病原体相关分子模式(PAMP)与天然免疫细胞上的Toll样受体(TLR)相互作用,启动保护性免疫反应(1-三). 危险相关分子模式(DAMP)(4)是细胞损伤过程中释放的细胞内成分,如HMGB1、HSP70、HSP90和细胞RNA,也可诱导TLR依赖性炎症反应(5-8). 主机是否能够区分DAMP和PAMP尚不清楚。
我们使用对乙酰氨基酚(AAP)诱导的肝坏死模型(9)确定调节组织损伤引起的先天免疫反应的基因。野生型(WT)小鼠可以耐受亚致死剂量的AAP(10 mg/只),导致CD24型-不足(CD24型-/-)20小时内的小鼠(). 然后我们测试CD24是否调节AAP诱导的肝损伤的炎症反应,因为CD24在肝卵圆细胞和造血细胞上表达,而在肝细胞上不表达(10). 事实上,我们发现AAP治疗后炎症细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)显著增加(). 这伴随着血清丙氨酸转氨酶(ALT)的增加,这表明肝脏损伤()以及肝脏出血和坏死(). 这些观察结果表明,CD24通过调节炎症反应,保护AAP诱导的肝毒性。
CD24负调节AAP诱导的肝损伤的免疫反应。CD24型-/-用AAP(10 mg/只,溶于H20)或车辆控制。(A类)治疗后20小时小鼠存活率。图表上的数字表示每组使用的存活小鼠数量超过总小鼠数量。所有WT小鼠保持健康。(B类)注射AAP后6小时血清IL-6、MCP-1和TNF-α水平(平均值±SD,n个= 5; *P(P)< 0.02, **P(P)< 0.009; ***P(P)<0.002,学生t检验)。(C)治疗后6小时测量的ALT水平(平均值±SD,n个= 5; ***P<0.00004,学生t检验)。(B)和(C)中显示的数据重复了2次。(D类)治疗后9小时分离肝脏。H&E染色的代表性图像(20x)如图所示(n=3)。
CD24是一种小的糖基-磷酸肌醇锚定蛋白,能够向T细胞提供共刺激信号,并与自身免疫疾病的发展有关(11-15). 我们着手鉴定与CD24相关的蛋白质,因为没有已知的CD24配体能够深入了解其在我们的肝损伤模型中的保护作用。我们关注的是其相互作用可被阳离子螯合剂EDTA破坏的蛋白质,因为估计90%以上的CD24质量来自糖基化(12)因为蛋白质-多糖的相互作用很大程度上依赖于阳离子。简言之,我们从小鼠脾细胞裂解物中免疫沉淀CD24及其相关蛋白。用EDTA洗脱的蛋白质进行高通量质谱分析和SDS-PAGE。HMGB1,一种典型的DAMP分子,在组织损伤后激活免疫反应(16)是我们发现的最显著的蛋白质之一(和表S1). HMGB1与CD24共免疫沉淀,这种相互作用是特异性的(). 一种重组CD24-Fc融合蛋白特异性共免疫沉淀重组HMGB1,证明CD24与HMGB1之间的相互作用是直接的().
CD24与HMGB1的免疫反应相关,并负调节其免疫反应。(A类)通过共免疫沉淀鉴定CD24相关蛋白。显示了SDS-PAGE凝胶的银染色。箭头指示HMGB1和核仁素的位置,这两种丰富的CD24相关DAMP分子。NS:与抗CD24非特异性免疫沉淀的蛋白质。(B类)通过EDTA脱相关蛋白的Western blot确认CD24-HMGB1关联。(C)用从WT小鼠分离的脾细胞裂解物进行CD24和HMGB1的相互免疫沉淀。(D类)CD24和HMGB1之间的直接、阳离子依赖性相互作用。重组HMGB1蛋白与CD24-Fc融合蛋白或对照IgG-Fc共免疫沉淀。用EDTA破坏络合物证实了对阳离子的需求。这个实验已经重复了三次。(电子)在腹腔注射AAP前30分钟,用载体(PBS)或小鼠HMGB1单克隆抗体(克隆3B1,150μg/小鼠)对小鼠进行静脉注射。显示了两个独立实验的合成数据(n个= 8). (F类)用AAP和HMGB1抗体治疗6小时后的血清ALT(平均值±SD,n个= 5, **P(P)< 0.005). (G公司)用AAP和HMGB1抗体治疗6小时后的血清细胞因子水平(平均值±SD,n个= 5, *P(P),0.03**P(P)< 0.004). (F)和(G)中的样本代表两个独立的实验,统计显著性由学生的t检验确定。
确定是否在CD24型-/-小鼠对HMGB1的免疫反应增强,我们给AAP处理的小鼠注射HMGB1抗体(图S1). 在一个具有代表性的实验中,阻断HMGB1可以拯救87.5%接受AAP的小鼠(). 治疗组小鼠ALT丰度降低,表明肝细胞破坏减少(). IL-6、MCP-1和TNF-α的产生也大大减少(). 因此,CD24通过抑制HMGB1的免疫反应来保护AAP诱导的致死性肝毒性。
HMGB1可分为两个域:抑制A盒和刺激B盒(17). 为了确定CD24是否通过与抑制性A盒结合来抑制HMGB1,我们产生了缺失A盒或B盒的缺失突变体。CD24-Fc免疫沉淀全长HMGB1和含盒B突变体,但不含盒A突变体(图S2). 因此,CD24对HMGB1的抑制不需要与盒A直接相互作用。
CD24没有已知的信号转导机制。为了了解CD24是如何负性调节HMGB1的,我们寻找了一个可能转导CD24下游信号的潜在CD24受体。我们对唾液酸结合的Ig样凝集素(Siglecs)特别感兴趣,它是免疫球蛋白超家族的细胞表面受体,可识别唾液酸蛋白(18). Siglecs主要由造血来源的细胞表达(18). 大多数Siglecs被认为是免疫系统的负调节因子,因为它们包含一个或多个细胞溶质免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIMs)(18). 为了确定CD24是否与Siglecs相互作用,我们在涂有含Siglec-5、-7、-10或-11的ITIM重组胞外结构域的平板上培养脾细胞。Siglec-10,但不是Siglec-5、-7或-11,与CD24结合(). 流式细胞术分析表明CD24是Siglec-10的主要受体,因为WT而不是CD24型-/-脾细胞显示可检测到与可溶性Siglec-10-Fc的结合(). 此外,在COS细胞中,FLAG标记的Siglec-10与Siglec-10-Fc共免疫沉淀,而Siglec-10的失活R119A突变(类似于唾液粘附素中的R97A(19)),取消了互动().
Siglec 10/G-CD24-HMGB1轴负调节AAP诱导肝损伤的免疫反应。(A类)CD24和Siglec-Fc融合蛋白之间的相互作用。所示数据为光密度,已重复3次。(B类)CD24与Siglec-10相互作用的流式细胞术分析。显示了两个独立实验的代表性直方图。(C)用FLAG标记的WT或突变(*,R119A)Siglec-10 cDNA或载体对照转染COS细胞。48小时后进行免疫共沉淀。(D类)WT或CD24型-/-使用脾细胞共同免疫沉淀Siglec-10-Fc、CD24和HMGB1。(电子)WT和CD24型-/-用Siglec-G抗体或对照小鼠Ig沉淀脾细胞。用Siglec-G抗血清和CD24和HMGB1特异性单克隆抗体检测沉淀物。(F类)AAP治疗后20小时的存活率。图中的数字表示存活小鼠的数量占所用小鼠总数的比例。(G公司)AAP治疗6小时后血清中ALT的释放(平均值±SD*P(P)<0.005,n=5)。(H(H))AAP注射后6小时采集肝脏H&E染色20x图像。(我)AAP治疗6小时后测量血液中细胞因子的产生(平均值±SD,n=5)*P(P)<0.05, **P(P)< 0.009, ***P(P)< 0.002). (J型)WT和Siglecg公司-/-小鼠治疗20小时后。(K(K))治疗6小时后血液中ALT的释放(平均值±SD,n个= 5, *P(P)< 0.006). (L(左))治疗6小时后血液中细胞因子的释放(平均值±SD,n个= 5, *P(P)< 0.03, **P(P)<0.0006时***P(P)< 0.0004). (K-L)是两个独立实验的代表。统计显著性由学生的t检验确定。
我们假设CD24、Siglec-10和HMGB1可能会形成三分子复合物,因为CD24可以与HMGB1和Siglec-10相互作用。事实上,Siglec-10-Fc能够从WT裂解液中免疫沉淀HMGB1,但不能CD24型-/-脾细胞()表明它们的相互作用严格依赖于CD24的表达。
Siglec-10可能的小鼠同源物是Siglec-G(18). 我们通过免疫制备抗Siglec-G抗血清Siglecg公司-/-老鼠(20)有WT脾细胞(图S3). 使用这种抗血清,Siglec-G共免疫沉淀CD24(). CD24Fc与野生型脾细胞的结合力强于Siglecg公司-/-脾细胞,表明Siglec-G有助于CD24-Fc结合;然而,与先前关于多个CD24受体的报道一致(12),Siglec-G缺乏并没有消除CD24-Fc脾细胞结合(图S4). 接下来,我们确定Siglec-G的缺失是否也会传递对AAP的超敏反应。事实上,只有25%Siglecg公司-/-小鼠存活了亚致死剂量的AAP(). 敏感性增强伴随着ALT释放增加()、肝坏死和出血()以及血液中炎性细胞因子的增加(). 为了测试增强的肝毒性是否由HMGB1介导,我们治疗Siglecg公司-/-HMGB1抗体小鼠。抑制HMGB1可防止90%AAP治疗患者的死亡率Siglecg公司-/-老鼠(). 血清ALT和炎性细胞因子也显著降低().
CD24和Siglec-10不太可能直接作用于肝细胞,因为它们不由这些细胞表达(10,18). 然而,树突状细胞(DC)对HMGB1有反应(21)并表达CD24(22)和Siglec-G(20). 为了测试DC是否对HMGB1有反应,我们培养了从WT、,CD24型-/-或Siglecg公司-/-HMGB1或TLR配体LPS或poly I:C刺激小鼠,HMGB1刺激可显著增加IL-6和TNF-α的产生CD24型-/-或Siglecg公司-/-DC比WT DC(). 相反,CD24或Siglec-G缺乏并不影响DC对LPS或poly I:C的反应产生炎性细胞因子().
CD24和Siglec-G负调节HMGB1、HSP70和HSP90的免疫应答,但不调节LPS和poly I:C的免疫应答(A类)DC产生细胞因子。从WT培养的DC,CD24型-/-或Siglecg公司-/-用LPS(100 ng/ml)、polyI:C(10μg/ml)或递增剂量(5、10和20μg/ml。数据表示每个基因型中三种独立DC培养的平均值±SD,并且至少重复了三次。(B类)与WT隔离的BMDC,CD24型-/-或Siglecg公司-/-在指定条件下刺激小鼠6小时。制备核裂解物,并通过印迹NF-κB的p65亚单位来评估NF-kb B的活化。核蛋白的负载量由Sp1蛋白的量决定。照片下方提供中控折叠感应。数据是两个独立实验的代表。(C)年龄匹配的雄性小鼠接受腹腔注射LPS(450μg/只)。卡普兰·迈耶生存曲线如图所示。对数秩检验未发现统计学意义。(D类)注射LPS后4小时血清中细胞因子的产生(平均值±SD),通过学生t检验确定对照组与治疗组之间差异的统计学意义*P(P)<0.03时**P(P)< 0.002). 使用的小鼠数量与(C)相同。(电子)CD24与Hsp70和Hsp90的免疫共沉淀。(F类)Siglec-G通过CD24与Hsp70和Hsp90相关。相同的沉淀物用于通过免疫印迹分析Hsp70和Hsp90。(G公司)在用HSP70和HSP90刺激6小时后,CD24和Siglec-G的缺乏增加了IL-6和TNF-α的生成。所示数据表示来自每个基因型的4个独立DC分离物的细胞因子平均值±SD,并重复了两次。
Siglec-10与酪氨酸磷酸酶SHP-1相关,SHP-1是已知的NF-κB活化负调节因子(23). 位于腹膜中的B细胞亚群(20)Siglec-G的缺失导致NF-κB的结构性激活。为了测试HMGB1或LPS对NF-κB的激活是否受到CD24或Siglec-G缺失的影响,我们检测了WT中NF-κ)B亚基p65的核转位,CD24型-/-和Siglecg公司-/-跟单信用证。LPS和HMGB1均诱导WT DC中p65的核易位,但程度较小;然而,在CD24型或Siglecg公司-与脂多糖相比,缺乏DCs、HMGB1导致p65核转位的增加更大(). 这些数据表明,CD24-Siglec-G通路可能通过选择性抑制NF-κB降低宿主对DAMP(如HMGB1)的反应,但对微生物源TLR配体(PAMPs)的反应不明显。
为了证实这一假设,我们给WT注射了致死剂量的LPS,CD24型-/-或Siglecg公司-/-老鼠。Siglec-G和CD24的缺失均不影响LPS诱导的致死动力学()或产生炎性细胞因子(). 尽管HMGB1对脓毒症晚期有一定作用(24)HMGB1信号的潜在扩增CD24型或Siglecg公司对LPS的反应不影响宿主存活。因此,CD24和Siglec-G是宿主对HMGB1反应的选择性调节剂,但不是对TLR配体(如LPS)反应的选择性调节器,尽管它们可能诱导HMGB1的释放(24,25).
除了HMGB1等核DAMP外,DC还通过TLR依赖机制对HSP70和90等细胞质DAMP作出反应(6). 为了确定CD24-Siglec-G通路是否也调节宿主对HSP70和90的反应,我们首先评估了HSP70、90是否与CD24和Siglec-G相关。免疫共沉淀显示CD24与HSP70及HSP90相关(). 与HMGB1相似,Siglec-G与HSP70和HSP90的相关性是CD24依赖性的()和CD24型-/-和西格莱克-/-DC对重组HSP70和HSP90的反应产生了显著升高的IL-6和TNF-α()与WT DC相比。这些数据揭示了CD24和Siglec-G在对多个DAMP的DC反应的负调控中的关键作用。
我们的结果表明,CD24与人类的Siglec-10或小鼠的Siglec-G结合,对受损细胞释放的蛋白质产生负向调节,但对微生物来源的配体不产生负向调控。TLR和RAGE等模式识别受体介导DAMP诱导的激活(7,8). 我们的数据表明,抑制HMGB1的反应可能是通过抑制NF-κB的激活来实现的。抑制可能由SHP-1介导。SHP-1通过其ITIM基序与Siglec-10结合(26)Siglec-G或SHP-1缺乏会增强NF-κB的活化(20,23). 鉴于HMGB1在许多疾病的发病机制中的作用,包括药物毒性(9)肝脏和心脏缺血再灌注(27,28),该途径可能揭示疾病干预的新靶点。
虽然已经确定宿主可以识别由受损组织引起的“危险”(4)目前尚不清楚组织损伤引发的免疫反应是否或如何受到调控。通过鉴定选择性抑制DAMP免疫反应的CD24-Siglec-G途径,我们的数据证明了区分组织损伤和感染的机制,尽管它们都使用进化保守的TLR(5-8).