互补DNA链特异性测序的转录组分析

RNA分离

酵母菌株BY4741（MATa；his3Δ1；leu2Δ0；达到15Δ0；ura3Δ0)在30°C的富培养基（YPD；BD公司）中培养过夜，稀释至OD₆₀₀0.15，生长至OD₆₀₀0.87。细胞在室温下通过离心收集，用1×PBS洗涤一次，并在液氮中冷冻。使用RiboPure提取总RNA^TM（TM）-酵母试剂盒（Ambion），并使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技）进行分析。

解剖两只11周龄雌性C57Bl/6J小鼠，取其全脑进行RNA制备。使用Trizol方法提取总RNA。

聚A⁺RNA纯化

聚A⁺按照制造商的说明，使用Dynabeads mRNA纯化试剂盒（Invitrogen）纯化RNA，并在37°C下用每1μg RNA 0.2单位的TURBO™DNA酶（Ambion）处理30分钟。

第一链合成（FSS）

通过混合0.5μg聚A制备FSS反应⁺RNA，40纳克（dN）₆在8.5μl 1×逆转录缓冲液（Invitrogen）、0.5 mM dNTPs、5 mM MgCl中的引物（Invitro）和25 pmol寡核苷酸（dT）引物（Initro）₂和10 mM DTT。将混合物在98°C下孵育1分钟以熔化RNA二级结构，然后在70°C下孵育5分钟，并以0.1°C/s的速度冷却至15°C。使用慢速冷却使二级RNA结构和引物的退火尽可能重复。在15℃下，向反应中添加0.5μl放线菌素D溶液（120 ng/μl）、0.5μl RNase OUT（40单位/μl，Invitrogen）和0.5μl SuperScript III聚合酶（200单位/μl，Invit罗gen）。作为酶存活、引物稳定性和RNA二级结构变性之间的折衷，逆转录反应的温度逐渐升高：以0.1°C/s从15℃加热到25℃；25°C孵育10分钟；以0.1°C/s从25°C加热至42°C；42°C孵育45分钟；以0.1°C/s从42°C加热至50°C；在50°C下培养25分钟。SuperScript III聚合酶最终在75°C下灭活15分钟。

dNTP的移除

将EB（20μl）（10 mM Tris–Cl，pH 8.5，Qiagen）添加到反应中。通过在自制的200μl G-50凝胶过滤旋-柱上纯化第一链混合物，去除dNTP，旋-柱与1 mM Tris–Cl，pH 7.0平衡。

第二链合成（SSS）

由于将Invitrogen试剂盒用于SSS，因此必须在凝胶过滤后恢复FSS缓冲液。向纯化的FSS反应中添加水，使最终体积达到52.5μl。混合物在冰上冷却。然后，22.5μl“第二链混合物”[1μl 10×逆转录缓冲液（Invitrogen）；0.5μl 100 mM MgCl₂; 1μl 0.1 M DTT；2μl 10 mM每种混合物：dATP、dGTP、dCTP、dUTP；15μl 5×SSS缓冲液（Invitrogen）；0.5微升大肠杆菌连接酶（10单位/μl，NEB）；2μl DNA聚合酶I（10单位/μl，NEB）；添加0.5μl RNase H（2单位/μl，Invitrogen）]。SSS反应在16°C下培养2 h。根据制造商的说明，在QIAquick柱（Qiagen）上纯化ds cDNA。

DNA片段化

在以下条件下，用UTR200（Hielscher Ultrasonics GmbH，Germany）在1小时、50%脉冲、100%功率和通过0°C水流连续冷却的条件下进行超声处理，将约250 ng的ds cDNA片段化。

Illumina测序平台文库的准备

如前所述，使用DNA样本试剂盒（#FC-102-1002，Illumina）制备文库(4)，但进行了以下修改：在文库扩增之前，在37°C下，在5μl 1×TE缓冲液（pH 7.5）中用1单位尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG；Applied Biosystems）进行尿苷消化15分钟。

配对测序文库的制备程序与单读文库的相同，只是使用了不同的连接适配器和PCR引物（#PE-102-1002，Illumina）。

排序

将扩增后的材料以4 pM的浓度加载到流动细胞上。根据制造商的说明，通过运行36个循环，在Illumina 1G基因组分析仪上进行测序。

数据分析

我们开发的序列分析管道的流程图如所示补充图7.

如前所述进行图像去卷积、质量值计算以及外显子读数和外显子连接的映射(4). 排序读取与小家鼠（UCSC mm9）或酿酒酵母（UCSC sacCer1）基因组使用Eland软件的修改（Gerald模块v.1.27，Illumina）。Eland的定位标准如下：测序读数应与基因组唯一匹配，最多允许两次失配，无插入或缺失。我们对Eland过程进行了以下递归修改：对前32个bp的读取（由于Eland限制，对36个bp读取中的最后4个bp进行了调整）进行了校准，然后根据Eland标准将不匹配的读取调整为31个bp，然后再次进行校准。这种不匹配读取的3′端修剪是递归进行的，长度为25 bp。这种修改的程序通常会将唯一对齐的片段数量增加20–50%，因为根据Eland标准阻止成功对齐的测序错误大多位于读取的末尾，并且这些错误会逐渐消除。在这些条件下，～60%的读取结果与参考基因组上的独特位置相匹配，而～25%的读取结果映射到多个基因组位置，～15%的读取结果没有映射到任何位置。

映射结束标记

使用带有1–11 nt长前导寡核苷酸（dT）延伸的未映射测序读取来绘制3′-基因边界。去掉了前导寡核苷酸（dT）片段，剩下的片段在参考基因组上对齐。

重复区域

Eland程序并没有对一个基因组进行多次点击来绘制读取图。因此，没有测序读数被映射到重复基因组区域。为了在基因组浏览器中可视化与重复相关的缺口，进行了以下模拟。将整个参考基因组切成30 bp长的片段，其中小鼠有10 bp重叠，酵母有1 bp重叠。这些片段使用标准Eland设置与参考序列对齐。然后，大约80%的老鼠读数和90%的酵母读数被唯一对齐。其余产生多次点击的读取结果在基因组浏览器中以灰色条显示，表示重复的基因组区域，在这些区域中，一般的表达水平无法明确解决。

方法的重现性

为了证明含有脱氧尿苷的SSS不会干扰转录环境，我们使用相同的RNA样本进行了链特异性和非链特异性转录组测序。生成的散点图(图1B） 表明RNA-Seq和ssRNA-Seq协议产生相同的转录模式。

RNA-Seq方法在不同实验室获得的生物复制品和结果中具有高度的重复性。小鼠全脑独立分析的相关系数(图1C） 和酿酒酵母(补充图2)转录组在0.98～0.99之间。我们的数据也与之前公布的RNA-Seq结果（8；图1D） ●●●●。

ssRNA-Seq协议为识别转录极性提供了高度确定性。理论上，测序文库分子中的一个尿苷碱基足以阻止从假链中读取测序。即使UNG偶尔不去除尿苷碱，该分子仍不会被扩增，因为含有尿苷的模板强烈抑制用于文库扩增的融合DNA聚合酶(14). 显然，文库中大多数第二条cDNA链包含不止一个尿苷碱，因为SSS反应中75%/25%dUTP/dTTP混合物的结果与100%dUTP基本相同(补充图3).

防止虚假的第二链cDNA合成，这被证明是人工反义转录物的主要来源(15)，我们在反转录反应中加入了放线菌素D。放线菌素D特异性抑制依赖于DNA但不依赖于RNA的DNA合成(16). 在我们手中，反应中放线菌素D的存在并没有显著影响反义转录水平(补充图4). 然而，我们在方案中使用了放线菌素D，以确保反应的重现性。

为了说明ssRNA-Seq方法，我们在这里介绍了酵母和整个小鼠大脑的转录组分析。所有测序数据均提交至NCBI短读档案（提交SRP000667）。分析结果可在线获取，网址为http://genseq.molgen.mpg.de/ssRNA/。我们设计了一个特殊的基因组浏览器，用于可视化测序数据(补充图5). 浏览器显示注释基因、映射读数、重复基因组区域、读数与参考序列之间的不匹配、末端标签和剪接连接。映射读取可以从全染色体到单核苷酸分辨率水平进行查看。序列统计数据反映了总读取次数、唯一和多匹配读取次数、结束标签和拼接接头，如所示补充表1.

基因表达水平

忽略转录的方向会导致对逆转录水平与正向转录水平相当的基因的表达水平的过高估计。表1提供了具有至少10个唯一映射读取的基因反义转录水平的ssRNA-Seq数据。对于～10%的小鼠和～15%的酵母基因，与忽略转录方向相关的错误高于30%。

有关转录定向的信息有助于确定重叠转录物的正确表达水平，两者都有注释(补充图6A、B、D和E)和新颖图1G,补充图6C它对原核生物和低等真核生物的小基因组尤其重要。这个酿酒酵母转录组要比老鼠的转录组紧凑得多，基因数量少4倍，基因组小200倍。累计转录图图2表明邻近基因位于很近的地方。根据我们的结果，36%的病例酿酒酵母基因之间没有间隙(图3). 大约三分之二的重叠方向相反，因此可以通过ssRNA-seq解决。

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图2。

小鼠和酵母基因5′和3′区域的转录累积图谱（蓝色：有义，粉红色：反义）和有义方向的末端标记（红色）。X（X）-轴：相对于基因5′端（左面板）或3′端（右面板）的位置；Y（Y）-axis：在此位置映射的排序读取或结束标记的总数。

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图3。

酵母中不同类型的基因间区域。堆叠柱显示了根据相邻基因的方向和相对位置标注的7103个基因间区域的分布。如果不可能在相邻基因之间找到30 nt的“间隙”（测序读数未涵盖的间隔），则将其视为重叠。转录起始比转录终止需要更多的空间：基因往往在尾巴到尾巴的方向上比在头到头的方向上更接近。ORF之间的平均距离为375 bp（尾对尾）、590 bp（头对尾）和703 bp（头对头）。约49%的3′末端（尾部）与相邻基因重叠。这大约是重叠5′端（封头）比例的两倍，即24%。

基因结构

当缺乏转录极性知识可能导致误解时，ssRNA-Seq是不可或缺的。目前转录组的注释还远未完成。在确定基因和外显子边界时有很多错误-图1G、(补充图6A、B、D、E和F). 此外，还有许多未知基因(图1G、，补充图6C和H)和外显子(补充图6F和G).

在之前的一项研究中，约有400个新的酵母转录物被鉴定出来，但没有考虑RNA的方向(6). 应用一种简单的算法计算我们数据中的类基因转录区，我们发现相同数量（377）的新转录区。为了粗略估计由于可用的极性信息，这个数字可能会如何变化，搜索了两次（针对正向映射的读取，然后针对反向映射的读取），得到了大约三倍的新候选基因（549个正向和512个反向）。

通过RNA-Seq程序，可以使用与基因3′-边界重叠的测序读数来确定基因的3′-界限(6). 只有在去除寡核苷酸（dT）尾部后，这些读数才能映射到参考基因组。与RNA-Seq协议相比，ssRNA-Seq协议具有降低噪声的优势，因为只允许同聚物拉伸的一个方向。映射的结束标签显示在在线基因组浏览器中(补充图5).

分析转录组中末端标记的分布很有趣。注释小鼠和酵母基因的5′-和3′-区域中的累积末端标记谱如所示图2。鼠标结束标记分组在3′-区域的窄峰中。酵母末端标记分为两个宽峰，靠近3′端和5′端。这些峰比小鼠中的峰宽，因为基因是使用ORF的边界比对的，而不是通过小鼠累积图谱的转录物边界比对。大量末端标签位于启动子附近，这可能反映了一种新的转录调控机制。需要额外的分析来证明这个假设。类似（但不太明显）的末端标记峰出现在小鼠累积曲线上的启动子附近。

小鼠末端标签也与内部外显子的3′-边密切相关(图4)显示了先前报道的聚腺苷化和剪接之间的动态相互作用(17).

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图4。

小鼠（左）和酵母（右）内显子3′区转录和感觉末端标签的累积图谱。