNA低甲基化程度更为显著，在饮食18周后，菌株之间的差异显著(). 有趣的是，DBA/2J小鼠肝脏中更明显的DNA甲基化损失不能用肝脏甲基供体代谢的差异来解释(). 与年龄匹配的C57BL/6J小鼠相比，对照DBA/2J小鼠肝脏中的蛋氨酸和SAM水平更高，证明了这一点()和DBA/2J小鼠相比，甲基缺乏C57BL/6J小鼠的肝脏中SAH（一种所有细胞甲基化反应的有效抑制剂）的积累更大(). 此外，我们还测定了甲基缺陷对富含GC的DNA结构域胞嘧啶甲基化程度的影响。为此，在缺乏18周后，用AscI、BssHII或NarI甲基化离子敏感限制性内切酶消化对照和甲基缺乏小鼠的DNA，其识别序列主要出现在GC-rich区域。与整体DNA低甲基化类似，喂食MDD导致GC-rich结构域的胞嘧啶甲基化大量丢失，尤其是在DBA/2J小鼠的肝脏中(补充图1).
喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中的总DNA甲基化水平对照组小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）的肝脏中的DNA甲基化状态通过以下方法进行评估：[三H] 用甲基化敏感限制性内切酶HpaII消化基因组DNA后进行的dCTP延伸试验，当两条链上的内胞嘧啶残基未甲基化时，该酶会裂解CCGG序列。范围[三H] dCTP掺入量与非甲基化CpG位点的数量成正比。数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著。
喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中的蛋氨酸（A）、SAM（B）、SAH（C）和SAM/SAH比率（D）水平数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著；c（c）-与对照C57BL/6J小鼠显著不同。
3.4. MDD对重复DNA元件甲基化程度的影响
正常细胞中DNA甲基化的主要功能之一是通过沉默重复的DNA元素来保护基因组[19]，并且总体DNA低甲基化通常反映了这些重复序列中甲基化水平的降低[20]. 有鉴于此，我们测量了构成小鼠基因组大部分的主要和次要卫星、LINE1、SINE和IAP元件的甲基化状态。显示了甲基缺乏18周后，两种小鼠品系的肝脏中的主要和次要卫星、LINE1、SINE和IAP元素的胞嘧啶甲基化大量丢失。更重要的是，与C57BL/6J小鼠相比，喂食MDD导致DBA/2J小鼠中所有分析重复元素的胞嘧啶甲基化损失更大，尤其是主要和次要卫星。
喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中重复元素的DNA甲基化水平按照“材料和方法”中的详细说明，使用甲基化敏感McrBC-qPCR分析评估了对照小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）肝脏中主要和次要卫星、IAP、LINE和SINE元素的DNA甲基化状态。McrBC是一种甲基化特异性核酸内切酶，与甲基化敏感的限制性内切酶相反，它可以裂解单链或双链上含有5-甲基肌氨酸残基的DNA，但不会作用于非甲基化DNA。因此，PCR产物回收率更高，C值更低t吨用McrBC对DNA进行预处理后，该值表示低甲基化。数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。一–与同一时间点的对照组明显不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著；c（c）-与对照C57BL/6J小鼠显著不同。
3.5. MDD对重复相关转录物表达的影响
由于重复元件的胞嘧啶甲基化缺失可能与重复相关转录物的表达增加有关[21,22]，我们测定了喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏中主要、次要、LINE-、SINE-和IAP-转录物的水平。喂食MDD的C57BL/6J小鼠肝脏中所有分析重复元素的表达在18周内没有变化（数据未显示）；同样，在喂食MDD的DBA/2J小鼠的肝脏中，LINE、SINE和IAP元素的表达在18周期间没有变化（数据未显示）。相比之下，喂食MDD的DBA/2J小鼠肝脏中主要相关转录物，尤其是次要相关转录物的水平在暴露18周后增加(). 有趣的是，当时喂食MDD的DBA/2J小鼠肝脏中的小分子相关转录物水平是甲基缺乏C57BL/6J小鼠肝脏的3.1倍。
主要和次要相关转录物的表达Cpt1a型喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏中的基因主要和次要相关转录物的表达水平以及Cpt1a型用qRT-PCR检测基因。结果显示为主要和次要相关转录物的折叠变化Cpt1a型在正常化后的同一时间点，喂食甲基缺乏饮食（黑条）的小鼠与对照小鼠（灰条）的肝脏中的基因Gapdh公司（平均值±S.D.，n=5）。一–在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著。
相反的趋势是观察到Cpt1a型C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏中的基因(). 喂食MDD导致Cpt1a型两种小鼠品系肝脏中的基因；然而Cpt1a型甲基缺陷DBA/2J小鼠肝脏中的表达是C57BL/6J小鼠的2.4倍。
3.6. MDD对组蛋白修饰的影响
我们以前的研究结果表明，给大鼠喂食MDD，除了DNA甲基化改变外，还与组蛋白修饰模式的深刻改变有关[18]. 鉴于此，我们研究了MDD对C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏中组蛋白macroH2A状态和组蛋白H3K9、H3H27、H4K20三甲基化程度的影响。在喂食MDD的C57BL/6J和DBA/2J小鼠的肝脏中，组蛋白macroH2A水平显著增加，尤其是在DBA/2J小鼠的肝脏，喂食12周和18周后，菌株之间的差异显著(). 在这些时候，DBA/2J小鼠肝脏中的组蛋白macroH2A水平分别是年龄匹配的对照小鼠的2.2倍和3.1倍，以及甲基缺陷C57BL/6J小鼠的1.3倍和1.5倍。喂食MDD导致C57BL/6J和DBA/2J小鼠肝脏中组蛋白H3K9me3水平升高()，不影响C57BL/6J小鼠肝脏中H3K27的三甲基化状态，但引起DBA/2J小鼠肝脏中H3K27三甲基化的轻微损失()，并导致两种小鼠株中H4K20me3的显著类似损失().
喂食甲基缺乏食物18周的C57BL/6J和DBA/2J小鼠和年龄匹配的对照小鼠肝脏组蛋白修饰的Western blot分析从对照小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）的肝脏中分离出总组蛋白的酸提取物，通过SDS-PAGE分离，并使用针对组蛋白macroH2A和H3K9me3、H3K27me3和组蛋白H4K20me3的特定抗体进行免疫印迹。化学荧光检测用ECF底物进行Western印迹（GE Healthcare Biosciences，Piscataway，NJ），并通过Storm Imaging System（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）直接测量。用ImageQuant软件（分子动力学）分析信号强度。在两个独立的实验中重现了这些结果。（A）组蛋白macroH2A水平；（B）H3K9me3水平；（C）H3K27me3水平；（D）H4K20me3液位。
数据表示为同一时间点相对于对照的平均值±S.D.（n=5）。
一-在同一时间点与控制显著不同；b条-与在同一时间点喂食甲基缺乏饮食的C57BL/6J小鼠相比，差异显著；c（c）-与对照C57BL/6J小鼠显著不同。
3.7. MDD对DNA和组蛋白赖氨酸甲基化相关蛋白表达的影响
甲基缺陷小鼠肝脏中观察到的DNA和组蛋白赖氨酸甲基化水平的变化促使我们研究负责这些表观遗传修饰的蛋白质的表达。结果表明，给C57BL/6J和DBA/2J小鼠喂食MDD后，两种小鼠品系的肝脏中DNMT1蛋白水平显著降低，DNMT1是精确维持体细胞DNA甲基化模式所需的主要DNA甲基转移酶。有趣的是从头开始DNA甲基转移酶DNMT3A在C57BL/6J甲基缺陷小鼠的肝脏中显著增加，但在DBA/2J小鼠中没有增加。喂食MDD不会影响两个品系小鼠中甲基-CpG-结合蛋白MeCP2和KMT Suv39h1的表达，但会导致DBA/2J小鼠肝脏中Suv4-20h2蛋白的水平略有下降(). 更重要的是，MDD饮食诱导RIZ1显著降低，RIZ1是甲基缺乏性肝癌发生的关键靶点[23].
喂食甲基缺乏饮食18周的C57BL/6J DBA/2J和年龄匹配的对照小鼠肝脏中负责DNA和组蛋白赖氨酸甲基化的蛋白质的蛋白质印迹分析通过SDS-PAGE分离来自对照小鼠（灰条）和喂食甲基缺乏饮食的小鼠（黑条）肝脏的肝组织裂解物，并使用针对DNMT1、DNMT3A、甲基-CpG-结合蛋白MeCP2和KMTs Suv39h1、Suv4-20h2和RIZ1的特异性抗体进行Western免疫印迹。通过对β-肌动蛋白的免疫染色证实了样品装载量相等。在两个独立的实验中重现了这些结果。显示了典型的Western免疫印迹图像。按照中所述对图像进行分析图例。数据表示为与年龄匹配的对照小鼠相关的平均值±S.D.（n=5）。每个时间点的控制值被视为100%。
一。与同一时间点的控件显著不同。
4.讨论
本研究结果表明，喂食C57BL/6J和DBA/2J小鼠18周MDD后，肝脏的形态学变化逐渐累积，类似于人类NASH(,). 这些病理形态学变化伴随着表观遗传学机制的显著失调，表现为基因组和重复序列甲基化的丧失、异常的组蛋白修饰以及负责DNA和组蛋白赖氨酸甲基化的蛋白质表达的改变。更重要的是，与C57BL/6J小鼠相比，DBA/2J小鼠的肝脏中由甲基缺乏引起的病理和表观遗传变化更为显著；然而，它们与肝脏蛋氨酸代谢的粒间差异无关().
本研究表明，对C57BL/6J和DBA/2J小鼠施用MDD会导致基因组和重复元件的显著去甲基化(和)伴随着维持性DNMT1和KMT RIZ1表达减少()组蛋白H3K27和H4K20三甲基化的丢失(). 这可能通过异染色质重组损害基因组的完整性。具体来说，低水平的DNA甲基化，结合高含量的组蛋白macroH2A，以及已知的组成性异染色质标记H3K9和H4K20三甲基化水平的降低，与染色质构型的显著改变有关[24,25]. 我们检测到喂食低甲基饮食的两种小鼠的肝脏出现了类似的变化，DBA/2J小鼠的变化幅度更大。与甲基缺陷C57BL/6J小鼠相比，甲基缺陷DBA2J小鼠的基因组DNA，尤其是肝脏中的重复元素去甲基化程度更高，可能的解释之一是DNMT表达的差异。喂食MDD的两种小鼠菌株的特征是DNMT1表达显著降低；然而从头开始甲基转移酶DNMT3A仅在C57BL/6J小鼠的肝脏中增加(). 已经证明，DNMT1和DNMT3a之间的协同作用是维持重复元素甲基化的绝对必要条件，而DNMT1本身并不能维持重复元素的甲基化[26]. DBA/2J小鼠肝脏中重复序列，特别是着丝粒小卫星和着丝粒周围大卫星的低甲基化可能导致着丝粒异常和染色体分离缺陷。事实上，最近的研究表明，DNA低甲基化会在着丝粒处引起允许的转录活性[21]以及随后积累的小白鼠次要卫星转录本损害着丝粒结构和功能[27]. 有趣的是Cpt1a型，编码CPT1的肝脏亚型，CPT1是一种对肝脏中β-氧化正常功能至关重要的酶，位于小鼠19号染色体的着丝粒区域[28]和人类11号染色体[29]. 与严重去甲基化相关的微小卫星转录物的深度积累可能导致着丝粒缺陷，并损害位于该染色体区域的基因的功能。下调Cpt1a型当前检测到的基因表达()和以前的研究[7]支持这一建议。如上所述，LCFA的β-氧化受损是小鼠肝脂肪变性和人类NASH发病的主要机制之一[1,6,7,30].
由甲基缺乏饮食诱导的人类NASH和小鼠肝脂肪变性模型的最重要特征之一是肝脏中的脂质积聚[1,7,30,31]. 人类NASH和小鼠肝脂肪变性中脂质积聚的几种机制，包括长链脂肪酸（LCFA）摄取增加从头开始已提出肝脏LCFA和甘油三酯的合成，极低密度脂蛋白颗粒的合成和分泌减少，线粒体β-氧化减少[1,6,30]. 有研究表明，在小鼠甲基缺乏模型中诱导肝脂肪变性的主要致病机制是LCFA的β-氧化受损[6,7]. 然而，缺乏甲基的饮食导致肝脂肪变性的确切机制以及不同组间易感性差异的机制尚不清楚[7].
这些发现有力地表明，表观遗传失调是喂食甲基缺乏饮食的小鼠肝脏脂肪变性的突出基本特征。更重要的是，我们的研究结果表明，细胞表观遗传状态的差异可能是人类个体对NASH发展敏感性的预先决定因素。这对确定NASH易感亚群具有重要意义，并且考虑到表观遗传改变的潜在可逆性，为NASH的预防开辟了新途径。
缩略语清单
| 美国国立卫生研究院 | 非酒精性脂肪性肝炎 |
| MDD公司 | 甲基缺乏饮食 |
| 挪威船级社 | DNA甲基转移酶 |
| 国民党 | 组蛋白赖氨酸甲基转移酶 |
| 山姆 | S-腺苷-L-甲硫氨酸 |
| SAH公司 | S-腺苷-L-高半胱氨酸 |
| H3K9型 | H3赖氨酸9 |
| H3K27型 | 组蛋白H3赖氨酸27 |
| H4K20型 | 组蛋白H4赖氨酸20 |
| 定量RT-PCR | 定量实时PCR |
| IAP公司 | 胸骨内A粒子 |
| 线路 | 长散布元素 |
| 正弦 | 短穿插元素 |
| 方差分析 | 方差分析 |
| 低碳脂肪酸 | 长链脂肪酸 |
| Cpt1号机组 | 肉碱棕榈酰转移酶1 |
| Gapdh公司 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 |
脚注
财务披露：无
注：本文所表达的观点并不一定代表美国食品药品监督管理局的观点。
工具书类
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