在肝纤维化中，树突状细胞通过TNF-α控制小鼠的肝脏炎症

纤维化肝中肝非实质细胞的组成发生改变。

平均约1×10⁷从纤维化和正常小鼠肝脏中分离出非实质细胞（NPC）。然而，在纤维化动物中，NPC的细胞组成有很大不同。特别是CD11c⁺DC从正常小鼠中约5%的NPC的基线扩增到纤维化小鼠肝脏中的20%-27%（图​（图1C）。1C） ●●●●。此外，一个独特的CD11c^你好人群出现在正常肝脏罕见的纤维化肝脏中。DC总数从大约2–4×10增加⁵在正常肝脏中为1–3×10⁶在纤维化肝脏中（补充图3）。类似地，Gr1⁺CD11b型⁺骨髓细胞从正常肝脏的不到5%扩展到肝纤维化小鼠的30%（图​（图1C）。1C） ●●●●。此外，CD3⁺CD8（CD8）⁺在正常小鼠肝脏中，T细胞仅占NPC的3%–6%，但在患有纤维化的小鼠中增加到8%–14%。相反，肝脏CD3的百分比⁺CD4细胞⁺纤维化肝脏中的T细胞持续下降2倍以上（数据未显示），肝CD4亚组分也是如此⁺CD25型⁺Foxp公司⁺Tregs（补充图4）。然而，与改变的肝脏NPC组成相比，纤维化小鼠的脾细胞组成没有变化，脾DC群体没有扩大（补充图5），这表明其影响是肝脏特异性的。

纤维化肝中的DC具有明显的表型。

除了数量增加外，来自纤维化肝（FLDCs）的DC还表现出明显的表型，表明成熟度提高。CD11b型⁺CD8（CD8）^–髓系DC约高20%，B220⁺与正常肝DCs相比，FLDCs中浆细胞样DCs约低15%（NLDCs；图​图1D）。1D） 。然而，由于DC室的整体扩张，纤维化小鼠浆细胞样DC的绝对数量较高。我们没有观察到NK1.1的分数有任何变化⁺CD11c公司⁺单元格（未显示数据）。FLDC也比NLDC更成熟（图​（图1E）。1E） ●●●●。特别是，与抗原呈递密切相关的MHC II和CD40表达在FLDC中上调。培养24小时后，FLDC和NLDC之间MHC II表达水平的差异更加明显（图​（图1F）。1F） ●●●●。

FLDC产生升高的TNF-α和IL-6。

由于FLDC具有活化的表面表型，我们推测它们会产生较高水平的免疫调节细胞因子。培养24小时后，TAA/瘦素治疗小鼠的FLDCs与NLDCs相比，TNF-α和IL-6增加了2倍以上（图​（图2，2、A和B）。CCl中也出现了类似的效果₄模型（未显示数据）。TLR9与CpG结扎增强了FLDC和NLDC中TNF-α和IL-6的生成（图​（图2，2、A和B）。然而，令人惊讶的是，TLR3配体Poly（I:C）、TLR4配体LPS或TLR5配体Flagellin的刺激并没有增加TNF-α的生成（图​（图2A）2A） 或IL-6（数据未显示）。

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图2

DC控制肝纤维化的炎症环境。

(A类)新鲜分离的肝树突状细胞以1×10的浓度培养24小时⁶与对照组相比，FLDC产生的TNF-α升高超过2倍(P（P）< 0.05). TLR9结扎后TNF-α的生成进一步增加，但TLR3、TLR4或TLR5结扎后没有增加。(B类)同样，FLDC也会产生升高水平的IL-6(P（P）< 0.05). (C类–E类)从正常和纤维化小鼠的肝脏中获取NPC，以1×10的浓度培养24小时⁶FACS耗尽纤维化NPC浓缩物中的DC，消除其升高的细胞因子和趋化因子生成(P（P）每种炎症介质均<0.05）。(F类)按照上述方法培养来自未经处理的CD11c-DTR小鼠、纤维化CD11c-DTR小鼠或纤维化CD11c-DTR小鼠的新分离NPC，这些小鼠在处死前48小时DC耗尽。然后分析细胞培养上清液中的炎症介质。纤维化小鼠体内DC耗竭显著降低NPC细胞因子和趋化因子的产生(P（P）每种炎症介质均<0.05）。

DC是纤维化肝细胞因子环境的主要决定因素。

因为IL-6和TNF-α在肝纤维化中对肝白细胞具有多效性作用(10,11)，我们假设DC可能是纤维化肝脏炎症环境的中心决定因素。为了验证这一假设，从正常和纤维化肝脏中获取NPC，并在无外源刺激的情况下培养24小时，同时培养来自DC耗尽的纤维化肝脏的NPC。炎症介质在纤维炎性肝病中的重要作用(12)在条件培养基中进行定量。与正常NPC相比，来自纤维化肝的NPC在几种细胞因子和趋化因子中产生高达100倍的升高（图​（图2，2（C–E）。然而，纤维性鼻咽癌培养物中DC的缺失完全消除了可溶性炎症介质生成的增加（图​（图2，2（C–E）。虽然DC直接分泌TNF-α和IL-6可能是DC耗竭后这些细胞因子水平降低的部分原因，但考虑到单靠FLDCs并不会产生任何其他检测的细胞因子或趋化因子水平升高（无论是在从纤维化肝中收获后立即还是在NPC培养24小时后），这些数据表明，DC通过激活邻近细胞类型，间接解释了纤维化肝培养物中显著升高的炎症环境。

为了确定纤维化小鼠体内DC耗竭是否也会减少肝白细胞产生炎症介质，CD11c-DTR小鼠在体内DC耗损48小时后，使用TAA/瘦素使其纤维化。同样，DC耗竭显著减少了纤维化NPC升高的细胞因子和趋化因子的产生（图​（图2F）。2F） ●●●●。

FLDC是NK细胞细胞因子产生和细胞溶解的强大刺激物。

为了确定肝损伤后DC增强炎症环境的机制，我们研究了FLDCs与免疫效应细胞的相互作用。因为DC产生的TNF-α对先天免疫有强大的影响(13)我们推测FLDCs可能诱导NK细胞的细胞毒性和细胞因子的分泌。为了验证这一点，我们将FLDCs和NLDCs与正常脾NK细胞共培养。24小时后，重新纯化NK细胞并检测其细胞毒性。与NLDC共培养获得的NK细胞对Yac-1靶点的裂解最小。相反，与FLDC共培养产生高度溶解的NK细胞（图​（图3A）。三A） ●●●●。为了确定FLDC增强的NK细胞活化是否与其产生TNF-α有关，我们使用单克隆抗体阻断TNF-α活性。TNF-α阻断可消除FLDC诱导的标记的NK介导的细胞溶解（图​（图3A），三A） 这表明TNF-α的产生增加介导NK细胞活化。

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图3

来自纤维化小鼠的肝DC通过产生TNF-α在体外诱导NK细胞介导的细胞毒性升高。

(A类)将NLDC或FLDC与脾脏NK细胞以2∶1DC/NK的比例共培养24小时。然后对NK细胞进行再纯化和电镀⁵¹Cr标记的Yac-1淋巴瘤靶点。与来自纤维化肝的DC共培养的NK细胞产生明显高的Yac-1裂解，这是TNF-α依赖性的，而单独培养或与NLDCs共培养的KN细胞几乎没有诱导靶向裂解(P（P）< 0.05). (B类–E类)对DC-NK共培养产生的细胞因子的分析表明，FLDCs诱导了细胞因子的增加(B类)肿瘤坏死因子-α(C类)干扰素-γ(D类)MCP-1和(E类)IL-6和IL-10(P（P）< 0.05). 然而，在每种情况下，TNF-α的阻断都会部分消除细胞因子产生的升高(P（P）< 0.05). 在FLDC-NK共培养井中添加5μM CpG进一步显著提高了(F类)干扰素-γ和(G公司)白介素-6(P（P）< 0.05). DC-NK共培养试验重复4次，结果相似。

为了确定DC和NK细胞之间的相互作用是否也可能导致纤维化肝脏炎症环境的升高，我们测量了DC-NK共培养中产生的一些免疫调节细胞因子和趋化因子的水平。与FLDCs培养的NK细胞产生700 pg/ml以上的TNF-α，相比之下，单独培养的FLDCs产生100 pg/ml，而NK细胞单独产生的水平（<7 pg/ml）无法检测。相反，与NK细胞共培养的NLDCs并没有增加TNF-α的分泌（图​（图3B）。三B） ●●●●。FLDC也刺激NK细胞产生适度水平的IFN-γ，但NLDC没有（图​（图3C）。三C） ●●●●。与FLDCs激活NK是由于较高的TNF-αDC生成量所致的概念相一致，阻断TNF-β可使IFN-γ生成量减少近4倍（图​（图3C）。三C） 。此外，在与NK细胞共培养时，FLDCs诱导了明显高的MCP-1、IL-6和IL-10的产生，而NLDCs是非激活的（图​（图3，三、D和E）。同样，TNF-α的阻断也部分降低了这种生成。同样，NK与FLDCs（而非NLDCs）共培养导致IL-2、IP-10、GM-CSF、MIP-1β、MIP-2和RANTES以TNF-α依赖的方式显著增加（数据未显示）。综上所述，这些数据表明，DC可以通过至少部分依赖TNF-α的机制激活NK，从而调节纤维化中的肝细胞因子和趋化因子环境，而不仅仅是自身产生TNF-β和IL-6。

因为TLR9结扎增加了FLDC产生TNF-α的能力（图​（图2A），2A） 我们推测CpG可能使FLDCs进一步激活NK细胞。向FLDC-NK共培养物中添加5μM CpG使NK细胞IFN-γ的产生增加了20倍以上（图​（图3F）。三F） ●●●●。相反，TLR9结扎NLDC并没有增加其激活NK细胞的能力（图​（图3F三F和补充图6）。同样，在FLDC-NK共培养井中，CpG差异增强了IL-6的产生（图​（图3G）。三G） ●●●●。这些数据表明，在肝纤维化中，由于TLR9连接，DC被不成比例地激活并能够参与先天免疫。

FLDC在体内激活NK细胞。

接下来，我们使用过继转移模型研究FLDCs是否在体内诱导NK细胞活性。CD11c公司⁺从正常或纤维化肝脏中获取DC，并与CpG ODN 1826孵育，然后通过直接脾接种过继转移至幼年小鼠。18小时后，分离脾脏NK细胞并分析其产生的特定数量的细胞因子。接种FLDC小鼠的NK细胞产生的IFN-γ和IL-6水平是接种NLDC或盐水小鼠的3到10倍（图​（图4A）。4A） ●●●●。此外，体内接种FLDC后，NK细胞产生了非常稳定的MCP-1水平（图​（图4B）。4B） ●●●●。我们还使用相同的实验策略研究了FLDCs是否在体内诱导增强NK细胞产生趋化因子。FLDC接种导致MIP-1α和MIP-1β的NK生成量增加2倍（图​（图4，4，B和C），以及MIP-2和RANTES（数据未显示）。为了保持其在体内激活NK功能的能力，与NLDC的作用相比，过继转移CpG引物的FLDCs在脾NK细胞上上调CD69表达的差异（图​（图4D）。4D） 。这些数据强调了纤维化肝脏的DC在体内激活NK细胞的能力，从而调节炎症环境。

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图4

从纤维化小鼠肝脏过继转移树突状细胞激活体内NK细胞。

DC（1×10⁵)通过FACS从正常或纤维化小鼠的肝脏中获取，用5μM CpG孵育6小时，然后直接注射到幼年动物的脾脏中。18小时时，从受体小鼠的脾脏中获取NK细胞，以1×10的浓度进行电镀⁶，并进行分析以生产(A类)IL-6和IFN-γ(B类)MCP-1和(C类)MIP-1α和MIP-1β在24小时培养中的表达。(A类–C类)从接受过继性转移的FLDCs的小鼠获得的NK细胞产生升高的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β（所有P（P）< 0.05). (D类)或者，通过流式细胞术分析受体小鼠脾脏的NK细胞的CD69表达。与对照组相比，注射FLDCs的脾脏NK细胞中CD69的表达水平略高。阴影直方图表示同型染色。实验重复3次，结果相似。

抗原脉冲FLDCs免疫诱导CTL反应显著升高。

因为FLDCs控制了纤维化中升高的肝脏炎症环境（图​（图2，2和显著活化的NK细胞（图​（图3三和​和4），4)，我们假设FLDC也可能在体内不同程度地参与适应性免疫并产生细胞毒性T细胞。为了验证这一点，用过继转移的NLDCs和经Ova脉冲处理的FLDCs免疫原始C57BL/6小鼠_257–264肽（NLDC.Ova_257–264和FLDC。椭圆形_257–264在体外检测卵巢特异性细胞溶解之前。用NLDC免疫的小鼠的脾细胞得到重新刺激。椭圆形_257–264几乎没有产生靶点溶解，这与NLDC的耐受性免疫表型一致。然而，用FLDC免疫小鼠的脾细胞。椭圆形_257–264以最高的效应器/靶（E/T）比率产生近40%的靶裂解，即使在较低的E/T比率下也保持了实质性的裂解能力（图​（图5A）。5A） ●●●●。用过继转移的脾脏DC进行免疫。椭圆形_257–264与正常脾脏DC相比，来自纤维化小鼠的靶细胞溶解增加幅度小得多。椭圆形_257–264（图​（图5B）。5B） ●●●●。

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图5

FLDC诱导抗原特异性CTL裂解的能力增强。

每周用Ova免疫小鼠两次_257–264肽脉冲(A类)肝脏或(B类)正常或纤维化小鼠的脾脏DC。第二次免疫后1周，收集免疫小鼠的脾细胞，并用Ova重新刺激5天_257-264肽在使用⁵¹Cr标记的EG7目标。(A类)FLDC免疫。椭圆形_257–264但非NLDC。椭圆形_257–264，产生明显的CTL裂解(P（P）< 0.05). (B类)与正常脾树突状细胞相比，使用来自纤维化小鼠的抗原负载脾树突形细胞进行免疫接种在CTL溶解方面产生了适度的益处(P（P）< 0.05). (C类–E类)对第4天CTL培养物的分析显示(C类)干扰素-γ(D类)IL-10和(E类)FLDC免疫后CTL上清液中IL-5显著升高。椭圆形_257-264与控制相比（所有P（P）< 0.05). CTL实验重复3次，结果相似。

为了进一步探讨DC在肝纤维化中的免疫原性及其对炎症环境的调节，我们研究了抗原脉冲FLDCs免疫是否会诱导Th1或Th2细胞因子的表达。为了测试这一点，在上述实验中从CTL培养物中采集上清液并进行分析。我们发现，用抗原脉冲FLDC免疫的小鼠的CTL培养物产生了非常高水平的IFN-γ。相反，在用生理盐水或抗原负载的NLDC免疫的小鼠的CTL培养物中，IFN-γ水平最低（图​（图5C）。5C） ●●●●。此外，用FLDC免疫小鼠的CTL培养物。椭圆形_257–264产生高度升高的Th2细胞因子IL-10水平（图​（图5D）5D） 和IL-5（图​（图5E）。5E） ●●●●。综上所述，我们的数据表明Th1和Th2机制均被抗原脉冲的FLDC激活，而NLDC相对惰性。

抗原负载的FLDC产生增强的CD4⁺和CD8⁺引流淋巴结和肝脏中的T细胞增殖。

为了进一步评估FLDCs的免疫原性，我们测试了它们迁移到区域淋巴结和原抗原限制性CD4的能力⁺T细胞。CD45.1型⁺用CD45.2过继性转移同类小鼠⁺CD4细胞⁺18小时后，用DC脚垫接种OT-II T细胞。椭圆形_323-339在90小时时，采集同侧腘淋巴结，CD4的分数⁺CD45.2型⁺流式细胞术检测T细胞。FLDCs诱导实质性抗原特异性CD4⁺引流淋巴结池中的T细胞增殖，而NLDC的刺激作用最小（图​（图6A）。6A） ●●●●。此外，与NLDC相比，FLDC诱导了显著的T细胞激活（由CD25表达决定）（图​（图6A）。6A） ●●●●。

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图6

FLDC增强了启动T细胞的能力。

(A类)测试树突状细胞启动CD4的能力⁺体内T细胞，同源CD45.1⁺给小鼠注射OT-II T细胞（2×10⁶)静脉注射18小时后，受体小鼠接受DC脚垫接种。椭圆形_323–339(2 × 10⁵). 90小时时，CD3的百分比⁺CD4细胞⁺CD45.2型⁺所有CD3中的T细胞⁺CD4细胞⁺测定引流腘淋巴结中的T细胞（图中数字）及其CD25的表达。(B类)为了评估原位交叉呈现，给正常或纤维化小鼠2×10⁶OT-I T细胞，然后在18小时接种1 mg Ova。肝脏CD3的数量⁺CD8（CD8）⁺椭圆形_257–264戊烷异构体⁺在90小时时对细胞进行测量。纤维化肝的交叉呈递率较高(P（P）< 0.05). (C类)测试FLDC启动抗原限制性CD4的能力⁺体外T细胞，DC负载Ova_323–339用于刺激OT-II T细胞。与NLDC相比，抗原脉冲FLDC诱导更高的OT-II T细胞增殖(P（P）<0.05，在3种最高浓度下）。(D类)然而，TNF-α的阻断消除了增强的增殖(P（P）< 0.05). (E类)同样，FLDC。椭圆形_257–264与NLDC相比，OT-I T细胞的增殖更加旺盛。椭圆形_257–264(P（P）<0.05，在两个最高浓度下）。(F类)同样，增强的CD8⁺TNF-α阻断可抑制T细胞增殖(P（P）< 0.05). 试验重复至少3次，结果相似。

测试抗原脉冲FLDC诱导CD8的能力⁺体内T细胞增殖，采用类似的过继转移模型。给小鼠注射CD8⁺OTI T细胞在18小时后用DC进行静脉注射接种。椭圆形_257–264。在90小时时，收获肝脏NPC，CD8的分数⁺椭圆形_257–264戊烷异构体⁺流式细胞术检测T细胞。与我们之前的发现一致，抗原脉冲的FLDCs诱导了较高的CD8⁺体内T细胞增殖（补充图7）。综上所述，我们的数据表明，尽管来自正常肝脏的DC免疫原性较差，但来自纤维化肝脏的DC是强大的APC。

最近研究表明，肝内抗原的交叉呈递是由肝树突状细胞介导的(9). 由于FLDC增强了体内刺激T细胞的能力，我们假设在纤维化肝脏内原位交叉呈现增强。为了验证这一点，将正常和纤维化小鼠过继性转移OT-I T细胞，然后在18小时后静脉注射Ova。第4天，肝脏CD8的数量⁺椭圆形_257–264戊烷异构体⁺测量T细胞。纤维化肝脏中的交叉呈递比正常肝脏中更为活跃（图​（图6B）。6B） ●●●●。

FLDCs通过TNF-α依赖机制诱导增强的T细胞刺激。

我们推测，与DC-NK的发现类似，TNF-α可能是FLDC激活T细胞能力增强的原因。为了验证这一点，我们使用了体外模型。抗原特异性CD4⁺通过电镀辐照DC评估T细胞刺激性。椭圆形_323-339带CD4⁺OT-II T细胞。与我们的体内数据一致，FLDC诱导的OT-II增殖高于NLDC（图​（图6C）；6C） ；然而，TNF-α阻断消除了更高的OT-II增殖（图​（图6D）。6D） 。测量抗原限制性CD8的DC诱导⁺体外T细胞，DC负载Ova_257–264然后用来刺激CD8⁺OT-I T细胞。同样，来自纤维化小鼠肝脏的DC诱导的OT-I增殖高于NLDC（图​（图6E），6E） 和TNF-α阻断使OT-I增殖降至基线水平（图​（图6F）。6F） ●●●●。综上所述，我们的数据表明，TNF-α对增强FLDC参与适应性免疫的能力负有部分责任。

FLDC不同程度地增强T细胞表型。

为了进一步研究纤维化动物DC的免疫原性能力，我们分析了它们诱导活化T细胞表面表型的能力。在流式细胞术检测T细胞表面表型之前，将正常和纤维化C57BL/6小鼠的肝和脾DC与BALB/c小鼠的异基因T细胞共培养。与NLDCs相比，FLDCs在异基因T细胞上下调CD62L表达，上调CD11b和CD178表达。相反，与正常脾脏DC相比，纤维化小鼠脾脏DC的T细胞表面表型轻微增强（图​（图7A）。7A） ●●●●。除了诱导更活跃的T细胞表型外，FLDC在混合淋巴细胞反应（MLR）中诱导的T细胞增殖几乎是NLDC的2倍（图​（图7B）。7B） ●●●●。相反，与对照组相比，纤维化小鼠的脾树突状细胞没有诱导增强的同种异体增殖（图​（图7C），7C） 再次表明DC在纤维化中的免疫原性增强是肝脏特异性的。

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图7

FLDC激活T细胞并能介导肿瘤保护。

(A类)DC（3×10⁴)将C57BL/6小鼠与异基因BALB/c T细胞（2×10⁵)24小时。CD3（CD3）⁺然后通过流式细胞术分析T细胞。(B类)来自C57BL/6小鼠的FLDC或NLDC在MLR中接种BALB/c T细胞72小时，然后用^三H-胸腺嘧啶。在测试的两个最高浓度下，FLDCs诱导的T细胞增殖几乎是NLDCs的两倍(P（P）< 0.05). (C类)相反，来自纤维化小鼠的脾脏DC表现与正常脾脏DC相似。(D类)为了测试肝树突状细胞在体内介导肿瘤保护的能力，每周用生理盐水或过继转移的NLDCs或FLDCs（1×10⁵)在体外装载了Ova_257–264肽（每组5只小鼠）。在过继转移免疫之前，DC与5μM CpG孵育6小时。第二次免疫后1周，小鼠皮下注射EG7（3.5×10⁵单元格）。用抗原负载的FLDC免疫的所有小鼠都能防止肿瘤的发生，而对照动物在肿瘤侵袭后11天内就形成了皮下结节(P（P）< 0.05).

FLDC免疫可防止肿瘤生长。

累积的数据表明，肝树突状细胞的耐受性被逆转为在纤维化中具有强大的免疫原性。为了进一步验证这一点，我们检测了肝树突状细胞抵抗肿瘤发展的能力。从正常或纤维化小鼠的肝脏中获取DC，并装载Ova_257–264，与CpG孵育，然后过继转移到幼年小鼠。在第7天，即第14天用EG7细胞挑战皮下肿瘤之前，再次进行免疫。用生理盐水或NLDC免疫所有小鼠。椭圆形_257–264激发后第11天显示肿瘤发展。相反，用FLDC免疫小鼠。椭圆形_257–264完全避免了肿瘤的发展（图​（图7D）。7D） 。用模拟负载的FLDC进行免疫并不能预防EG7（数据未显示）。

细胞隔离和培养。

如前所述隔离NPC(4). 门静脉注入1%胶原酶IV（Sigma-Aldrich），然后进行肝切除和机械消化。低速（30克)对肝悬浮液进行离心以排除肝细胞，然后进行高速（400克)离心分离NPC，通过Optiprep（Sigma-Aldrich）梯度进一步富集NPC。使用抗CD11c免疫磁珠纯化DC，并通过LS柱（Miltenyi）或FACS分选传代。对于HSC分离，使用蠕动泵用胶原酶（1ml/min）灌注肝脏。HSC在三层Percoll（GE Healthcare）梯度上富集（52%、50%和30%；参考文献。23). HSC用于培养第14天的实验。对于DC-HSC共培养分析，5×10⁵DC与HSC在24孔板中以1:2的比例在完全RPMI中培养（RPMI 1640与10%热灭活FBS、2 mM L-谷氨酰胺和0.05 mM 2-ME）。在选定的实验中，使用0.4μm跨阱插入物（Costar）防止细胞接触。

流式细胞术和细胞因子分析。

孵育5×10后用FACSCalibur（BD）进行流式细胞术⁵使用1μg抗FcγRIII/II抗体（2.4G2，Fc阻断；单克隆抗体核心设施，斯隆-凯特琳研究所）的细胞/试管，然后用1μg荧光结合抗体进行标记（补充表1）。为了进行细胞因子分析，细胞悬浮液在1×10浓度的完全RPMI中培养⁶在上清液收获和使用细胞珠阵列（BD）或Milliplex免疫测定法（Millipore）进行分析之前24小时。根据制造商的方案（BD），使用细胞内细胞因子检测试剂盒进行细胞内细胞素染色。在选定的实验中，用TLR3配体Poly（I:C）（10μg/ml）、TLR4配体LPS（1μg/ml，TLR5配体Flagellin（1μg/ml）或TLR9配体CpG ODN1826（5μM，均来自InvivoGen）刺激DC。

T细胞和HSC增殖试验。

在体外T细胞增殖试验中，将不同数量的DC添加到2×10⁵异基因T细胞，CD8⁺Ova特异性OT-I TCR转基因T细胞_257–264，或CD4⁺卵巢特异性OT-II TCR-转基因T细胞_323–339在96 well板中放置48–72小时，然后用^三如前所述的H-胸苷(13). DC在使用前加载相关的Ova肽（10μg/ml；AnaSpec）1小时。在选定的检测中，使用2E2或同型对照（5μg/ml；Sloan-Kettering研究所单克隆抗体核心设施）阻断TNF-α。评估CD4⁺区域淋巴结中的T细胞启动，CD45.1⁺小鼠静脉注射2×10⁶CD45.2型⁺OT-II脾T细胞。18小时时，小鼠接受2×10的脚垫免疫⁵数据中心。椭圆形_323–33990小时时，采集同侧腘淋巴结，CD3数量⁺CD4细胞⁺CD45.2型⁺流式细胞术检测T细胞。评估肝内CD8⁺体内T细胞增殖，C57BL/6小鼠静脉注射2×10⁶18小时后静脉注射2×10 OT-I脾T细胞⁵数据中心。椭圆形_257–264或Ova（1 mg；Sigma-Aldrich）。CD8（CD8）⁺通过测量肝脏CD3的数量来测定肝脏中的T细胞增殖⁺CD8（CD8）⁺椭圆形_257–264彭特拉姆（Pentramer）⁺细胞（ProImmune）。对于HSC增殖分析，2×10⁴HSC在48周的培养皿中培养2天，无论是单独培养还是与1×10⁵辐照（30 Gy）的肝树突状细胞。在共培养的最后12小时，用^三H-胸腺嘧啶核苷和增殖用MicroBeta闪烁计数器（Perkin-Elmer）测量。

CTL分析和肿瘤实验。

用DC免疫小鼠。椭圆形_257–264(1 × 10⁵)每周一次。对于CTL分析，在第二次免疫后1周，采集免疫动物的脾细胞，用Ova重新刺激_257-264肽（10μg/ml）5天，然后针对1×10进行测试^{4 51}不同E/T比率的Cr标记EG7细胞（ATCC）。在肿瘤实验中，第二次免疫后1周，用3×10攻击小鼠皮下注射⁵EG7细胞。

NK细胞分析。

如前所述进行DC-NK共培养(13). 简言之，1×10⁵脾NK细胞接种2×10⁵DC在96块钢板中放置18-24小时。为了进行细胞毒性试验，使用免疫磁珠对NK细胞进行再纯化，并将其与2×10^{3 51}Cr标记的Yac-1靶点（ATCC）。体内NK刺激试验，1×10⁵通过剖腹探查直接脾接种法将树突状细胞过继转移至小鼠。18小时后，采集脾脏NK细胞进行分析。

组织学和免疫荧光。

组织学分析中，肝脏用10%的福尔马林缓冲液固定，乙醇脱水，石蜡包埋，用H&E、马尾松三色或苦味酸-天狼星红染色。免疫荧光研究中，肝脏冰冻切片用抗CD11c（BD）染色。图像是在Axiovert 200M荧光显微镜（蔡司）上拍摄的。

作者感谢Scott Friedman（美国纽约州纽约市西奈山医学院）及其实验室在HSC分离和培养方面的指导。这项工作得到了美国肝脏基金会颁发的肝脏学者奖（授予G.Miller）、生物医学和生物科学初级教员怀特黑德奖学金（授予G.Miller）以及NIH颁发的F30 AA 017344-01（授予J.Mallen-St.Clair）、CA55360-18（授予D.Bar-Sagi）和CA108573（授予a.B.Frey）的部分支持。