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肝素杂志。作者手稿；PMC 2010年7月1日发布。
以最终编辑形式发布为：
肝素杂志。2009年7月；51(1): 139–148.
2009年5月3日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.jhep.2009年3月24日
PMCID公司：PMC2765371型
美国国立卫生研究院：NIHMS113552
PMID：19457567

肝星状细胞吞噬凋亡体通过JAK/STAT和Akt/NF-κB依赖途径促进其存活

乔伊·X.江,1,* 三见贤一郎,1,* Senthil Venugopal公司,2 李勇,1和娜塔莉·托洛克（Natalie Jörök）1
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

背景/目标

我们之前已经证明肝星状细胞（HSC）吞噬凋亡小体（AB）是促纤维化的。由于HSC存活对肝纤维化的进展至关重要，我们的目标是研究吞噬作用是否诱导HSC存活。

方法

在已知凋亡剂存在的情况下，研究吞噬HSC的细胞凋亡。评估JAK/STAT和PI3K/Akt依赖性通路、NF-κB活化以及抗凋亡蛋白Mcl-1和A1的表达。通过siRNA方法阻断A1后评估细胞凋亡。

结果

吞噬性HSC对FasL/环己酰亚胺或TRAIL诱导的凋亡具有抵抗作用。抑制JAK/STAT或PI3K介导的通路可诱导HSC凋亡。吞噬作用诱导JAK1/STAT3磷酸化，而这可以通过抑制JAK来阻止。JAK抑制也阻断了STAT3向细胞核的转移。Mcl-1表达以JAK依赖的方式上调。Akt的PI3K依赖性磷酸化依赖于NADPH氧化酶活性和超氧物生成。观察到NF-κB激活和随后A1的上调，A1抑制诱导HSC凋亡。

结论

AB吞噬作用通过两条途径促进HSC存活，其中A1依赖性更为显著。这代表了一种新的机制，AB的吞噬有助于肝纤维化的传播。

关键词：细胞凋亡、吞噬作用、NADPH氧化酶、氧化自由基、肝纤维化

介绍

肝星状细胞（HSC）在肝纤维化发生中起着关键作用(1). 在纤维原性刺激诱导下，HSC发生活化，从静止表型转分化为肌成纤维细胞，产生I型胶原α1(1). HSC的存活是肝纤维化的一个标志，HSC凋亡的诱导可以诱导肝纤维化的恢复(2-4). 激活的人HSC对许多促凋亡刺激具有抵抗力，如血清剥夺、Fas-ligand（FasL），主要的生存信号是Bcl-2家族成员的过度表达(5,6). 然而，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）可诱导活化的HSC凋亡通过TRAIL-R2/DR5表达上调(4). 越来越多的证据表明，反应性氧化物种（ROS）不仅是病理性的，而且在许多情况下，它们在细胞生存途径中充当第二信使(7,8). Janus激酶（JAK）/信号转导子和转录激活子（STAT）在氧化应激期间被激活(7,9-11). 磷酸化后，STAT转移到细胞核并结合DNA(12). 由于Bcl-xL的诱导，STAT3磷酸化与细胞存活密切相关(13)和髓细胞白血病-1蛋白（Mcl-1）(14). 我们最近发现HSC吞噬凋亡小体（AB）激活了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶（NADPH）氧化酶，从而上调了前胶原α1（I）(15). 超氧化物和过氧化氢（H2O（运行）2)已知可在不同系统中诱导Akt依赖性生存(16,17). 由于已知磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和Akt可以调节核因子κB（NF-κB）的活性，因此很容易推测NADPH氧化酶会激活NF-kb B依赖的生存信号。NF-κB活性是抗凋亡蛋白表达的核心，包括HSC中的Bcl-2家族蛋白A1(4).

在这里，我们报道了AB的吞噬作用在HSC中诱导不同的生存途径，导致肌成纤维细胞在肝脏中的繁殖。在吞噬AB后，证明了NF-κB依赖性上调抗凋亡蛋白A1和STAT3介导的Mcl-1诱导。

材料和方法

细胞培养

使用永生人HSC系LX-2（由SL Friedman医学博士、纽约西奈山医学院提供）和原代大鼠HSC。根据Geerts等人(18)经维生素A荧光评估，纯度始终>95%。原代HSC保存在含有20%FBS的培养基199（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）中。LX-2细胞在含有5%FBS的DMEM（Invitrogen）中培养。实验前，将培养基更换为无血清培养基。

凋亡小体的生成

为了生成标记为AB的羧基四甲基罗丹明琥珀酰酯（TAMRA，Invitrogen，Carlsbad，CA），HepG2细胞与TAMRA（10μM）孵育，然后暴露于紫外线照射（100 mJ/cm2，142秒），如前所述(19). 将标记的AB加入原代HSC或LX-2细胞。通过荧光和相位显微镜检测AB的吞噬作用(15,19).

细胞凋亡实验

将原代HSC与AB孵育24小时，然后在有或无FasL（5ng/ml，EMD Chemicals，加利福尼亚州圣地亚哥）和/或环己酰亚胺（10μg/ml，Sigma-Aldrich）、JAK抑制剂AG490（50μM，1小时，EMD Chemicals）、选择性PI3K抑制剂LY294002（600 nM，1 h，EMD化学品）的情况下进一步孵育18小时。对于涉及TRAIL的实验，将原代HSC培养活化7天，然后在有或无AB的情况下暴露于500 ng/ml重组TRAIL（明尼阿波利斯研发系统公司，明尼苏达州）过夜就地使用活性半胱天冬酶-3抗体的标记方法（FITC/PE检测试剂盒，Cell Technology，加利福尼亚州山景城）。Nuclei用DAPI标记（加利福尼亚州伯林盖姆向量实验室）。通过特征性核凋亡变化（DAPI）和活性caspase-3的存在来评估细胞凋亡。未进行生化分析以评估半胱天冬酶活性，因为吞噬AB的HSC会发出假阳性信号。在3个不同的实验中，每个实验都对3个不同领域的500个细胞进行了计数。

细胞色素c还原试验

将初级HSC电镀并暴露于AB。暴露于AB2小时后收集上清液。在存在（100 U/ml）或不存在超氧化物歧化酶（SOD）的情况下添加细胞色素c（160 uM）（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州），并在37°c下孵育20分钟。通过从含有SOD的样品中减去不含SOD样品在550 nm处的吸光度读数，得出细胞色素c的超氧化物依赖性还原值。最终结果报告为高于对照值的倍数变化(20).

蛋白质印迹分析

为了检测JAK/STAT和Akt磷酸化，将LX-2细胞在无血清培养基中孵育16小时，然后暴露于AB（含或不含抑制剂）、AG490（50μM）、LY294002（20μM）或apocynin（100μM）。然后在不同的时间点收集细胞。用Bio-Rad蛋白检测试剂盒（Bio-RadHercules，CA）测定蛋白质浓度，并用SDS-PAGE分离20μg蛋白质。将印迹与适当的抗体在4°C下孵育16小时：抗磷酸JAK1多克隆抗体（1:500，EMD-Calbiochem）、抗磷酸-STAT3单克隆抗体（1:250，Cell Signaling Technology，Danvers，MA）、抗JAK1和抗STAT3多克隆抗（1:300，Santa Cruz Biotechnology，CA）、，抗磷酸Akt和抗Akt多克隆抗体（1:1000，细胞信号技术）和抗GAPDH多克隆抗体。用辣根过氧化物酶结合二级抗体培养膜（圣克鲁斯生物技术），并通过增强化学发光（皮尔斯生物技术，伊利诺伊州罗克福德）形成印迹。为了检测Mcl-1和A1的表达，将原代HSC暴露于AB中，AB中是否含有AG490（50μM）、LY294002（600 nM）、apocynin（100μM）或CAPE（1ng/ml）。如上所述，使用Mcl-1抗体（1:1000，Millipore Billerica，MA）、A1多克隆抗体（1:300，Biovision，Mountain View，CA）进行Western blot分析。将数据归一化为β-肌动蛋白的表达（1:1000，Santa Cruz Biotechnology）。

cDNA转染

pCMV6-XL6-SOCS3（Origene，Rockville，Md）和对照载体根据制造商的建议，使用脂质体试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染到LX-2细胞（转染效率60-70%）。

RNA干扰

根据制造商的说明，将siRNA转染到A1（德克萨斯州Ambion Austin）和阴性对照标记的（Alexa Fluor 488）或未标记的siRNA（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）中，并在RiboJuice™（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）中加入30nM siRNA。使用相同浓度的干扰siRNA作为对照。如上所述，将细胞暴露于存在或不存在FasL和环己酰亚胺的AB中，并评估细胞凋亡。

STAT3核易位分析

将原代HSC与TAMRA标记的AB在AG490（50μM）存在或不存在的情况下孵育3小时，然后用1%多聚甲醛固定。清洗后，将细胞在-20°的甲醇中培养2分钟，然后清洗，在37°C的10%FBS/PBS中培养1小时，并用抗STAT3抗体染色（1:200，Santa Cruz Biotechnology）。应用FITC缀合的第二抗体（1:2000，Invitrogen），并用DAPI对细胞核进行染色。结果通过荧光显微镜进行分析。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

LX-2细胞需要血清，并与AB孵育2小时，然后使用细胞溶质/核提取试剂盒（Pierce Biotechnology）制备核提取物。NF-κB核转位使用Biotin 3’prime DNA标记试剂盒和光敏化学发光EMSA试剂盒（Pierce Biotechnology）进行测定。NF-κB共有寡核苷酸（5'-AGTTGAGGACTTTCCCAGGC-3’）用生物素标记，然后将核提取物与生物素标记的NF-kb B寡核苷酸混合。将裂解液进行电泳，然后转移到尼龙膜上。将膜暴露于化学发光底物，并通过放射自显影术检测产生的化学发光。

统计分析

所有数据至少代表三个实验，并表示为平均值±标准差。使用与Dunnett检验相关的单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的差异。当p<0.05时，假设具有统计学意义。

结果

吞噬凋亡小体的原发性HSC受到凋亡刺激的保护

为了确定吞噬作用是否对已知促凋亡刺激有保护作用，将原发性HSC暴露于有或无环己酰亚胺和Fas配体或TRAIL的AB中。已知包括环己酰亚胺、阻断蛋白质合成在内的治疗可诱导原发性HSC凋亡，而FasL单独治疗效果较差(21). 活性caspase 3/DAPI标记检测细胞凋亡。环己酰亚胺和Fas配体处理诱导HSC凋亡，而在吞噬HSC时，与未暴露于AB的细胞相比，凋亡减少了31%(图1A). 由于TRAIL诱导活化的HSC凋亡，原代HSC被培养激活，并在AB存在或不存在的情况下暴露于TRAIL。TRAIL诱导HSC显著凋亡，而AB的吞噬作用使其减少46%。这些数据表明AB的吞噬作用对HSC具有保护性、抗凋亡作用。

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凋亡体吞噬作用诱导HSC存活

（A）AB暴露对原发性HSC的凋亡率没有改变（3.7%±0。9） 与对照组相比（2.9%±0.2）。FasL（FSL）联合环己酰亚胺（CHX）诱导HSC凋亡增加15.8%（±1.1）。吞噬HSC N+5时，此值降至11%（±1.0），*p<0.001，**p<0.05。（B）TRAIL诱导的原代培养活化HSC的凋亡（50.6%±6.1）在吞噬HSC时显著降低（27.6%±1.8）。凋亡基于活性caspase-3/DAPI染色检测。将数据标准化为控制，设置为1。N=4，**p<0.05

抑制JAK1/STAT3和PI3K诱导吞噬性HSC凋亡

由于活性氧的产生与JAK/STAT和PI3K依赖性生存途径的激活有关(7,9,22,23)接下来我们研究了吞噬HSC的这些途径。在分离后2天，在存在或不存在JAK抑制剂AG490（50μM）或PI3K抑制剂LY294002（600 nM）的情况下，将原发性HSC暴露于TAMRA标记的AB中，或同时暴露于两者，以评估这些途径是否发挥作用。免疫组化检测caspase 3活性亚基和DAPI染色，并对凋亡率进行量化。由于细胞内AB的溶解会导致假阳性信号，因此未对细胞凋亡进行生化评估。同时，还进行碘化丙啶（PI）染色，以检测细胞坏死。对照组和AB治疗组的细胞凋亡率均较低(图2A a、b)然而，在AG490加AB治疗组中显著增加(图2A c). 结合这两种途径的抑制剂，我们检测到HSC的凋亡进一步增加，如具有特征性核浓缩/断裂的活性caspase 3阳性细胞的数量所示(图2A d，覆盖图像）。如所示图2B在这些条件下，AG490和LY294002处理可诱导细胞凋亡，但吞噬作用略有降低。结合JAK和PI3K抑制，凋亡率进一步升高（78.3%±3.1），吞噬细胞有所减少，但凋亡率仍显著。所有组中PI阳性细胞的百分比低于0.5%（数据未显示）。这些数据表明，在吞噬HSC细胞时，JAK/STAT和PI3K依赖性途径介导细胞存活。

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阻断JAK/STAT和/或PI3K通路诱导吞噬细胞HSC凋亡

（A）在有或无AG490（AG）和/或PI3K抑制剂LY294002（LY）的情况下，用TAMRA标记的AB（红色）处理24小时的大鼠原发性HSC，进行DAPI（蓝色）核染色和免疫荧光检测活性caspase-3（绿色）。DMSO处理的细胞作为对照。a）对照组HSC仅DAPI阳性。b）在暴露于AB的HSC中，未检测到活性半胱天冬酶3信号。c）AG490处理的吞噬HSC对活性caspase 3呈阳性，表明凋亡率较高。d）在吞噬暴露于AG490和LY294002的HSC时，进一步诱导细胞凋亡。箭头指向活性caspase-3（绿色）、DAPI（蓝色）和TAMRA（红色）共存的AB。箭头：caspase-3阳性HSC。棒材：10μm。（B）与对照组（2.9%±0.8）相比，AB暴露没有改变凋亡率（4.0%±0.9）。AG490诱导HSC 26.9%（±1.4）的凋亡，LY294002诱导HSC 40.8%（±1.0）的凋亡。联合抑制这两条通路可诱导78.3%（±3.1）的细胞凋亡，通过AB的吞噬作用，凋亡率有所降低，但凋亡率仍然显著（57.4%±2.8）。N=4，*p<0.001。

凋亡小体的吞噬诱导JAK1和STAT3的激活以及STAT3向细胞核的移位

由于AB吞噬后抑制JAK激活可诱导细胞凋亡，因此我们接下来研究JAK1/STAT3通路在吞噬HSC时是否被激活。Western blot分析表明，AB的吞噬作用以时间依赖的方式诱导JAK1和STAT3磷酸化(图3A). 由于JAK1磷酸化的化学抑制可能不是特异性的，为了证实这些数据，在将LX-2细胞暴露于AB之前，用SOCS3表达质粒转染LX-2电池。在SOCS3转染细胞中JAK1和STAT3磷酸化被抑制（数据未显示）。作为JAK1和STAT3磷酸化的阳性对照，我们使用瘦素，一种已知的细胞因子来诱导HSC中的这些途径(24,25) (图3B). 为了评估磷酸化STAT3是否易位到细胞核，在JAK抑制剂AG490存在或不存在的情况下，对原代吞噬性HSC进行免疫组化。AB暴露细胞中STAT3转位到细胞核(图3C b、c)，这被AG490治疗所阻断(图3C d)证实AB的吞噬确实会诱导STAT3活化和核转位。有趣的是，JAK1和STAT3磷酸化也可以通过抑制PI3K活性而部分降低，这表明两条信号通路之间存在串扰(图3D).

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AB的吞噬作用诱导JAK/STAT磷酸化和STAT3核转位

（A）将LX-2细胞暴露于AB，收集细胞裂解液，使用phosho-JAK1、总JAK1，phospho-STAT3和总STAT3抗体进行免疫印迹。实验表明，AB以时间依赖的方式降低JAK1和STAT3磷酸化。（B）作为阳性对照，瘦素（75ng/ml，10min）诱导LX-2细胞中JAK1和STAT3的磷酸化。（C）用抗STAT3抗体对大鼠原发性HSC进行免疫细胞化学。（a） 在对照细胞（未接触AB）中，STAT3是细胞质。（b，c）AB诱导的HSC STAT3核转位孵化，通过STAT3和DAPI信号的共定位检测到（d）AG490处理AB暴露的HSC抑制STAT3转位。STAT3：绿色，DAPI：蓝色。棒材：20μm。（D）通过LY294002预孵育HSC抑制PI3K活性，也可以部分抑制JAK1和STAT3磷酸化，这表明两条信号通路之间存在串扰。

吞噬HSC时Mcl-1表达上调

由于STAT3被认为是细胞生存途径的中心(14,26,27)，Mcl-1的表达在转录水平上受STAT3调控(28,29)接下来，我们测试AB的吞噬作用是否上调HSC中的Mcl-1。对原代HSC的细胞溶质提取物进行Western blot分析。在吞噬AB后，Mcl-1上调，这被之前与AG490的孵育所抑制。密度测定数据显示，AB的吞噬作用诱导Mcl-1表达上调1.83倍，而这一上调被阻断JAK活性所抑制(图4). IL-6作为阳性对照研究Mcl-1的诱导。

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AB的吞噬作用诱导HSC中Mcl-1的表达

在AG490存在或不存在的情况下，用AB治疗原代大鼠HSC 24小时。对细胞溶质提取物进行Western blot分析，以检测Mcl-1表达的变化。AB处理细胞中Mcl-1表达增加；用JAK抑制剂AG490对细胞进行预孵育可以抑制这一现象。IL-6治疗被用作Mcl-1表达的已知诱导剂。密度测定显示，AB的吞噬作用诱导表达增加1.8倍（±0.3），归一化为β-肌动蛋白，呈重叠对照。N=4，*p<0.05。

AB吞噬作用诱导Akt依赖PI3K的磷酸化

我们以前的数据表明，用LY294002抑制PI3K可诱导吞噬HSC的细胞凋亡，因此HSC的存活也可能涉及Akt依赖性通路的激活。众所周知，吞噬后PI3K活化与活性氧化物种（ROS）的产生同时发生(16)首先，我们进行了细胞色素c分析，以证明ROS的释放(图5A). 接下来，在LY294002和AG490存在或不存在的情况下，将HSC暴露于AB，以观察两条信号通路之间是否存在串扰。用NADPH氧化酶抑制剂罗布青素处理细胞，以测试Akt磷酸化是否依赖NADPH酶活性和ROS生成。AB以时间依赖性的方式吞噬诱导的Akt磷酸化，这被PI3K抑制剂LY294002和罗布麻素抑制(图5B). 抑制JAK对Akt磷酸化的影响较小。总之，AB的吞噬作用诱导了Akt依赖性生存途径，该途径依赖于NADPH氧化酶和PI3K激活产生的ROS。

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AB吞噬作用诱导ROS生成和Akt磷酸化

（A）LX-2细胞与AB孵育6小时，并使用细胞色素c分析评估ROS生成。与对照组相比，AB的吞噬作用诱导了2.2±0.4倍的超氧物活性。N=4，*p<0.05。（B）将LX-2细胞暴露于含或不含罗布青素（NADPH氧化酶抑制剂）、AG490或LY294002的AB，并收集细胞裂解物，使用phosho-Akt和总Akt抗体进行免疫印迹。AB瞬时诱导Akt磷酸化，分别被罗布青素和LY294002阻断，但AG490未阻断。

AB吞噬诱导NF-κB活化

NF-κB对HSC细胞凋亡和细胞存活的调节至关重要(30,31)吞噬作用可激活巨噬细胞中的NF-κB(32). 研究吞噬后HSC是否发生NF-κB活化，并探讨导致其活化的信号通路；HSC在与NF-κB抑制剂CAPE、JAK抑制剂AG490、PI3K抑制剂LY294002或NADPH氧化酶抑制剂apocynin预孵育后暴露于AB。获得核提取物并进行EMSA。AB的吞噬作用强烈地诱导NF-κB的活化，而NFκB抑制剂CAPE对此有抑制作用(图6). 抑制PI3K也显著降低NF-κB的激活，而通过抑制JAK介导的途径或NADPH氧化酶的降低则较为温和。这与我们之前的数据一致，即抑制PI3K激活可诱导吞噬HSC的凋亡。这表明NF-κB活化是吞噬诱导HSC存活的一个组成部分，并且这取决于PI3K活性。

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AB吞噬作用诱导NF-κB活化

将LX-2细胞在无血清培养基中孵育，然后暴露于AB，无论是否预先与CAPE（1ng/ml，14小时）、LY294002（600 nM，1小时）、AG490（50μM，1小时）或罗布麻素（100μM，1小时）预孵育。LX-2细胞吞噬AB可显著激活NF-κB（3.65±0.55倍），这可被CAPE、PI3K抑制所抑制，也可在较小程度上被JAK和NADPH氧化酶抑制所抑制。密度测定显示了3个实验的数据*p<0.005

AB吞噬诱导抗凋亡蛋白A1上调，A1表达抑制诱导HSC凋亡

NF-κB的主要靶点之一是Bcl-2家族成员A1，已知其在HSC生存中起主要作用(4). 因此，下一个问题是A1在吞噬作用后是否上调。我们对在AG 490和LY294002存在或不存在的情况下培养的吞噬HSC的细胞溶胶进行了western blot分析。我们发现A1在AB以PI3K依赖性方式吞噬后确实上调(图7A、B). 为了研究A1的抑制是否会诱导吞噬HSC的凋亡，将打乱的siRNA或siRNA转染至A1细胞。蛋白印迹分析证实A1表达(图7C). 在基线水平（HSC暴露于AB），A1抑制后细胞凋亡增加，表明A1是HSC中一种重要的抗凋亡蛋白(图7D). 在用FasL和环己酰亚胺处理吞噬HSC后，A1抑制甚至在吞噬细胞中也会导致凋亡显著增加。这些数据表明，A1表达是吞噬作用后HSC诱导的主要生存途径之一。

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A1在吞噬肝星状细胞中被诱导表达

（A）LX-2细胞在有或无LY294002或AG490的情况下暴露于AB。Western blot分析抗凋亡蛋白A1的表达。（B）定量密度分析表明，AB的吞噬作用上调了A1的表达（1.7±0.2倍），这是通过阻断PI3K活性而被抑制的。然而，抑制JAK通路对A1表达N=4的影响不大，*p<0.05。为了研究A1的抗凋亡作用，将A1 siRNA（30 nM）转染原代大鼠HSC并暴露于AB。（C）Western blot分析显示小干扰RNA抑制A1表达。（D）在存在或不存在FasL和环己酰亚胺的情况下，用加扰（Scr）或A1 siRNA（A1si）转染原代HSC，暴露于AB。Caspase-3/DAPI染色评估细胞凋亡。Scr+AB组细胞凋亡率为（14.1%±0.8）。FasL和CHX使其增加（29.6%±1.2）。A1 siRNA转染在基线（仅AB暴露细胞）和FasL/CHX治疗后诱导较高的凋亡率（42.1%±0.7）。平均值±SED，N=4，*p<0.001，**p<0.005。

讨论

肝损伤期间HSC的存活是肝纤维化传播的重要因素。然而，维持HSC活跃人群的确切机制尚不清楚。我们的研究描述了一种新的机制，将慢性肝损伤与导致的肝细胞凋亡、AB吞噬和HSC生存信号诱导联系起来。

组织损伤部位存在足够数量的吞噬细胞对维持体内平衡至关重要，首先是通过清除凋亡碎片和/或病原体，其次是通过产生抗炎细胞因子，如TGF-β。先前证实专业巨噬细胞吞噬AB存活(32,33)起到消炎的作用。我们发现吞噬HSC可增加TGF-β的产生(15). 由于HSC清除AB会导致其活化并随后产生ECM成分，因此我们必须确定吞噬HSC的命运。在我们的研究中，我们已经表明，在吞噬HSC的过程中，有不同的抗凋亡途径诱导，包括JAK1/STAT3依赖性途径和NADPH氧化酶依赖性PI3K/Akt/NF-κB诱导途径。ROS在特定情况下被描述为促凋亡(34,35)也有抗凋亡作用(7,8). 引起这一争议的原因是，活性氧的影响在很大程度上取决于细胞的氧化还原条件、抗氧化剂的浓度和可用性、活性氧产生的来源、数量和时间进程(36). ROS在特定环境下可作为第二信使，在不同细胞类型中诱导抗凋亡途径(8,37). 控制这些反应的信号通路才刚刚开始出现，包括PI3K/Akt介导的通路和NF-κB的激活(37). PI3K是NADPH氧化酶复合体的重要调节元件，在中性粒细胞超氧化物生成的调节中起作用(38). 吞噬作用诱导的PI3K激活导致Akt磷酸化在几项研究中得到证实(33,38,39). Akt在包括HSC在内的多种细胞类型中是一个关键的生存信号因子(17). 在HSC中，瘦素保护细胞免受环己酰亚胺或TRAIL诱导的凋亡通过Akt磷酸化(40,41). 已知ROS暴露可诱导Akt依赖性生存途径(22,37,42). 在Wang等人的研究中，氧化应激诱导的PI3K/Akt通路激活是细胞存活和抑制多种细胞类型中PI3K诱导的凋亡所必需的(43). 与此相一致，我们发现PI3K依赖性Akt磷酸化伴随AB的吞噬作用，并且抑制此途径可诱导HSC的凋亡。用罗布麻素抑制NADPH氧化酶降低了Akt的磷酸化，表明NADPH氧化酶的激活先于Akt的磷酸化。由于NF-κB是激活的HSC中一种有效的促生存转录因子(30,44-46)，其抑制作用可导致活化的HSC凋亡(4)接下来，我们测试AB的吞噬是否诱导NF-κB活化。吞噬作用诱导NF-κB的显著激活，这是PI3K/Akt依赖性的，并被HSC中的载脂蛋白部分抑制，表明NADPH氧化酶衍生的ROS在其激活中起作用。为了进一步阐明NF-κB的可能靶点，我们发现A1，一个抗凋亡的Bcl-2家族成员，在吞噬作用时上调，这被PI3K抑制剂抑制。吞噬后活化巨噬细胞的存活需要NF-κB介导的A1上调(47)也是活化HSC生存的关键(4). 为了评估A1表达是否确实是吞噬作用后HSC存活的主要机制，A1表达被siRNA方法抑制。这导致吞噬细胞的凋亡显著增加，表明A1是一种关键的抗凋亡蛋白。

我们还描述了吞噬HSC时JAK/STAT介导的生存途径的激活。STAT3被认为是多种抗凋亡途径的核心(26,48). 通过反义策略消除STAT3激活增加了头颈部肿瘤中肿瘤细胞的凋亡并降低了Bcl-xL的表达(49)而在另一项研究中，表达截短的抑制型STAT3诱导黑色素瘤细胞死亡(50). 在我们的研究中，我们发现吞噬作用后，STAT3被磷酸化并转移到细胞核，这些事件通过阻断JAK1活性而被抑制。STAT3的靶点之一是Mcl-1，它属于抗凋亡蛋白Bcl-2家族，有助于控制线粒体完整性，而线粒体完整性对维持细胞活力至关重要(51). 我们发现，在吞噬原发性HSC中的AB后，Mcl-1上调，而阻断JAK1可抑制这种上调。这种上调，尽管不如NF-κB/A1轴的激活显著，但也可能在吞噬后的细胞存活中发挥作用。STAT3的其他潜在靶点，如survivin(52,53)也可能诱导HSC存活。Survivin在不同的肝纤维化模型中表达上调(54). 至于JAK1激活是如何在吞噬作用后发生的，尚不清楚。JAK可能激活通过吞噬诱导的整合素结合(55)或者，这可能是PI3K/JAK通路之间串扰的结果(56). 事实上，我们在研究中发现，抑制PI3K可能会影响JAK1和STAT3磷酸化。这种串扰已在其他实验模型中得到证实，尤其是涉及ROS介导的信号通路(57).

总之，这些研究揭示了HSC生存的新途径。我们已经证明，AB的吞噬作用在HSC中诱导不同的生存信号，导致NF-κB和A1激活/上调，并在较小程度上诱导Mcl-1。由于活化HSC的存活、吞噬有助于肝纤维化的传播，针对这些途径的治疗策略可能有助于诱导活化HSC凋亡，从而逆转纤维化。

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HSC吞噬AB诱导不同的生存途径

AB的吞噬诱导JAK1/STAT3介导的生存途径，导致Mcl-1的上调。吞噬作用也诱导Akt磷酸化通过PI3K，这有助于NF-κB的激活。因此，A1抗凋亡蛋白在吞噬HSC时以PI3K依赖的方式上调。

致谢

本研究得到了NIH DK069765（NJT）和加州大学戴维斯分校健康系统奖（NJT）的支持。

缩写

HSC公司
肝星状细胞
转化生长因子-β1
转化生长因子-β1
AB公司
凋亡小体
ASMA公司
α-平滑肌肌动蛋白
NADPH氧化酶
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原氧化酶
TAMRA公司
羧基四甲基罗丹明琥珀酰酯

脚注

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