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肝病学。作者手稿；PMC 2010年5月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
肝病学。2009年5月；49(5): 1683–1694.
数字对象标识：10.1002/庚22813
PMCID公司：项目经理2772879
尼姆斯：NIHMS141526标准
PMID：19205035

不变自然杀伤T细胞在四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化中的多种作用

奥吉公园,1 Won-IL Jeong公司,1 王磊（Lei Wang）,1 王华（Hua Wang）,1 哲雄连,2 埃里克·格什温,2和Bin Gao公司1
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

肝纤维化是对所有形式的慢性肝损伤的常见瘢痕反应，通常与导致纤维化的炎症有关。虽然炎症期间有多种细胞浸润肝脏，但一般来说，CD8 T淋巴细胞促进而自然杀伤（NK）细胞抑制肝纤维化。然而，肝脏中大量存在的不变NKT（iNKT）细胞在肝纤维化形成中的作用仍不清楚。这里我们显示iNKT缺陷小鼠更容易受到四氯化碳（CCl）的影响4)-诱发急性肝损伤和炎症。在该模型中，天然活化的iNKT的保护作用可能是通过抑制活化的肝星状细胞的促炎作用来介导的。有趣的是，通过注射iNKT激活剂α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）来强烈激活iNKT可以加速CCl4-诱导急性肝损伤和肝纤维化。相反，慢性CCl4给药后，iNKT缺乏小鼠和野生型小鼠的肝损伤程度相似，且iNKT-缺乏小鼠的肝纤维化程度仅略高于CCl后2周但不是4周的野生型小鼠4注射虽然iNKT细胞能够杀死激活的停滞细胞。iNKT在慢性肝损伤和纤维化中的作用不显著，可能是由于肝iNKT细胞耗竭所致。最后，慢性α-GalCer治疗对肝损伤和纤维化几乎没有影响，这是由于α-GalCer注射后iNKT耐受所致。

结论

肝iNKT细胞的自然激活抑制了iNKT细胞的活性，而α-GalCer对iNKT-细胞的强烈激活加速了CCl4-诱导急性肝损伤、炎症和纤维化。在慢性肝损伤期间，肝iNKT细胞耗竭，在纤维化早期而非晚期发挥抑制肝纤维化的作用。

关键词：不变NKT、肝纤维化、炎症、细胞因子

介绍

在世界范围内，饮酒、肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝炎是慢性肝脏炎症和损伤的三大原因，导致肝纤维化、肝硬化和肝癌。肝纤维化的特征是细胞外基质蛋白的积累，这些蛋白主要由活化的肝星状细胞（HSC）产生。1-5越来越多的证据表明，HSC与炎症细胞的相互作用在肝纤维化中起着重要作用，而炎症细胞总是与肝纤维化有关。1-5最值得注意的是，CD8 T细胞已被证明通过激活HSC促进肝纤维化6而自然杀伤（NK）细胞通过杀死活化的HSC抑制肝纤维化。7-10然而，肝脏中丰富的不变NKT（iNKT）细胞在肝纤维化形成中的作用尚不清楚。

NKT细胞是一种异质性T淋巴细胞群体，表达NK细胞和T细胞受体（TCR）标记。11,12这些细胞通过非经典MHC I类分子CD1识别内源性脂质抗原异球三糖神经酰胺（iGb3）和外源性脂质抗原，如α-半乳糖神经酰胺。11,12CD1依赖性NKT细胞可大致分为I型和II型NKT细胞。I型NKT细胞，也称为“经典”NKT、iNKT和Vα14NKT，表达由Vα14和Jα18与一组Vβ链配对编码的半不变αβTCR。I型iNKT细胞占NKT总细胞的90%至95%，识别α-GalCer，在Jα18中均未检测到-/-（iNKT缺乏）或CD1d-/-老鼠。11,12II型NKT细胞，也称为“非经典”NKT淋巴细胞，表达多种TCR并识别硫苷，但不识别α-GalCer。Ⅱ型NKT细胞占NKT总细胞的比例不到5%，CD1d中未检测到-/-小鼠，但在Jα18中可以检测到-/-老鼠。11,12

iNKT细胞中富含肝淋巴细胞。13-17例如，小鼠肝淋巴细胞含有约30%至40%的NKT细胞，而外周血淋巴细胞含有不到5%的NKT细胞。13,14伴刀豆球蛋白A或α-GalCer激活iNKT细胞诱导急性肝炎，17-19提示iNKT细胞活化有助于急性肝损伤。越来越多的证据表明，iNKT细胞也参与了各种肝脏疾病的发病机制，16包括病毒性肝炎，20,21酒精性肝损伤，22原发性胆汁性肝硬化，23,24胆管结扎引起的肝损伤，25药物性肝损伤。26,27然而，对iNKT细胞在慢性肝脏炎症和纤维化中的作用仍知之甚少。28在这项研究中，我们广泛研究了iNKT细胞在四氯化碳（CCl）诱导的肝脏炎症、损伤和纤维化中的作用4). 我们的研究结果表明，内源性脂质抗原对iNKT细胞的自然激活起到保护作用，而外源性脂质抗原α-GalCer对iNK细胞的强烈激活在CCl中起到有害作用4-诱导急性肝损伤、炎症和纤维化。此外，慢性服用CCl4消耗肝脏iNKT并在Jα18中诱导更高级别的肝纤维化-/-（iNKT缺乏）小鼠比野生型小鼠在给药后2周，但在注射后4周肝纤维化程度相似。有趣的是，α-GalCer反复治疗对CCl几乎没有影响4-诱导慢性肝损伤和纤维化，这可能是由于iNKT耐受所致。

材料和方法

老鼠

iNKT缺乏（Jα18-/-)Rachel Caspi博士（NEI，NIH）经Taniguchi博士（日本RIKEN过敏症和免疫学研究中心）许可，提供C57BL6背景的小鼠。缺乏Jα18基因片段的小鼠缺乏Vα14 iNKT细胞，但其他淋巴细胞系完整。29干扰素-γ（IFN-γ）缺乏小鼠-/-)C57BL6背景从杰克逊实验室（马里兰州巴尔港）购买。STAT1缺陷小鼠（STAT1-/-)在C57BL6背景下，已经在前面进行了描述。30本研究中使用了所有雄性小鼠，并将其安置在特定的无病设施中，按照NIH指南和NIAAA动物护理和使用委员会的批准进行护理。

CCl致肝损伤4

用于CCl引起的急性肝损伤4，小鼠注射IP单剂量CCl4（10%橄榄油，2 mL/kg）。对于慢性肝损伤，给小鼠IP注射CCl4（10%橄榄油，2 mL/kg，每周3次）2或4周。对照组用溶媒（2 mL/kg橄榄油）治疗。小鼠处死后，将肝组织冷冻在液氮中或固定在10%的福尔马林缓冲液中，并包埋在石蜡中。野生型和Jα18无死亡-/-急性或慢性CCl4治疗后的小鼠。

α-GalCer注入

将α-GalCer储备溶液（Alexis生化公司，加利福尼亚州圣地亚哥）在0.5%聚山梨酯-20中稀释至0.2 mg/mL，并储存在−20°C下。在CCl前3 h通过IP注射急性给予小鼠α-GalCer（每只小鼠PBS中2μg/200μL）4管理。通过每周注射一次或两次IP进行α-GalCer的慢性给药（每只小鼠PBS中2μg/200μL）。CCl治疗的小鼠没有死亡4+α-GalCer。

其他方法

支持材料中描述了以下方法。组织学和免疫组织化学、TUNEL分析、Western blotting、实时聚合酶链反应（PCR）、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和血清细胞因子的测定、HSC和Kupffer细胞的分离和体外培养、小鼠肝淋巴细胞、肝NKT细胞的分离以及流式细胞术分析，肝淋巴细胞和NKT细胞对HSC的细胞毒性。

统计分析

数据表示为平均值±SD。为了比较从三个或更多组获得的值，使用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey的事后检验。为了比较从两组中获得的值，学生t吨进行了测试。统计显著性在P（P）<0.05级。

结果

iNKT缺乏（Jα18-/-)小鼠更容易受到CCl诱导的急性肝损伤和炎症的影响4

CCl后4治疗后，肝脏中的单核细胞总数增加，给药后12h达到峰值。在Jα18中也观察到类似的增加-/-老鼠(图1A). FACS分析图1B显示CCl4治疗显著降低肝淋巴细胞中NKT细胞的百分比。CCl后12 h NKT细胞总数略有增加，24 h显著减少4处理(图1C). 车辆注射只导致NKT细胞轻微减少(图1B). 正如预期的那样，Jα18中NKT细胞的数量非常少-/-小鼠肝脏(图1C).

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Jα18-/-小鼠对CCl更敏感4-诱发急性肝损伤

Jα18-/-用CCl治疗野生型小鼠4流式细胞仪检测肝淋巴细胞。A。每克肝脏中的单核细胞总数（MNC）。B。用CD3和NK1.1抗体或α-GalCer/CD1d四聚体对肝脏NK和NKT细胞进行FACS分析。C、。NK细胞总数（NK1.1+CD3（CD3）-)、NKT细胞（NK1.1+CD3（CD3）+)，或（CD3+CD1d/α-GalCer+).D。用抗NK1.1和抗CD3抗体以及膜联蛋白V分析肝淋巴细胞以确定NKT细胞凋亡。E.公司。来自载体或CCl的肝淋巴细胞4-使用NK1.1、CD3和CD69抗体，通过FACS分析12 h时点处理过的小鼠。显示了NKT细胞上CD69表达的密度。F、。血清ALT水平。G公司.TUNEL数量+CCl后肝脏中的肝细胞4注入。每组6至10只小鼠的数值显示为平均值±SD**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.

确定CCl后肝NKT细胞是否下调4治疗是由于NKT细胞死亡或NKT标记物丢失，对iNKT凋亡进行检测。如所示图1D，肝iNKT细胞凋亡在注射载体或CCl4后增加，但在CCl中更高4组比车辆组。此外，CCl后12 h肝NKT细胞上活化标记CD69的表达增加4与车辆组相比的治疗(图1E)表明肝NKT细胞在CCl后被激活4治疗。

如所示图1F，血清ALT水平在Jα18中明显升高-/-CCl后12小时小鼠比野生型小鼠4TUNEL分析显示Jα18中凋亡肝细胞的数量更多-/-CCl后12小时小鼠比野生型小鼠4给药，但在24小时时这两组之间没有观察到差异(图1G和补充图1).

检测急性CCl后的肝脏炎症4注射后，我们通过FACS分析Gr-1的表达来测量中性粒细胞和单核细胞对肝脏的浸润。据报道，Gr-1高的细胞主要代表中性粒细胞，而Gr-1中间的细胞代表单核细胞和嗜酸性粒细胞。31如所示图2A-B，Gr-1渗透高的CCl后中性粒细胞增加4治疗组Jα18水平较高-/-小鼠在注射后12小时比野生型小鼠高，但在注射后24小时与野生型小鼠相当。CCl公司4处理还诱导了Gr-1的渗透整数单核细胞，但Jα18的这种浸润较低-/-注射后12h小鼠与野生型小鼠比较。此外，免疫组织化学染色证实中性粒细胞（MPO）+细胞）CCl后浸润4治疗，在Jα18中显著升高-/-小鼠比野生型小鼠(图2C和补充图2A). 此外，CCl可诱导肝脏CCR2和CD68（单核细胞/巨噬细胞标记物）的表达4但这种诱导在Jα18中不太明显-/-小鼠比野生型小鼠(图2D)，这与图2A表明Gr-1的数量整数Jα18中单核细胞较低-/-小鼠比野生型小鼠多。

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Jα18-/-小鼠对CCl更敏感4-诱发急性肝炎症

Jα18-/-用CCl治疗野生型小鼠4持续12小时和24小时。A。肝淋巴细胞用抗Gr-1抗体进行FACS分析。B。Gr-1总数高的细胞（中性粒细胞）和Gr-1整数计算面板A中的细胞（单核细胞）。C、。MPO数量+CCl后肝脏中的细胞4注入。D。肝脏CCR2和CD68（单核细胞/巨噬细胞标记物）表达的实时PCR分析。电子肝细胞因子基因表达的实时PCR分析。F、。血清细胞因子水平。每组6至10只小鼠的数值显示为平均值±SD*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）与相应的野生型组相比，<0.001。

此外，CCl4治疗后血清和肝脏TNF-α和MCP-1升高，Jα18的升高更高-/-小鼠比野生型小鼠(图2E-F). 此外，CCl4Jα18对血清和肝脏IL-6水平的介导诱导作用具有可比性-/-和野生型小鼠(补充图3). CCl后肝脏IL-4、IL-10和IL-13水平保持不变4治疗，并且在Jα18之间具有可比性-/-和野生型小鼠(补充图3).

CCl公司4野生型和Jα18之间的代谢具有可比性-/-老鼠

自p450 CYP2E1介导的CCl4代谢在CCl中起关键作用4-诱导肝损伤，我们想知道Jα18是否加速了肝损伤-/-小鼠是由于CCl的改变4这些小鼠的新陈代谢。CYP2E1在野生型和Jα18的肝脏中的表达具有可比性-/-老鼠(补充图4). CCl后4Western blot和免疫组织化学分析显示，CYP2E1在野生型小鼠中的表达显著降低(补充图4). 在Jα18中也观察到类似的下调-/-小鼠，表明CCl4野生型和Jα18的代谢相似-/-老鼠(补充图4).

来自CCl的肝星状细胞（HSC）4-处理过的Jα18-/-小鼠产生的促炎细胞因子水平高于野生型小鼠

了解为什么Jα18中血清和肝脏细胞因子较高-/-CCl后小鼠比野生型小鼠4处理后，分离并培养这些小鼠的Kupffer细胞和HSC。如所示图3A-B来自CCI的HSC4-处理过的Jα18-/-与CCl小鼠相比，小鼠产生了更高水平的TNF-α、IL-6和MCP-1，并且表达了更高的α-SMA和Timp-1，但不表达TGF-β4-经处理的野生型小鼠。来自CCl的Kupffer细胞4-处理过的Jα18-/-小鼠产生的TNF-α、IL-6和MCP-1水平也高于CCl小鼠4-治疗野生型小鼠(图3C). 有趣的是，Jα18中Kupffer细胞产生TNF-α和IL-6的基础水平较高-/-小鼠与野生型小鼠的比较(图3C). 相反，HSC或Kupffer细胞产生的IL-12、IFN-γ和IL-10在Jα18之间具有可比性-/-和野生型小鼠（数据未显示）。

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来自CCl的肝星状细胞（HSC）4-经处理的Jα18-/-小鼠产生更多细胞因子，NKT细胞通过NKG2D依赖机制杀死早期激活的HSC

从野生型和Jα18中分离出HSC和Kupffer细胞-/-CCl治疗小鼠4或载体（橄榄油）培养12小时在体外持续12小时。A类、培养HSC上清液中的细胞因子水平。B。培养HSC中α-SMA、Timp-1和TGF-βmRNA的表达。C、。培养Kupffer细胞上清液中的细胞因子水平。D。来自野生型和Jα18的肝淋巴细胞-/-小鼠与新鲜分离的HSC（D0-HSCs）或4天培养的HSCs（D4-HSC）孵育4小时。测定HSC细胞死亡。E.公司。从PBS或α-GalCer处理3 h的小鼠中分离出肝淋巴细胞。测定了对D4-HSCs的细胞毒性。F、。纯化的肝NKT细胞与D0-或D4-HSCs在IgG对照或抗NKG2D抗体存在下孵育4 h。测定HSCs的细胞死亡。面板中的值表示3个独立实验的平均值±SD*P（P）<0.05, **P（P）<0.01,***P（P）<0.001.

发现Jα18中HSC产生较高水平的细胞因子-/-CCl后的小鼠4治疗表明iNKT细胞可能抑制HSC激活。以前的研究表明，NK细胞能够杀死HSC。7-9这让我们测试了NKT细胞也可能杀死HSC的假设。如所示图3D，D0-HSCs对肝淋巴细胞的细胞毒性具有抵抗力（观察到的细胞毒性小于1%），而D4-HSCs则对此类杀伤敏感。野生型小鼠的肝淋巴细胞对D4-HSCs的细胞毒性为10%，而Jα18的相应肝淋巴细胞仅为5%-/-缺乏iNKT细胞的小鼠，表明NKT细胞在杀死活化的HSC（D4 HSC）中发挥重要作用。急性α-GalCer治疗后，肝淋巴细胞对D4-HSCs的细胞毒性增强(图3E). 此外，纯化的肝NKT细胞能够杀死D4-HSCs，经抗NKG2D抗体治疗后，D4-HSC显著减弱(图3F).

单剂量α-GalCer激活iNKT细胞协同增强CCl4-诱导的急性肝损伤和纤维化：依赖于IFN-γ/STAT1

据报道，α-GalCer（一种iNKT激活剂）激活iNKT细胞会导致轻度肝损伤。19在这里，我们研究了α-GalCer对CCl的影响4-诱导性肝损伤。如所示图4A在12小时时，用α-GalCer或CCl治疗4单独使用α-GalCer和CCl联合治疗时，血清ALT水平轻度升高，分别达到200 IU/L和1200 IU/L4协同升高血清ALT水平至6000 IU/L。在Jα18中未观察到这种协同效应-/-老鼠。24小时时，α-GalCer治疗并未进一步增强CCl4-诱导野生型和Jα18血清ALT水平升高-/-老鼠。此外，α-GalCer预处理显著增强CCl后72小时的肝纤维化4注射，如增强肝脏中α-SMA免疫染色和mRNA所示(图4B).

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α-GalCer激活iNKT加速CCl4-IFN-γ/STAT1依赖性诱导急性肝损伤

A。野生型和Jα18-/-用CCl处理小鼠4和/或α-GalCer治疗12 h和24 h。测量血清ALT水平。B。用CCl治疗C57BL6小鼠4收集肝组织并用抗α-SMA抗体染色，或用α-SMA引物进行实时PCR分析。α-SMA+面积被量化。C、。CCl后12小时血清细胞因子水平4和/或α-GalCer处理。D。用CCl治疗野生型和敲除型小鼠4测定血清ALT水平。E、 F、。野生型和IFN-γ-/-用CCl处理小鼠4或CCl4加α-GalCer 12 h。收集血清进行细胞因子测量（面板E）。收集肝组织，通过TUNEL分析测定肝细胞凋亡（图F）。数值代表平均值±SD（n=5-10只小鼠/每组）*P（P）<0.01, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.

了解CClα-GalCer加速的机制4-测定急性肝损伤后血清细胞因子水平。α-GalCer治疗升高了多种血清细胞因子，包括TNF-α、MCP-1、IFN-γ和IL-6(图4C). CCl注入4TNF-α、MCP-1和IL-6自身升高。CCl共处理4α-GalCer协同诱导TNF-α升高，但不诱导其他细胞因子升高。由于α-GalCer注射诱导了高水平的血清IFN-γ，我们想知道IFN-γ及其下游信号STAT1是否有助于α-GalCer加速CCl4-诱导性肝损伤。如所示图4D、CCl4在野生型IFN-γ中，治疗导致了类似程度的肝损伤-/-和STAT1-/-老鼠。α-GalCer处理协同增强CCl4-在野生型小鼠中介导的肝损伤，但在IFN-γ中不介导-/-和STAT1-/-老鼠。α-GalCer单独注射在野生型小鼠中诱导轻度肝损伤（ALT达到300 IU/L），但在IFN-γ中未诱导肝损伤-/-和STAT1-/-小鼠（数据未显示）。此外，IFN-γ中α-GalCer对TNF-α、MCP-1的诱导作用减弱，但对IL-6的诱导作用不明显-/-老鼠(图4E). 最后，α-GalCer治疗显著增加CCl中肝细胞凋亡的数量4-经治疗的小鼠，IFN-γ部分减少-/-老鼠(图4F).

慢性CCl4治疗导致肝iNKT细胞耗竭

上述数据表明，CCl的急性治疗4导致肝脏iNKT耗竭。接下来我们检查了慢性CCl的影响4肝NKT细胞治疗。如所示图5A，正常C57BL6小鼠肝脏含有约37%NK1.1+CD3（CD3）+和32%CD3+CD1d/αGalCer+细胞。在2周或4周CCl的肝脏中4-治疗小鼠的NKT百分比（NK1.1+CD3（CD3）+或CD3+CD1d/αGalCer+)细胞数量显著减少。有趣的是，载体注射也略微降低了NKT细胞的百分比，但在注射后2周增加了NKT细胞的总数(图5A-B). CCl后2周和4周，肝脏中的NKT细胞总数显著减少4注入(图5B). 相反，车辆和CCl4两者都增加了NK细胞总数(图5B).图5C显示凋亡的肝NKT细胞百分比在2周或4周CCl后显著增加4-治疗小鼠，表明NKT耗竭是由于慢性CCl后的细胞凋亡4治疗。最后，图5D表明NKT的百分比（NK1.1+CD3（CD3）+)慢性CCl后脾脏中的含量略有增加4治疗。

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慢性CCl4治疗导致肝iNKT细胞耗竭

A、 B。用CCl治疗C57BL/6小鼠4或车辆最多4周，然后在最后一次注射后24小时杀死。用流式细胞仪分析肝淋巴细胞。NK细胞总数（NK1.1+CD3（CD3）-)和NKT细胞（NK1.1+CD3（CD3）+或CD3+CD1d/α-GalCer+)被计算在内。C、。用抗NK1.1、抗CD3抗体和Annexin V分析肝淋巴细胞，以确定NKT细胞凋亡。D。从小组小鼠中分离脾细胞A类并通过FACS进行分析。数值代表平均值±SD（n=5-8）***P（P）与相应的车辆治疗组相比<0.001。

iNKT细胞在慢性CCl诱导的肝纤维化早期而非晚期发挥抑制肝纤维化的作用4治疗

iNKT细胞在CCl中的作用4-在野生型和Jα18中检测诱导的慢性肝损伤和纤维化-/-老鼠。如所示图6A，血清ALT水平在Jα18中相似-/-CCl后2周和4周的野生型小鼠4注入。图6B表明慢性CCl4注射诱导Jα18胶原沉积（天狼星红染色）和HSC活化（α-SMA染色）水平略高-/-注射2周后，小鼠比野生型小鼠肝纤维化程度相似。CCI后，这两组患者的血清TNF-α、MCP-1和IL-6水平以及肝脏TNF-β、MCP-2、IL-6、IL-12和CCR2水平均升高4治疗（数据未显示）。

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慢性CCl4治疗导致Jα18肝纤维化程度更高-/-注射后2周，而不是4周，小鼠比野生型小鼠

Jα18-/-用CCl治疗野生型小鼠4持续2或4周，然后在最后一次注射后12小时或24小时杀死。A。测定血清ALT水平。B。最后一次注射后24小时收集肝组织，并用天狼星红或α-SMA抗体染色。定量天狼星红和α-SMA阳性染色面积。数值代表平均值±SD（n=10-12）*P（P）<0.05.

α-GalCer慢性治疗对CCl影响不大4-慢性肝损伤与肝纤维化

iNKT激活剂α-GalCer慢性治疗对CCl的影响4-诱导性肝损伤和纤维化如图所示图7令人惊讶的是，CCl治疗组的ALT、肝纤维化分级和血清细胞因子水平（即IL-6、MCP-1和TNF-α）具有可比性4单独或与CCl一起4加α-GalCer注入(图7A-D). 这些组的血清IL-4和IL-10水平低于检测限。Th2细胞因子（如IL-4、IL-10和IL-13）在CCl患者的肝脏表达具有可比性4和CCl4加α-GalCer群(补充图5). 单用慢性α-GalCer注射液对肝损伤和纤维化几乎没有影响（数据未显示）。

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反复注射α-GalCer对CCl影响不大4-诱导性肝纤维化

用CCl治疗C57BL6小鼠4加上α-GalCer（每周一次或两次）2或4周，然后在最后一次注射后24小时处死。A。血清ALT水平。B、 C、。肝组织用天狼星红染色，并量化阳性染色面积。D。血清细胞因子水平。数值代表平均值±SD（n=10-15）。

讨论

在本文中，我们广泛研究了iNKT细胞在急慢性肝损伤、炎症和纤维化中的作用。我们的研究结果表明：（a）iNKT细胞的自然激活抑制CCl4-诱导急性肝损伤，而外源性配体α-GalCer强烈激活iNKT加速CCl4-诱导急性肝损伤和肝纤维化；（b） 急性和慢性CCl4治疗导致肝iNKT细胞耗竭；（c） iNKT细胞在早期而非晚期起到抑制肝纤维化的作用；（d） 重复注射外源性iNKT配体α-GalCer对慢性CCl几乎没有影响4-诱导肝损伤和肝纤维化。我们将这些发现整合到一个模型中（总结于图8)描述了iNKT在CCl中的复杂作用4-诱发急慢性肝损伤、炎症和纤维化。

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iNKT细胞在CCl诱导的急慢性肝损伤、炎症和纤维化中的复杂作用4

急性注射CCl4诱导肝细胞坏死/凋亡。受损的肝细胞释放脂质抗原，HSC可通过CD1d将其递呈给iNKT细胞，导致iNKT细胞的自然活化。肝损伤也会诱导HSC活化。活化的HSC产生多种促炎细胞因子，包括TNF-α，参与肝脏炎症。天然活化的iNKT细胞可能通过抑制HSC活化或杀死HSC来减弱HSC的促炎作用。单次注射α-GalCer可通过IFN-γ/STAT1依赖机制诱导强烈的iNKT细胞活化并加速肝损伤、炎症和纤维化。慢性CCl治疗4导致肝脏iNKT细胞凋亡和耗竭。因此，iNKT细胞可能在早期起到抑制肝纤维化的作用，但在后期不起作用。反复α-GalCer治疗导致iNKT细胞无能，对慢性肝损伤和纤维化几乎没有影响。

iNKT细胞的自然激活抑制，而α-GalCer对iNKT细胞的强烈激活加速CCl4-诱导的急性肝损伤和炎症

尽管Jα18-/-小鼠对伴刀豆球蛋白A-和α-GalCer诱导的急性肝损伤和炎症具有抵抗力；17-19我们在这里显示了Jα18-/-小鼠对CCl更敏感4-与野生型小鼠相比，诱导肝损伤和炎症。这表明iNKT细胞的自然激活在CCl中起到抗炎作用4-诱导性肝损伤。相反，α-GalCer对iNKT的强烈激活显著加速CCl4-诱发急性肝损伤。CCl中自然激活iNKT和α-GalCer强激活iNK存在对立作用的原因4-诱导性肝损伤尚不完全清楚。我们推测CCl后iNKT的自然激活4治疗在肝脏中局部且微弱地发生，从而抑制炎症，而相比之下，α-GalCer介导的iNKT激活是全身性的且强烈的，从而刺激炎症反应。

如所示图1CCl后肝脏NKT细胞CD69的表达升高4这表明肝脏中的iNKT细胞在CCl期间被激活4-诱发急性肝损伤。此外，急性CCl后肝iNKT细胞数量减少4注射也间接表明iNKT细胞激活，因为iNKT细胞在激活后死亡（典型的激活诱导死亡）。32,33此外，CCl后血清IFN-γ（由活化的iNKT细胞产生的主要细胞因子）水平仅略有升高4注射（数据未显示），表明CCl后iNKT细胞激活4治疗可能在肝脏发生。此外，急性CCl后浸润的中性粒细胞数量显著增加4Jα18的治疗-/-小鼠比野生型小鼠多。总之，这些发现表明iNKT细胞被激活，在CCl4诱导的急性肝损伤中抑制中性粒细胞浸润发挥重要作用。有趣的是，最近在另一个胆汁淤积性肝损伤小鼠模型中也报道了iNKT细胞的抗中性粒细胞炎症反应。34然而，CCl后iNKT自然激活的机制4注射和有助于抗炎的效果尚不清楚。据报道，HSC是肝脏内的抗原呈递细胞，可以呈递脂质抗原以诱导iNKT细胞活化。35因此，肝iNKT激活可能是由HSC提供CCl后受损肝细胞释放的脂质抗原引起的4治疗。此外，我们提供的证据表明，CCl后天然激活iNKT的抗炎作用4注射至少部分是通过抑制HSC激活来介导的。首先，来自Jα18的HSC-/-CCl期间，小鼠比野生型小鼠产生更多的TNF-α和IL-64-诱导肝损伤，表明iNKT缺乏增加HSC的促炎作用。第二，在体外细胞毒性试验表明，iNKT细胞可以通过NKG2D依赖性机制直接杀伤早期激活的HSC，而不是静止的HSC。7第三，iNKT细胞可能通过产生IFN-γ来抑制HSC激活，一种细胞因子已被证明可以抑制HSC增殖和激活。30,36最后，活化的HSC被证明参与了肝脏炎症。4,37,38

与弱的天然iNKT细胞激活相比，注射α-GalCer可引起强的全身iNKT激活，包括IFN-γ在内的血清细胞因子显著升高就是证明(图4). 进一步研究表明，IFN-γ的升高有助于CCl的α-GalCer加速4-由于IFN-γ中的加速度被完全消除，导致急性肝损伤-/-老鼠。由于IFN-γ能够通过STAT1依赖机制诱导肝细胞凋亡，39因此，α-GalCer治疗后IFN-γ的产生可能会增加CCl期间肝细胞凋亡的敏感性4-诱导性肝损伤。事实上，α-GalCer加CCl组凋亡肝细胞的数量要多得多4与CCl治疗组相比4独自一人。

iNKT细胞耗竭，在CCl中起次要作用4-慢性肝损伤与炎症

尽管CCl4-Jα18加速了诱导的急性肝损伤-/-小鼠与野生型小鼠的比较4-这两组诱导的慢性肝损伤和炎症具有可比性，表明iNKT细胞在该模型中的慢性肝损害中起次要作用。这可能是因为慢性CCl期间肝iNKT细胞耗竭所致4治疗。CCl期间iNKT细胞耗竭的机制4-诱导性肝损伤仍不清楚。据报道，内质网应激降低肝细胞CD1d蛋白的表达，导致小鼠脂肪肝中NKT细胞的下调。40因此，CCl引起的内质网应激4注射也可能导致CCl期间肝NKT细胞耗竭4-诱导性肝损伤。此外，在伴刀豆球蛋白a、poly I:C、α-GalCer等诱导的各种肝损伤模型中也观察到肝NKT细胞的耗竭，17-19这可能是由激活诱导的NKT细胞死亡或NK1.1等细胞标记物丢失或这两种机制的组合引起的。32,33我们研究的三个证据表明CCl后肝iNKT细胞的耗竭4主要通过激活诱导的NKT细胞死亡介导。首先，急性和慢性CCl后，肝脏中中风NKT细胞的数量显著增加4治疗。其次，在使用NK.1.1/CD3标记和CD1四聚体标记的两种分析中都观察到NKT细胞的耗竭。第三，CCl后iNKT细胞标记物Vα14 mRNA的表达下调4治疗（数据未显示）。

iNKT细胞在肝纤维化中的多种作用

与NK细胞相比，NK细胞在抑制肝纤维化方面发挥着重要作用，7-10由于iNKT细胞的耗竭和耐受性，iNKT细胞在调节肝纤维化中的作用较小。如所示图5，慢性CCl4治疗导致肝iNKT细胞明显耗竭。因此慢性CCl4-治疗后的野生型小鼠与Jα18非常相似-/-两组小鼠肝脏iNKT细胞均被耗尽。这也可以解释为什么慢性CCl4治疗只导致Jα18肝纤维化程度稍大-/-虽然NKT细胞能够杀死HSC，但早期（2周治疗）小鼠比野生型小鼠要好，但晚期（4周治疗）则不行。与iNKT细胞耗竭相比，CCl后NK细胞总数没有减少，而是增加了4处理(图1C和​和5B）。第5页). 2周后，肝脏NK细胞对活化HSC的细胞毒性也增加4治疗（Jeong，Park，Gao.：未发表的数据）。这些发现表明，NK细胞可以补偿iNKT的耗竭，从而抑制慢性CCl期间的肝纤维化4治疗。

如前所述，NK细胞活化剂poly I:C的慢性治疗可显著抑制肝纤维化，7,9,41而iNKT激活剂α-GalCer的慢性治疗对慢性肝损伤和纤维化几乎没有影响(图7). 该模型中α-GalCer无反应的明显原因是CCl期间肝iNKT细胞缺乏4-诱发慢性肝损伤。另一种机制可能是由于α-GalCer刺激后iNKT细胞的长期无能和耐受性。42,43有趣的是，与α-GalCer相反，一种天然糖脂β-葡萄糖基神经酰胺已被证明通过调节NKT和CD8淋巴细胞分布来改善肝纤维化。44然而，目前尚不清楚反复β-葡萄糖神经酰胺治疗是否也会导致iNKT细胞无能。

α-GalCer激活iNKT细胞已被证明能快速诱导NK细胞活化，NK细胞产生IFN-γ，并增强NK细胞的抗肿瘤活性。45,46因此，除了直接杀死HSC和产生IFN-γ外，激活iNKT细胞可能通过激活NK细胞的抗纤维化作用抑制肝纤维化。然而，单剂量α-GalCer注射对iNKT细胞的激活并没有抑制，反而增强了CCl4-尽管这种注射提高了血清IFN-γ水平并增强了活化HSC的iNKT细胞杀伤，但仍诱导了急性肝纤维化(图3E). 由于单剂量α-GalCer显著增强CCl4-我们推测α-GalCer注射液可能通过产生IFN-γ和诱导iNKT细胞杀伤HSC来抑制肝纤维化，但也可能通过增加肝损伤来加速肝纤维化。通过增加肝损伤加速肝纤维化可能会超过α-GalCer对肝纤维化的抑制作用，从而导致单次α-GalCer注射对急性CCl诱导的肝纤维化的刺激作用4治疗。

总之，我们的发现表明iNKT细胞可能在CCl中发挥保护或有害作用4-诱导的急性肝损伤取决于iNKT细胞的激活程度。在慢性肝损伤期间，iNKT细胞耗竭，在抑制早期肝纤维化而非晚期肝纤维化中发挥作用。iNKT细胞在人类肝损伤和纤维化中的作用尚不清楚。de Lallat等人。47据报道，iNKT细胞在慢性感染的肝脏中增加，并产生IL-4和IL-13等纤维化前细胞因子，这表明iNKT细胞可能有助于慢性乙型肝炎病毒感染患者肝纤维化的进展。

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iNKT公司
不变NKT细胞
HSC公司
肝星状细胞
跨国公司
单核细胞
CCl公司4
四氯化碳
α-镀锌
α-半乳糖神经酰胺

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